깨지기 쉬운 X 정신 지체-1 유전자에서 시토신 구아닌-구아닌 트리뉴클레오티드 반복을 정량화하기 위한 견고한 폴리머라제 연쇄 반응 기반 분석

요약

연약한 X 정신 지체-1 유전자에서 시토신 구아닌-구아닌 트리뉴클레오티드 반복을 정량화하기 위한 정확하고 견고한 중합효소 연쇄 반응 기반 분석은 깨지기 쉬운 X 증후군 및 연약한 X 증후군및 연약한 X 관련의 분자 진단 및 스크리닝을 용이하게 합니다. 턴라운드 시간이 짧고 장비에 대한 투자가 부족합니다.

초록

깨지기 쉬운 X 증후군(FXS) 및 관련 장애는 연약한 X 정신지체-1(FMR1)유전자 프로모터의 5' 번역되지 않은 영역(UTR)에서 시토신 구아닌(CGG) 삼뉴클레오티드 반복의 확장에 의해 유발된다. 종래에는 유전분석기의 모세관 전기동공단편 분석이 FMR1의CGG 반복의 크기 조정에 사용되지만, 반복 횟수가 200개 이상일 때 정확한 측정을 위해 추가적인 남부 얼룩 분석이 요구된다. 여기서, 우리는 FMR1의CGG 반복의 정량화를 위한 정확하고 견고한 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기반 방법을 제시한다. 이 시험의 첫 번째 단계는 깨지기 쉬운 X PCR 키트를 사용하여 FMR1 프로모터의 5'UTR에서 반복 서열을 증폭한 다음, PCR 제품의 정제 및 미세 유체 모세관 전기 동공 계측기의 단편 크기 조정, 및 분석 소프트웨어를 사용하여 알려진 반복으로 표준을 참조하여 CGG 반복 횟수를 후속 해석합니다. 이러한 PCR 기반 분석법들은 재현가능하고 200개 이상의 반복 횟수(전체 돌연변이로 분류됨), 55~200(전분), 46~54(중간), 및 10을 포함하는 FMR1 프로모터의 전체 범위의 CGG 반복을 식별할 수 있다. 45 (정상). 그것은 견고성과 빠른보고 시간으로 FXS 및 깨지기 쉬운 X 관련 장애의 분류를 용이하게하는 비용 효율적인 방법입니다.

서문

깨지기 쉬운 X 증후군 (FXS) 및 깨지기 쉬운 X 관련 무질서, 예를 들면, 전율 및 운동 실조 증후군 (FX-TAS), 및 1 차적인 난소 불충분 (FX-POI)는 주로 5'번역되지 않은 에 있는 cytosine 구아닌 구아닌 (CGG) trinucleotide 반복 확장에 기인합니다 Xq27.3^1,2에깨지기 쉬운 X 정신 지체-1(FMR1)유전자의 영역 (UTR) FMR1 인코딩 단백질 (FMRP)은 mRNA의 대체 접합, 안정성 및 수지상 수송을 조절하여 신경 발달 및 시냅스 가소성에서 작동하는 폴리리보솜 관련 RNA 결합 단백질 또는 변조 합성입니다. 부분 적인 후두 단백질^{의 3,}4 ,^5,6,7.

>200의 CGG 반복 크기를 가진 동적 변이는 전체 돌연변이로 설명되며, 이는 FMR1 프로모터^8의비정상적인 하이퍼메틸화 및 후속 전사 침묵을 유도한다. FMRP 단백질의 부재 또는 부족은 정상적인 신경 발달을 방해하고 FXS^9를일으키며, 중등도에서 중증의 지적 장애, 발달 지연, 비활동성 행동, 가난한 접촉과 자폐증 표현^10,11,12. 여성 FXS 환자에 있는 프리젠테이션은 일반적으로 남성에서 보다는 온화합니다. CGG 반복 크기는 각각 55에서 200 및 45~54에 이르는 선열 상태와 중간 상태로 분류됩니다. 높은 수준의 불안정성으로 인해, CGG 반복 크기는 부모로부터 자손^13,14로전염될 때 아마도 확장될 것이다. 따라서, 전열 대말기를 가진 운반대는 반복 적인 팽창 때문에 FXS에 영향을 받은 아이들이 있는 의 고위험에 이고, 어떤 경우에는, 중간 대두는 2 세대^15에걸쳐 전체 돌연변이 범위로 그들의 반복 크기를 확장할 수 있습니다^{15, 16}. 또한, 전열을 가진 남성은 또한 FX-TAS와 FX-POI²⁰둘 다에 걸리기 위하여 전열 암컷이 걸리기 동안, 늦은 개시 FX-TAS^17,18,19,개발의 증가한 리스크를전달합니다, ^21,22. 최근에는 발달 지연과 사회 행동의 문제가 있는 자폐 스펙트럼 장애가 FMR1 대립유전자^{전형인 어린이(23,24)에서}제시되는 것으로 보고되고 있다.

정확한 CGG 반복 크기를 결정하는 것은 FXS 및 깨지기 쉬운 X-관련^{장애(25,26)의}분류 및 예측에 큰 의미가 있다. 역사적으로, 단편 크기 조정을 더한 CGG 반복 영역 별 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 FMR1 CGG 반복^27의분자 프로파일링을 위한 금 본위제였다. 그러나, 전통적인 특이적 PCR은 100 개 이상의 130 회 이상의 반복을 가진 큰 전열에 덜 민감하고 전체 돌연변이^27,28을증폭시킬 수 없다. 또한, 반복 크기 조정을 위한 전통적인 유전자 분석기의 모세관 전기 동공은 200CGG 이상의 반복으로 FMR1 PCR 제품을 검출하지 못합니다. 남부 얼룩 분석은 정상에서 전체 돌연변이 반복 수에 이르기까지 더 넓은 범위의 반복 크기를 분화할 수 있게 해주며, 전체 돌연변이(남성에서) 전체 돌연변이를 확인하고 전체 돌연변이를 가진 헤테로지구스 알레를 분화하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 분명히 동형 접합 대말레는 정상 크기의 (여성에서). 그러나 반복을 정량화하기 위한 해상도는 제한적입니다. 더 중요한 것은 이 단계별 테스트 전략은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되며 비용이 비효율적이라는 것입니다.

여기서는 FMR1의CGG 반복을 정량화하기 위한 정확하고 견고한 PCR 기반 방법을 제시합니다. 이 시험의 첫 번째 단계는 깨지기 쉬운 X PCR 키트를 사용하여 FMR1 프로모터의 5'UTR에서 반복 서열의 PCR 증폭이다. PCR 제품은 정제되고 단편 크기 조정은 미세 유체 모세관 전기 동공 계측기에서 수행되며, 후속 해석 소프트웨어를 사용하여 CGG 반복 횟수를 해석하여 공지된 반복으로 표준을 참조하여 PCR 조각 길이가 CGG 반복 횟수에 정비례한다는 근거입니다. PCR 시스템은 고도로 풍부한 삼뉴클레오티드 반복 영역의 증폭을 용이하게 하는 시약을 포함한다. 이러한 PCR 기반 분석은 재현가능하고 FMR1 프로모터의 모든 CGG 반복을 식별할 수 있다. 이것은 FXS 및 깨지기 쉬운 X 관련 장애의 분자 진단 및 스크리닝에서 광범위한 응용 을 찾을 수있는 비용 효율적인 방법이며, 따라서 장비에 대한 턴어라운드 시간과 투자가 적어 광범위한 임상 스펙트럼에서 활용 될 수 있습니다. 실험실.

프로토콜

홍콩 공동 중국대학-신계 동쪽 클러스터 임상 연구 윤리위원회(참조 번호: 2013.055)

1. PCR 증폭

1. 시작하기 전에 PCR 완충제 혼합물, 시료 희석제 및 DNA 샘플(검사 및 참조 DNA 모두)을-20°C 냉동고에서 제거하고 모든 시약과 DNA가 완전히 해동되었는지 확인하기 위해 실온에서 20-30분 동안 보관하십시오. 소용돌이와 사용하기 전에 잠시 아래로 돌루.
2. 분광광도계를 사용하여 DNA 샘플의 농도를 측정합니다(재료 표참조). DNA 농도는 25 ng/μL이어야 합니다. 필요한 경우 적절한 농도로 희석된 시료로 희석하십시오.
   참고: DNA는 단백질과 높은 염분 농도와 같은 방해 물질을 제거하기 위해 추출되고 정제되어야합니다. 비 분해, 고품질 DNA는 후속 PCR 증폭 및 분석에 사용되어야한다 (A260 / A280 : 1.8-2.0 및 A260 / A230 : >1.0).
3. 참조 및 테스트 된 DNA 샘플을 식별하기 위해 PCR 플레이트 또는 0.2 mL PCR 튜브의 우물을 라벨.
4. 테스트 샘플, 2개의 참조 샘플 및 음성 대조군 샘플에 필요한 PCR 반응 수를 계산합니다. PCR 완충혼합 15 μL, 희석제 시료 2.6μL, 각 반응에 대해 0.4 μL의 폴리머라제를 첨가하여 PCR 마스터 믹스를 준비합니다.
   참고: 샘플 희석제를 사용한 음성 제어는 PCR 성능을 모니터링하는 데 필수적입니다. 실온에서 PCR 마스터 믹스를 준비하고 얼음에 파이펫을 하지 마십시오. PCR 버퍼 믹스는 점성이 있습니다. 튜브를 섞은 다음 사용하기 전에 잠시 회전시면 됩니다.
5. 10~20초 동안 1.4단계에서 PCR 마스터 믹스를 소용돌이로 돌리고 스핀다운합니다. 혼합물의 18 μL을 각 우물 또는 튜브에 천천히 분배합니다.
6. 소용돌이와 DNA 샘플을 스핀 다운. 각 DNA의 피펫 2 μL을 20 μL의 최종 PCR 부피에 대해 적절한 웰 또는 튜브내로 내보펫을 5회 위아래로 피펫팅하여 혼합한다.
   참고: 반응 당 DNA의 총 량은 50-100 ng이어야한다. 20 μL PCR 반응당 150 ng를 초과하는 DNA 양은 큰 반복 대말기의 불량한 증폭을 초래할 수 있다. 더 낮은 농축 DDNA의 경우, PCR 마스터 믹스에서 희석제 샘플의 양은 DNA 용액으로 대체될 수 있다.
7. 접착제 플레이트 실러 또는 튜브 캡으로 플레이트를 밀봉하십시오.
8. 밀봉된 PCR 플레이트 또는 튜브를 열 식 뚜껑이 있는 열 사이클러에 놓습니다. 다음 설정으로 프로그램을 실행: 95 °C 에 대 한 5 분, 다음 25 35 s에 대 한 98 °C에서 변성의 사이클, 59 °C에서 어닐링 35 s, 그리고 확장 72 °C에 대 한 4 분; 최종 단계는 72°C에서 10분 동안. 추가 처리를 위해 제거될 때까지 사이클러에서 4°C에서 PCR 제품을 유지한다.
9. PCR 증폭 후 제품을 즉시 정화 및 분석하거나 +2 ~8°C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 대안적으로, 생성물은 -30 ~ -16°C에서 최대 30일 동안 보관될 수 있다.

2. PCR 제품의 정화

1. 인큐베이터 셰이커를 65°C로 예열합니다.
2. 각 PCR 반응에 대해 섹션 1에서 각 PCR 제품의 20 μL에 1x TE 버퍼 80 μL(재료 표참조)을 추가합니다.
3. 다중 채널 파이펫을 사용하여 샘플 혼합물을 PCR 정화 플레이트(재료 표참조)로 옮니다.
4. 접시를 덮지 않은 상태로 유지하고 인큐베이터 셰이커에 넣고 10 분 동안 1,200 rpm에서 흔들면서 65 °C에서 배양하십시오.
5. 배양 후 진공 계측기를 250 mbar(또는 25kPa, 188 mmHg, 7.4 hg)로 설정하고 필터를 통해 용액을 15분 동안 흡인합니다.
6. 인큐베이터 셰이커를 25°C로 식힙니다.
7. 첫 번째 포인포인 후, 진공을 끄고 각 우물에 50 μL의 1x TE 버퍼를 추가합니다. 섞지 마십시오. 2.5단계에서 진공 설정을 사용하여 10분 동안 용액을 흡인합니다.
8. 종이 타월 더미에 단단히 눌러 필터 플레이트의 바닥을 건조.
9. 각 우물의 하단 중앙에 20 μL의 1x TE 버퍼를 추가합니다. 접시를 인큐베이터 셰이커에 놓고 25°C에서 배양하고 1,200 rpm에서 5분 동안 흔들어 줍니다.
10. 배양 후, 2.9단계에서 부터 신선한 96웰 PCR 플레이트까지 각 정제된 PCR DNA의 >15 μL을 전달한다. 정제된 DNA는 직접 분석될 수 있거나, 대안적으로 필요할 때까지 -30~ -16°C에서 저장될 수 있다.

3. PCR 제품의 조각 크기 조정

1. 시작하기 전에 DNA 염료 농축물, DNA 젤 매트릭스, DNA 마커, DNA 사다리 및 정제된 DNA 샘플을 2단계에서 30분 동안 실온까지 평형화하도록 허용합니다.
2. 프라이밍 스테이션을 설정합니다.
   1. 새로운 시약 배치를 사용할 때 주사기 교체(재료 표참조).
   2. 베이스 플레이트를 조정하고 주사기 클립의 레버를 놓고 위쪽 위치로 밉합니다.
3. 크기 조정 소프트웨어(재료 표참조)를 시작하고 젤 염료 믹스를 준비합니다.
4. 소용돌이 염료 농축액은 10s를 농축하고 스핀 다운하십시오. 겔 매트릭스 바이알에 염료 25 μL을 첨가합니다. 혼합 용액을 잘 소용돌이시키고 스핀 다운하십시오.
   1. 젤 염료 믹스를 스핀 필터로 옮김. 스핀 필터를 미세 원심분리기에 놓고 실온에서 1,500 x g ± 20 %에서 10 분 동안 돌습니다.
      참고: 염료로 용액을 빛으로부터 보호하고 사용 후 4°C에서 보관하십시오. 겔-염료 혼합물은 일단 제조되면 약 15개의 칩에 사용될 수 있다. 젤 염료 혼합물을 사용하기 전에 매번 30분 동안 실온에 평형화시키도록 하십시오.
5. 젤 염료 믹스를 로드합니다.
   1. 프라이밍 스테이션에 새 DNA 칩을 삽입합니다. 9 μL의 젤 염료 믹스를 "G"로 표시된 우물에 넣습니다. 플런저를 1mL 마크에 배치한 다음 프라이밍 스테이션을 닫으십시오.
   2. 클립이 잡히지 때까지 주사기 플런저를 아래로 누릅니다. 정확히 30s 를 기다린 다음 클립을 놓습니다. 5s를 기다린 다음 플런저를 1mL 위치로 천천히 당깁니다.
   3. 프라이밍 스테이션을 열고 "G"로 표시된 우물에 9 μL의 젤 염료 믹스를 추가합니다.
6. 사다리 기호로 표시된 우물에 마커 5 μL을 추가하고 12개의 샘플 웰 각각에 5 μL의 마커를 추가합니다. 우물을 비워 두지 마십시오.
7. DNA 사다리 1 μL을 사다리 기호로 표시된 우물에 넣습니다. 3.1단계에서 PCR 제품(사용된 우물)의 1 μL또는 1μL의 초순수(사용되지 않은 우물)를 각각 12개의 샘플 웰에 추가합니다. 칩을 와류 믹서와 와류의 어댑터에 수평으로 넣고 표시된 설정(2,400rpm)에서 1분 동안 사용합니다.
8. 바이오 분석기 계측기에 칩을 삽입하고 5분 이내에 기기에서 칩을 실행합니다.
9. 분석이 완료된 후, 즉시 기기에서 사용된 칩을 제거합니다.
10. 350 μL의 탈이온수를 전극 클리너의 우물 중 하나에 천천히 추가합니다. 바이오 분석기의 뚜껑을 열고 전극 클리너를 넣습니다. 뚜껑을 닫고 약 10s. 뚜껑을 열고 전극 클리너를 제거합니다. 전극의 물이 증발할 수 있도록 10s를 더 기다렸다가 뚜껑을 닫습니다.

4. 조각 크기 조정 결과 분석

참고: 기준 샘플은 알 수 없는 샘플과 동일한 배치에서 동일한 열 사이클러 및 바이오 분석기로 증폭 및 분석되어야 합니다.

1. 바이오 분석기 실행이 완료되면 각 실행의 피크 데이터를 후속 분석을 위해 .csv 테이블 파일로 내보냅니다.
2. 분석 소프트웨어를 시작하고 4.1단계에서 내보낸 .csv 피크 테이블 파일을 엽니다.
3. QC 메뉴 탭을 통해 두 참조 샘플에서 4개 점(플롯에 파란색 다이아몬드로 표시)에 장착된 회귀 선을 검토합니다. 회귀 선의^R2 값은 >0.98이어야 합니다(일반적인 값은 0.999를 초과함).
4. 결과 메뉴 탭을 통해 참조 샘플에서 파생된 선형 회귀 표준 곡선에 대해 조각 길이가 자동으로 플롯되는 각 샘플의 반복 크기를 확인합니다. 이 소프트웨어는 또한 다른 지침에 따라 각 샘플의 분류를 제공합니다.
5. 내보내기 메뉴 탭을 통해 반복 번호 및 진단 분류가 있는 각 샘플에 대한 결과 보고서와 각 실행에 대한 샘플 정보 및 QC 보고서의 요약을 내보냅니다.
   참고: 분석 소프트웨어는 의학 유전학의 미국 대학 (ACMG) 또는 임상 분자 유전학 사회 / 인간 유전학의 유럽 사회 (CMGS / ESHG) 지침뿐만 아니라 미리 정의 된 분류와 같은 사용자 정의 분류 가이드 라인의 사용을 허용 기준.

결과

상기 전돌연변이 암 기준 샘플(NA20240, 30 및 80의 반복 크기)과 전체 돌연변이 암 기준 샘플(NA20239, 20 및 200의 반복 크기)의 크기 조정 결과는 각각 도 1A 및 도 1B에나타내고 있다. 전형적으로, 2개의 마커 피크(하부 마커 50 염기 쌍 [bp] 및 상부 마커 10,380 bp)는 단편 크기 프로파일에 포함된다. 일반적으로 거의 95 bp의 크기와 프라이머 복잡한 피크가있다. 참?...

토론

FXS는 삼중 21 후 지적 장애의 두 번째 가장 흔한 원인이며, X 연결 정신 지체^30의거의 절반을 차지하며, 이는 4,000명의 남성중 약 1명, 8,000명의 여성 중 1명에 영향을 미칠 수 있습니다. 더 중요한 것은, 250-1,000명의 암컷에 있는 거의 1은 premutation를 전송하고, 이 주파수는 남성^{26,31,32,33에서}

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes	Axygen	PCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-free	Ambion	AM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument	Agilent	G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate	Thermo Fisher	AB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge	Agilent		Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer	Agilent		Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software	Agilent		Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips	Agilent		Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent DNA 7500 kit	Agilent	5067-1506	For Fragment sizing
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap)	Agilent		In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap)	Agilent		In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chips	Agilent		In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap)	Agilent		In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap)	Agilent		In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner	Agilent		In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter	Agilent		Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Syringe	Agilent		Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Chip priming station	Agilent	5065-4401	Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Cubee Mini-centrifuge	GeneReach	aqbd-i
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold	Merck Millipore	MSVMHTS00	Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper	Merck Millipore	XX2004718	Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump	Merck Millipore	WP6122050	Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel	Merck Millipore	XX1004705	Filter plate vacuum Manifold
FragilEase Fragile X PCR kit	PerkinElmer	3101-0010	For PCR amplification
FragilEase Fragile X PCR kit: Sample Diluent	PerkinElmer		In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )
FragilEase PCR Buffer mix	PerkinElmer		In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward) FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse)
FragilEase Polymerase	PerkinElmer		In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )
FraXsoft analysis software	PerkinElmer
NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher
Paper towels
PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plate	MACHEREY-NAGEL	743100
reference DNA sample	Coriell	NA20240 & NA20239
S1000 96-well Thermal Cycler	Bio-Rad	1852196	This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti™ 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786)
TriNEST Incubator/Shaker instrument	PerkinElmer	1296-0050
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Life Technologies	10977015	For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0256 (Model G560E)	Conventional vortex mixer