Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Un ensayo preciso y robusto basado en la reacción en cadena de la polimerasa para cuantificar las repeticiones de trinucleótido de citosina-guanina-guanina en el gen frágil X de retraso mental-1 facilita el diagnóstico molecular y el cribado del síndrome de X frágil y las repeticiones X frágiles trastornos con menor tiempo de respuesta e inversión en equipos.

Resumen

El síndrome X frágil (FXS) y los trastornos asociados son causados por la expansión de la repetición de trinucleótido de citosina-guanina-guanina (CGG) en la región no traducida (UTR) de 5' del promotor del gen Frágil X de retardación mental-1 (FMR1). Convencionalmente, el análisis de fragmentos de electroforesis capilar en un analizador genético se utiliza para el dimensionamiento de las repeticiones CGG de FMR1,pero se requiere un análisis adicional de la mancha sureña para la medición exacta cuando el número de repetición es superior a 200. Aquí, presentamos un método preciso y robusto basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la cuantificación de las repeticiones CGG de FMR1. El primer paso de esta prueba es la amplificación por PCR de las secuencias de repetición en el 5'UTR del promotor FMR1 utilizando un kit de PCR X Frágil, seguido de la purificación de los productos pcR y el tamaño de los fragmentos en un instrumento de electroforesis capilar microfluídica, y interpretación posterior del número de repeticiones de CGG haciendo referencia a normas con repeticiones conocidas utilizando el software de análisis. Este ensayo basado en PCR es reproducible y capaz de identificar toda la gama de repeticiones de CGG de los promotores de FMR1, incluidos aquellos con un número repetido de más de 200 (clasificados como mutación completa), 55 a 200 (premutación), 46 a 54 (intermedio) y 10 a 45 (normal). Es un método rentable que facilita la clasificación de los trastornos asociados al FXS y X frágiles con robustez y tiempo de notificación rápido.

Introducción

Los trastornos asociados al síndrome De X frágil (FXS) y X frágil, por ejemplo, el síndrome de temblor y ataxia (FX-TAS), y la insuficiencia ovárica primaria (FX-POI) son causados principalmente por la expansión de repetición de trinucleótidos de citosina-guanina-guanina (CGG) en los 5' no traducidos (UTR) del gen de retardo mental X frágil-1 (FMR1) en Xq27.31,2. La proteína codificada FMR1 (FMRP) es una proteína de unión al ARN asociada al polisistores que funciona en el desarrollo neuronal y la plasticidad sináptica regulando el empalme alternativo, la estabilidad y el transporte dendrítico de ARNm o síntesis moduladora de proteínas postsinápticas parciales3,4,5,6,7.

La variación dinámica con un tamaño de repetición CGG de >200 se describe como mutación completa, que induce la hipermetilación aberrante y el posterior silenciamiento transcripcional del promotor FMR1 8. La ausencia o falta resultante de la proteína FMRP interrumpe el desarrollo neuronal normal y causa FXS9,caracterizado por varios síntomas clínicos, incluyendo discapacidad intelectual moderada a grave, retraso del desarrollo, comportamientos hiperactivos, contactos pobres y manifestaciones autistas10,11,12. La presentación en pacientes con FXS femeninos es generalmente más leve que la de los hombres. El tamaño de repetición de CGG que oscila entre 55 y 200 y 45 a 54 se clasifican como premutación y estado intermedio, respectivamente. Debido al alto grado de inestabilidad, el tamaño de repetición CGG en una premutación o alelo intermedio presumiblemente se expande cuando se transmite de los padres a la descendencia13,14. Por lo tanto, los portadores con alelos de premutación tienen un alto riesgo de tener niños afectados con FXS debido a la expansión repetida, y en algunos casos, los alelos intermedios pueden ampliar su tamaño de repetición a todo el rango de mutación durante dos generaciones15, 16. Además, los machos con premutación también transmiten un mayor riesgo de desarrollar FX-TAS17,18,19,mientras que las hembras de premutación están predispuestas tanto para FX-TAS como para FX-POI20, 21,22. Recientemente, se ha informado de que los trastornos del espectro autista con retraso del desarrollo y los problemas en las conductas sociales se presentan en niños con premutación FMR1 alelos23,24.

Para determinar el tamaño exacto de la repetición CGG es de gran importancia para la clasificación y predicción de los trastornos asociados al FXS y Xfrágiles 25,26. Históricamente, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) específica de la región de cGG con tamaño de fragmento más análisis de manchas del sur han sido el estándar de oro para el perfilmolecular de la repetición FMR1 CGG27. Sin embargo, la PCR específica tradicional es menos sensible a las premutaciones grandes con más de 100 a 130 repeticiones y es incapaz de amplificar mutaciones completas27,28. Además, la electroforesis capilar en un analizador genético tradicional para el tamaño repetido no detecta los productos de PCR FMR1 con más de 200 repeticiones De CGG. El análisis de la mancha meridional permite la diferenciación de una gama más amplia de tamaño de repetición, de números de repetición de mutaciones normales a completos, y se ha utilizado ampliamente para confirmar mutaciones completas (en varones) y diferenciar alos heterocigotos con una mutación completa de aparentemente alelos homocigotos con tamaños de repetición normales (en hembras). Sin embargo, la resolución para cuantificar las repeticiones es limitada. Más importante aún, esta estrategia de pruebas paso a paso requiere mucha mano de obra, requiere mucho tiempo y es ineficaz en cuanto a costos.

Aquí, presentamos un método preciso y robusto basado en PCR para la cuantificación de las repeticiones CGG de FMR1. El primer paso de esta prueba es la amplificación PCR de las secuencias de repetición en el 5'UTR del promotor FMR1 utilizando el kit de PCR Frágil X. Los productos PCR son purificados y el tamaño de fragmentos se realiza en un instrumento de electroforesis capilar microfluídica, y la interpretación posterior del número de repeticiones de CGG utilizando el software de análisis haciendo referencia a estándares con repeticiones conocidas basadas en el la longitud de los fragmentos de PCR es directamente proporcional al número de repeticiones de CGG. El sistema PCR incluye reactivos que facilitan la amplificación de la región de repetición de trinucleótidos altamente rica en GC. Este ensayo basado en PCR es reproducible y capaz de identificar todas las gamas de repeticiones de CGG de los promotores de FMR1. Este es un método rentable que puede encontrar una amplia aplicación en el diagnóstico molecular y el cribado de trastornos relacionados con FXS y X frágiles con menos tiempo de respuesta e inversión en equipos y, por lo tanto, puede ser utilizado en un espectro más amplio de clínica Laboratorios.

Protocolo

La aprobación ética fue otorgada por el Comité de ética de la investigación clínica del clúster oriental de la Universidad China Conjunta de Hong Kong-Nuevos Territorios (Número de referencia: 2013.055)

1. Amplificación de PCR

  1. Antes de comenzar, retire la mezcla tampón de PCR, el diluyente de muestras y las muestras de ADN (tanto el ADN de prueba como el de referencia) (ver la Tabla de Materiales)del congelador de -20 oC y manténgalos a temperatura ambiente durante 20-30 minutos para asegurarse de que todos los reactivos y el ADN estén completamente descongelados. Vórtice y gire brevemente antes de su uso.
  2. Mida la concentración de las muestras de ADN utilizando un espectrofotómetro (ver Tabla de Materiales). La concentración de ADN debe ser de 25 ng/L; diluir con diluyente de muestra a la concentración adecuada si es necesario.
    NOTA: El ADN debe extraerse y purificarse para eliminar sustancias que interfieren, como proteínas y altas concentraciones de sal. El ADN no degradado y de alta calidad debe utilizarse para la posterior amplificación y análisis de PCR (A260/A280: 1.8–2.0 y A260/A230: >1.0).
  3. Etiquetar pozos de una placa PCR o tubos PCR de 0,2 ml para identificar muestras de ADN de referencia y analizadas.
  4. Calcule el número de reacciones de PCR necesarias para las muestras de prueba, 2 muestras de referencia y muestras de control negativo. Preparar la mezcla maestra de PCR añadiendo 15 ml de mezcla tampón de PCR, 2,6 ml de diluyente de muestra y 0,4 ml de polimerasa para cada reacción.
    NOTA: Un control negativo utilizando diluyente de muestra es esencial para monitorear el rendimiento de la PCR. Preparar la mezcla maestra PCR a temperatura ambiente, NO pipetear en hielo. La mezcla de búfer PCR es viscosa. Mezcle el tubo y luego gire brevemente hacia abajo antes de usarlo.
  5. Vortex la mezcla maestra PCR del paso 1.4 para 10-20 s y girar hacia abajo. Dispensar lentamente 18 ml de la mezcla en cada pocal o tubo.
  6. Vórtice y espírelas. Pipetear 2 l de cada ADN en el pozo o tubo apropiado para un volumen final de PCR de 20 l. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5 veces.
    NOTA: La cantidad total de ADN por reacción debe ser de 50-100 ng. Las cantidades de ADN superiores a 150 ng por reacción de PCR de 20 ml pueden dar lugar a una baja amplificación de los alelos repetidos grandes. Para los ADN concentrados más bajos, la cantidad de diluyente de muestra en la mezcla maestra de PCR puede ser reemplazada por una solución de ADN.
  7. Sellar la placa con sellador de placa adhesiva, o con tapas de tubo.
  8. Coloque la placa o tubos PCR sellados en el ciclor térmico con tapa calentada. Ejecutar el programa con los siguientes ajustes: 95 oC durante 5 min, seguido de 25 ciclos de desnaturalización a 98 oC para 35 s, recocido a 59 oC para 35 s, y extensión a 72 oC durante 4 min; un paso final a 72 oC durante 10 minutos. Mantenga los productos de PCR a 4 oC en el ciclor hasta su posterior extracción para su posterior elaboración.
  9. Después de la amplificación de PCR, purifique y analice los productos inmediatamente, o almacene a +2 a +8 oC durante la noche. Alternativamente, el producto se puede almacenar durante un máximo de 30 días a -30 a -16 oC.

2. Purificación de los productos PCR

  1. Precalentar la coctelera de la incubadora a 65oC.
  2. Para cada reacción de PCR, añada 80 ml de búfer de TE 1x (consulte la Tabla de materiales)a los 20 ml de cada producto pcR de la sección 1.
  3. Transfiera la mezcla de muestras a una placa de limpieza de PCR (consulte Tabla de materiales)utilizando una pipeta multicanal.
  4. Mantenga la placa descubierta y colóquela en la coctelera de la incubadora, e incubar a 65 oC mientras agita a 1.200 rpm durante 10 minutos.
  5. Después de la incubación, ajuste el instrumento de vacío a 250 mbar (o 25 kPa, 188 mmHg, 7.4 en Hg) y aspire la solución a través del filtro durante 15 minutos.
  6. Enfríe la coctelera de la incubadora hasta los 25 oC.
  7. Después de la primera aspiración, apague el vacío y agregue 50 s de tampón TE de 1x a cada poca. No mezclar. Aspirar la solución durante 10 minutos utilizando la configuración de vacío en el paso 2.5.
  8. Seque la parte inferior de la placa del filtro presionándola firmemente sobre una pila de toallas de papel.
  9. Añadir 20 s de 1x te tampón en el centro inferior de cada poca. Colocar la placa en la coctelera de la incubadora e incubar a 25oC mientras agita a 1.200 rpm durante 5 min.
  10. Después de la incubación, transfiera >15 l de ADN pcR purificado desde el paso 2.9 hasta una placa de PCR nueva de 96 pocillos. El ADN purificado se puede analizar directamente, o alternativamente se puede almacenar a -30 a -16 oC hasta que sea necesario.

3. Tamaño de fragmentos de productos de PCR

  1. Antes de comenzar, permita el concentrado de colorante de ADN, la matriz de gel de ADN, el marcador de ADN, la escalera de ADN y las muestras de ADN purificadas desde el paso 2 para equilibrar la temperatura ambiente durante 30 min.
  2. Configure la estación de cebado.
    1. Reemplace la jeringa (consulte Tabla de materiales)cuando utilice un nuevo lote de reactivos.
    2. Ajuste la placa base y suelte la palanca del clip de la jeringa y deslícela hasta la posición superior.
  3. Inicie el software de dimensionamiento (ver Tabla de Materiales)y prepare la mezcla gel-dye.
  4. Concentrado de tinte vórtice para 10 s y girar hacia abajo. Añadir 25 ml del tinte a un vial de matriz de gel. Vortex la solución mezclada bien y girar hacia abajo.
    1. Transfiera la mezcla gel-dye a un filtro de espín. Coloque el filtro de centrifugado en una microcentrífuga y gire durante 10 minutos a temperatura ambiente a 1.500 x g a 20%.
      NOTA: Proteja la solución con tinte de la luz y guárdela a 4 oC después de su uso. La mezcla gel-dye se puede utilizar para unos 15 chips una vez preparado. Deje que la mezcla gel-dye se equilibre a temperatura ambiente durante 30 minutos cada vez antes de su uso.
  5. Cargue la mezcla gel-dye.
    1. Inserte un nuevo chip de ADN en la estación de cebado. Añadir 9 l de mezcla gel-dye en el bien marcado con "G". Asegúrese de que el émbolo esté situado en la marca de 1 ml y, a continuación, cierre la estación de cebado.
    2. Presione el émbolo de la jeringa hacia abajo hasta que lo mantenga el clip. Espere exactamente 30 s y suelte el clip. Espere 5 s y, a continuación, tire lentamente del émbolo de vuelta a la posición de 1 ml.
    3. Abra la estación de cebado y añada 9 l de mezcla gel-dye en los pozos marcados con "G".
  6. Añadir 5 sL de marcador en el bien marcado con el símbolo de la escalera y también añadir 5 sL de marcador en cada uno de los 12 pozos de muestra. No deje ningún pozo vacío.
  7. Añadir 1 l de escalera de ADN en el bien marcado con el símbolo de la escalera. Añadir 1 l de producto PCR (pozos usados) a partir del paso 3.1 o 1 l de agua ultrapura (pozos no utilizados) en cada uno de los 12 pozos de muestra. Coloque el chip horizontalmente en el adaptador del mezclador de vórtice y el vórtice durante 1 min en el ajuste indicado (2.400 rpm).
  8. Inserte el chip en el instrumento del bioanalizador y ejecute el chip en el instrumento en un plazo de 5 minutos.
  9. Una vez completado el ensayo, retire inmediatamente el chip usado del instrumento.
  10. Añadir lentamente 350 s de agua desionizada en uno de los pozos del limpiador de electrodos. Abra la tapa del bioanalizador y coloque el limpiador de electrodos en él. Cierre la tapa e incubar durante unos 10 s. Abra la tapa y retire el limpiador de electrodos. Espere otros 10 s para permitir que el agua de los electrodos se evapore y luego cierre la tapa.

4. Analizar los resultados de tamaño de fragmentos

NOTA: Las muestras de referencia deben ser amplificadas y analizadas por el mismo ciclor térmico y bioanalizador en el mismo lote con las muestras desconocidas.

  1. Una vez completada la ejecución del bioanalizador, exporte los datos de pico de cada ejecución como un archivo de tabla .csv para su posterior análisis.
  2. Inicie el software de análisis y abra el archivo de tabla de picos .csv exportado desde el paso 4.1.
  3. A través de la pestaña del menú QC, revise la línea de regresión ajustada a los cuatro puntos (mostrados como diamantes azules en la gráfica) de las dos muestras de referencia. El valor R2 de la línea de regresión debe ser >0,98 (los valores típicos superan 0,999).
  4. A través de la pestaña del menú Resultados, compruebe el tamaño de repetición de cada muestra cuya longitud de fragmento se traza automáticamente con la curva estándar de regresión lineal derivada de las muestras de referencia. El software también proporciona la clasificación de cada muestra de acuerdo con diferentes directrices.
  5. A través de la pestaña exportar menú, exporte el informe de resultados para cada muestra con los números de repetición y la clasificación de diagnóstico, así como un resumen de la información de muestra y el informe de control de calidad para cada ejecución.
    NOTA: El software de análisis permite el uso de directrices de clasificación personalizadas, como el Colegio Americano de Genética Médica (ACMG) o la Sociedad Clínica de Genética Molecular/Sociedad Europea de Genética Humana (CMGS/ESHG), así como las directrices de clasificación predefinidas Criterios.

Resultados

Los resultados de tamaño de la muestra de referencia femenina de premutación (NA20240, tamaños de repetición de 30 y 80) y la muestra de referencia femenina de mutación completa (NA20239, tamaños de repetición de 20 y 200) se muestran en la Figura 1A y la Figura 1B,respectivamente. Normalmente, dos picos de marcador (marcador inferior 50 pares base [bp] y marcador superior 10.380 bp) se incluyen en el perfil de tamaño de fragmento. Por lo general, hay un...

Discusión

FXS es la segunda causa más común de deterioro intelectual después de la trisomía 21, que representa casi la mitad del retraso mental ligado al X30, que puede afectar aproximadamente a 1 de cada 4.000 hombres y 1 de cada 8.000 mujeres. Más importante aún, casi 1 de cada 250–1.000 hembras lleva una premutación, y esta frecuencia es 1 en 250-1.600 en los machos26,31,32,...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por subvenciones del Proyecto de Manejo de Emergencias de la NSFC (Grant No. 81741004), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 81860272), el Plan de Investigación Principal de la Fundación Provincial de Ciencia y Tecnología de Guangxi ( Concesión No. AB16380219), la Beca de la Fundación de Ciencia Postdoctoral de China (Concesión No. 2018M630993) y la Fundación de Ciencias Naturales de Guangxi (Concesión No. 2018GXNSFAA281067).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubesAxygenPCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-freeAmbionAM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrumentAgilentG2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR PlateThermo FisherAB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridgeAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixerAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert softwareAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chipsAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent DNA 7500 kitAgilent5067-1506For Fragment sizing
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chipsAgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode CleanerAgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin FilterAgilentSupplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: SyringeAgilentSupplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Chip priming stationAgilent5065-4401Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Cubee Mini-centrifugeGeneReachaqbd-i
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum ManifoldMerck MilliporeMSVMHTS00Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopperMerck MilliporeXX2004718Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pumpMerck MilliporeWP6122050Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vesselMerck MilliporeXX1004705Filter plate vacuum Manifold
FragilEase Fragile X PCR kitPerkinElmer3101-0010For PCR amplification
FragilEase Fragile X PCR kit: Sample DiluentPerkinElmerIn kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )
FragilEase PCR Buffer mixPerkinElmerIn kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward)
FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse)
FragilEase PolymerasePerkinElmerIn kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )
FraXsoft analysis softwarePerkinElmer
NanoDrop ND-2000 SpectrophotometerThermo Fisher
Paper towels
PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plateMACHEREY-NAGEL743100
reference DNA sampleCoriellNA20240 & NA20239
S1000 96-well Thermal CyclerBio-Rad1852196This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti™ 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786)
TriNEST Incubator/Shaker instrumentPerkinElmer1296-0050
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterLife Technologies10977015For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning
Vortex-Genie 2Scientific IndustriesSI-0256 (Model G560E)Conventional vortex mixer

Referencias

  1. Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
  2. Fu, Y. H., et al. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox. Cell. 67, 1047-1058 (1991).
  3. Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses. Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).
  4. Didiot, M. C., et al. The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer. Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).
  5. Bechara, E. G., et al. A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation. PLoS Biology. 7, e16 (2009).
  6. Ascano, M., et al. FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression. Nature. 492, 382-386 (2012).
  7. Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).
  8. Oberle, I., et al. Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. Science. 252, 1097-1102 (1991).
  9. Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. Fragile X syndrome and targeted treatment trials. Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).
  10. Hatton, D. D., et al. Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP. American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).
  11. Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families. Human Genetics. 59, 281-289 (1981).
  12. Backes, M., et al. Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data. American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).
  13. Nolin, S. L., et al. Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010. Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).
  14. Nolin, S. L., et al. Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles. American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).
  15. Fernandez-Carvajal, I., et al. Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations. Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).
  16. Terracciano, A., et al. Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations. European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).
  17. Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. Advances in understanding the molecular basis of FXTAS. Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).
  18. Juncos, J. L., et al. New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS). Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).
  19. Hagerman, R. J., et al. Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X. Neurology. 57, 127-130 (2001).
  20. Conway, G. S. Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update. Annales d'endocrinologie. 71, 215-217 (2010).
  21. Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. Fragile X premutations in familial premature ovarian failure. Lancet. 346, 309-310 (1995).
  22. Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation. European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).
  23. Bourgeois, J. A., et al. A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective. Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).
  24. Farzin, F., et al. Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation. Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).
  25. Hantash, F. M., et al. FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States. Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).
  26. Kraan, C. M., et al. FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts. Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).
  27. Saul, R. A., Tarleton, J. C. FMR1-Related Disorders. GeneReviews. , (2012).
  28. Amos Wilson, J., et al. Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study. Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).
  29. Kwok, Y. K., et al. Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats. Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).
  30. Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene--and implications for the population genetics of the fragile X syndrome. American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).
  31. Tassone, F., et al. FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States. Genome Medicine. 4, 100 (2012).
  32. Dombrowski, C., et al. Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles. Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).
  33. Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis. Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).
  34. Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. Recent advances in assays for the fragile X-related disorders. Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).
  35. Seltzer, M. M., et al. Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample. American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).
  36. Hayward, B. E., Usdin, K. Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders. Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).
  37. Orrico, A., et al. Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case. American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).
  38. Schmucker, B., Seidel, J. Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males. American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Gen ticaN mero 151Reacci n en cadena de la polimerasaelectroforesis capilar microflu dicarepeticiones de citosina guanina guaninatrinucle tidoretardaci n mental X fr gil 1promotors ndrome X fr gilmutaci n completapremutaci n

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados