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Resumo

Um ensaio exato e robusto da reacção em cadeia do polymerase para quantificar repetições do trinucleotide da citosina-guanina-guanina no frágil X retardo mental-1 gene facilita o diagnóstico molecular e a seleção da síndrome frágil de X e do X-relacionado frágil distúrbios com tempo de virada mais curto e investimento em equipamentos.

Resumo

A síndrome de X frágil (FXS) e as desordens associadas são causadas pela expansão da repetição do trinucleotide da citosina-guanina-guanina (CGG) na região 5 ' Untranslated (UTR) do promotor do gene do retardo mental X-1 (FMR1) frágil. Convencionalmente, a análise capilar do fragmento da electroforese em um analisador genético é usada para o dimensionamento das repetições de CGG de FMR1, mas a análise adicional do Sul do Borrão é exigida para a medida exata quando o número da repetição é mais elevado do que 200. Aqui, nós apresentamos um método exato e robusto da reacção em cadeia do polymerase (PCR)-baseado para a quantificação das repetições de CGG de FMR1. A primeira etapa deste teste é a amplificação do PCR das seqüências da repetição no 5 ' UTR do promotor FMR1 usando um jogo frágil do PCR de X, seguido pela purificação dos produtos do PCR e do fragmento que cola em um instrumento capilar microfluídicos da electroforese, e interpretação subseqüente do número de repetições CGG referenciando padrões com repetições conhecidas usando o software de análise. Este ensaio PCR-baseado é reprodutível e capaz de identificar a série completa de repetições de CGG de FMR1 promotores, incluindo aqueles com um número da repetição de mais de 200 (classific como a mutação cheia), 55 a 200 (premutação), 46 a 54 (intermediário), e 10 a 45 (normal). É um método rentável que facilita a classificação do FXS e de desordens X-associadas frágeis com robustez e tempo de relatório rápido.

Introdução

A síndrome de X frágil (FXS) e as desordens associadas frágeis de X, por exemplo, a síndrome do tremor e da ataxia (FX-TAS), e a insuficiência ovariana preliminar (FX-POI) são causadas principalmente pela expansão da repetição do trinucleotide da citosina-guanina-guanina (CGG) nos 5 ' não traduzidos região (UTR) do gene frágil X retardo mental-1 (FMR1) no xq 27,31,2. A proteína FMR1 codificada (FMRP) é uma proteína de ligação de RNA associada a poliribosome que funciona no desenvolvimento neuronal e na plasticidade sináptica, regulando a emenda alternativa, estabilidade e transporte dendrítico de mRNA ou síntese moduladora de proteínas pós-sinápticas parciais3,4,5,6,7.

A variação dinâmica com um tamanho da repetição de CGG de > 200 é descrita como a mutação cheia, que induz o hipermetilação aberrante e o silenciamento transcricional subseqüente do promotor FMR1 8. A ausência ou falta resultante da proteína FMRP interrompe o desenvolvimento neuronal normal e provoca o FXS9, caracterizado por vários sintomas clínicos, incluindo incapacidade intelectual moderada a grave, atraso no desenvolvimento, comportamentos hiperativos, contatos pobres e manifestações autísticas10,11,12. A apresentação em pacientes fêmeas de FXS é geralmente mais suave do que aquela nos machos. O tamanho da repetição de CGG que varia de 55 a 200 e de 45 a 54 é classific como a pré-mutação e o status intermediário, respectivamente. Devido ao alto grau de instabilidade, o tamanho da repetição de CGG em uma pré-mutação ou alelo intermediário presumivelmente se expande quando transmitido dos pais para a descendência13,14. Assim, os portadores com alelos da pré-mutação estão no risco elevado de ter as crianças afetadas com o FXS por causa da expansão da repetição, e em alguns casos, os alelos intermediários podem expandir seu tamanho da repetição à escala cheia da mutação sobre duas gerações15, a 16. Além disso, os machos com pré-mutação também transmitem um risco aumentado de desenvolvimento de FX-tas de início tardio17,18,19, enquantoasfêmeas depré-mutação são predispostas para FX-tas e FX-POI20, 21,22. Recentemente, tem sido relatado que distúrbios do espectro autístico com atraso no desenvolvimento e problemas em comportamentos sociais são apresentados em crianças com pré-mutação FMR1 alelos23,24.

Para determinar o tamanho exato da repetição de CGG é de grande importância para classificação e predição do FXS e de desordens X-associadas frágeis25,26. Historicamente, a reação em cadeia da polimerase específica da região de repetição CGG (PCR) com dimensionamento de fragmento mais a análise do Southern blot tem sido o padrão-ouro para o perfil molecular da repetição de FMR1 CGG27. Entretanto, o PCR específico tradicional é menos sensível às grandes pré-mutações com mais de 100 a 130 repetições e é incapaz de amplificar mutações cheias27,28. Além disso, a electroforese capilar em um analisador genético tradicional para o dimensionamento da repetição não detecta produtos de FMR1 PCR com mais de 200 repetições de CGG. A análise do Sul do borrão permite a diferenciação de uma escala mais larga do tamanho da repetição, de normal aos números inteiros da repetição da mutação, e foi amplamente utilizada confirmando mutações cheias (nos machos) e diferenciando alelos heterozygous com uma mutação cheia de alelos aparentemente homozygous com tamanhos normais da repetição (nas fêmeas). No entanto, a resolução para quantificar as repetições é limitada. Mais importante, esta estratégia de teste passo a passo é trabalhosa, demorada, e custo-ineficaz.

Aqui, nós apresentamos um método exato e robusto da PCR-baseado para a quantificação das repetições de CGG de FMR1. A primeira etapa deste teste é amplificação do PCR das seqüências da repetição no 5 ' UTR do promotor FMR1 usando o jogo frágil do PCR de X. Os produtos do PCR são purified e o dimensionamento do fragmento é executado em um instrumento capilar microfluídicos da electroforese, e na interpretação subseqüente do número de repetições de CGG usando o software da análise referenciando padrões com repetições conhecidas baseadas no racional que o comprimento do fragmento do PCR é diretamente proporcional ao número de repetições de CGG. O sistema do PCR inclui os reagentes que facilitam a amplificação da região altamente GC-rica da repetição do trinucleotide. Este ensaio PCR-baseado é reprodutível e capaz de identificar todas as escalas de repetições de CGG de FMR1 promotores. Este é um método rentável que pode encontrar a aplicação larga no diagnóstico molecular e na seleção do FXS e de desordens X-relacionadas frágeis com menos tempo do turn-around e o investimento no equipamento e assim, pode ser utilizado em um espectro mais largo de clínico Laboratórios.

Protocolo

A aprovação ética foi concedida pela Universidade conjunta chinesa de Hong Kong ― Comitê de ética em pesquisa clínica do grupo de novos territórios do leste (número de referência: 2013, 55)

1. amplificação do PCR

  1. Antes de começar, remova a mistura do tampão do PCR, amostras do diluente e do ADN da amostra (teste e ADN da referência) (veja a tabela dos materiais) do congelador de-20 ° c e mantenha-os na temperatura ambiente por 20-30 minutos para certificar-se que todos os reagentes e ADN estão descongelados inteiramente. Vortex e brevemente girar para baixo antes de usar.
  2. Meça a concentração das amostras de DNA utilizando um espectrofotômetro (ver tabela de materiais). A concentração de DNA deve ser de 25 ng/μL; diluir com diluente da amostra para a concentração apropriada, se necessário.
    Nota: O DNA deve ser extraído e purificado para remover substâncias interferentes, como proteínas e altas concentrações de sal. O DNA não degradado e de alta qualidade deve ser utilizado para posterior amplificação e análise de PCR (A260/A280:1.8 – 2.0 e A260/A230: > 1,0).
  3. Rotule poços de uma placa de PCR ou 0,2 mL de tubos de PCR para identificar amostras de DNA de referência e testadas.
  4. Calcule o número de reações de PCR necessárias para as amostras de teste, 2 amostras de referência e amostra de controle negativo. Prepare a mistura do mestre do PCR adicionando 15 μL da mistura do amortecedor do PCR, 2,6 μL do diluente da amostra e 0,4 μL do polymerase para cada reação.
    Nota: Um controle negativo usando o diluente da amostra é essencial para monitorar o desempenho do PCR. Prepare a mistura mestre do PCR na temperatura ambiente, não pipeta no gelo. A mistura do tampão do PCR é viscosa. Misture o tubo e, em seguida, gire brevemente para baixo antes de usar.
  5. Vortex a mistura mestre do PCR da etapa 1,4 para 10 – 20 s e gire para baixo. Dispense lentamente 18 μL da mistura em cada poço ou tubo.
  6. Vortex e gire as amostras de DNA. Pipetar 2 μL de cada ADN para o poço ou tubo adequado para um volume final de PCR de 20 μL. misturar com pipetagem para cima e para baixo 5 vezes.
    Nota: A quantidade total de DNA por reação deve ser de 50 – 100 ng. As quantidades de DNA maiores que 150 ng por 20 μL de reação de PCR podem resultar em uma fraca amplificação de alelos de repetição grandes. Para DNAs mais baixas concentradas, a quantidade de diluente da amostra na mistura mestra do PCR pode ser substituída pela solução do ADN.
  7. Sele a placa com o aferidor da placa adesiva, ou com tampões de tubo.
  8. Coloc a placa ou os tubos selados do PCR no ciclador térmico com tampa aquecida. Execute o programa com as seguintes configurações: 95 ° c por 5 min, seguidos por 25 ciclos de desnaturação a 98 ° c para 35 s, recozimento a 59 ° c para 35 s e extensão a 72 ° c por 4 min; uma etapa final em 72 ° c por 10 minutos. prenda os produtos do PCR em 4 ° c no cycler até a remoção para um processamento mais adicional.
  9. Após a amplificação do PCR, purificar e analise os produtos imediatamente, ou armazene-o em + 2 a + 8 ° c durante a noite. Alternativamente, o produto pode ser armazenado por até 30 dias em-30 a-16 ° c.

2. purificação dos produtos do PCR

  1. Pré-aqueça o agitador da incubadora a 65 ° c.
  2. Para cada reação de PCR, adicione 80 μL de tampão de 1x TE (veja a tabela de materiais) aos 20 μL de cada produto da PCR da seção 1.
  3. Transfira a mistura de amostras para uma placa de limpeza de PCR (ver tabela de materiais) utilizando uma pipeta multicanal.
  4. Mantenha a placa descoberta e coloque-a no agitador da incubadora, e incubar a 65 ° c enquanto agitando a 1.200 rpm por 10 min.
  5. Após a incubação, definir o instrumento de vácuo em 250 mbar (ou 25 kPa, 188 mmHg, 7,4 em Hg) e aspirar a solução através do filtro por 15 min. Wells não deve ter nenhum líquido restante.
  6. Resfrie o agitador da incubadora até 25 ° c.
  7. Após a primeira aspiração, desligue o aspirador e adicione 50 μL de tampão TE 1x a cada poço. Não misture. Aspirar a solução por 10 min usando as configurações de vácuo na etapa 2,5.
  8. Seque a parte inferior da placa de filtro pressionando-a firmemente em uma pilha de toalhas de papel.
  9. Adicione 20 μL do tampão de 1x TE no centro inferior de cada poço. Coloc a placa no abanador da incubadora e incubar em 25 ° c ao agitar em 1.200 rpm por 5 minutos.
  10. Após a incubação, transfira > 15 μL de cada ADN purificado do PCR da etapa 2,9 a uma placa fresca do PCR 96-well. O DNA purificado pode ser analisado diretamente, ou alternativamente pode ser armazenado em-30 a-16 ° c até que exigido.

3. fragmento de dimensionamento de produtos de PCR

  1. Antes de começar, permita o concentrado da tintura do ADN, a matriz do gel do ADN, o marcador do ADN, a escada do ADN e amostras purificadas do ADN da etapa 2 para equilibrar à temperatura ambiente por 30 minutos.
  2. Configurar a estação de escorva.
    1. Substitua a seringa (ver tabela de materiais) quando utilizar um novo lote de reagentes.
    2. Ajuste a placa de base e solte a alavanca do clipe da seringa e deslize-a até a posição superior.
  3. Inicie o software de dimensionamento (ver tabela de materiais) e prepare a mistura gel-Dye.
  4. Concentrado de corante Vortex para 10 s e girar para baixo. Adicione 25 μL do corante a um frasco para injetáveis de matriz de gel. Vortex a solução mista bem e girar para baixo.
    1. Transfira a mistura gel-Dye para um filtro de centrifugação. Coloque o filtro de centrifugação numa microcentrífuga e gire durante 10 min à temperatura ambiente a 1.500 x g ± 20%.
      Nota: Proteja a solução com corante da luz e armazene a 4 ° c após o uso. A mistura do gel-corante pode ser usada por aproximadamente 15 microplaquetas uma vez preparadas. Deixe a mistura de gel-corante equilibrar-se à temperatura ambiente durante 30 minutos de cada vez antes da utilização.
  5. Carregue a mistura gel-Dye.
    1. Insira um novo chip de DNA na estação de escorva. Adicionar 9 μL de mistura de gel-corante no poço marcado com "G". Certifique-se de que o êmbolo está posicionado na marca de 1 mL e, em seguida, feche a estação de escorva.
    2. Pressione o êmbolo da seringa para baixo até que seja mantido pelo clipe. Aguarde exatamente 30 s, em seguida, solte o clipe. Aguarde 5 s e, em seguida, puxe lentamente o êmbolo de volta para a posição de 1 mL.
    3. Abra a estação de escorva e adicione 9 μL de mistura de gel-corante nos poços marcados com "G".
  6. Adicione 5 μL de marcador no poço marcado com o símbolo da escada e adicione também 5 μL de marcador em cada um dos 12 poços amostrais. Não deixe nenhum poço vazio.
  7. Adicione 1 μL da escada do ADN no poço marcado com o símbolo da escada. Adicionar 1 μL de produto PCR (poços usados) da etapa 3,1 ou 1 μL de água ultrapura (poços não utilizados) em cada um dos 12 poços amostrais. Coloque o chip horizontalmente no adaptador de misturador Vortex e Vortex por 1 min no ajuste indicado (2.400 rpm).
  8. Insira a microplaqueta no instrumento do Bioanalyzer e funcione a microplaqueta no instrumento dentro de 5 minutos.
  9. Após a conclusão do ensaio, retire imediatamente o chip utilizado do aparelho.
  10. Adicione lentamente 350 μL de água desionizada em um dos poços do limpador de eletrodos. Abra a tampa do bioanalisador e coloque o limpador do eletrodo nele. Fechar a tampa e incubar por cerca de 10 s. Abra a tampa e retire o limpador do eléctrodo. Aguarde mais 10 s para permitir que a água nos eléctrodos evate e, em seguida, feche a tampa.

4. Analise os resultados de dimensionamento de fragmento

Nota: As amostras de referência devem ser amplificadas e analisadas pelo mesmo termociclador e bioanalisador no mesmo lote com as amostras desconhecidas.

  1. Após a execução do Bioanalyzer ser concluída, exporte os dados de pico de cada execução como um arquivo de tabela. csv para análise subsequente.
  2. Inicie o software de análise e abra o arquivo de tabela de pico. csv exportado da etapa 4,1.
  3. Através da aba do menu do QC , reveja a linha de regressão ajustada aos quatro pontos (mostrados como diamantes azuis na parcela) das duas amostras da referência. O valor de R2 da linha de regressão deve ser > 0,98 (os valores típicos excedem 0,999).
  4. Através da guia menu de resultados , verifique o tamanho da repetição de cada amostra cujo comprimento (s) de fragmento é automaticamente plotado contra a curva padrão de regressão linear derivada das amostras de referência. O software também fornece a classificação de cada amostra de acordo com diferentes diretrizes.
  5. Através da aba do menu da exportação , exporte o relatório do resultado para cada amostra com os números da repetição e a classificação diagnóstica, assim como um Sumário da informação da amostra e do relatório do QC para cada execução.
    Nota: O software de análise permite o uso de diretrizes de classificação personalizadas, como as diretrizes da American College of Medical Genetics (ACMG) ou da sociedade de genética molecular/sociedade européia de genética humana (CMGS/ESHG), bem como a classificação predefinida Critérios.

Resultados

Os resultados de dimensionamento da amostra de referência feminina de pré-mutação (NA20240, tamanhos de repetição de 30 e 80) e a amostra de referência feminina de mutação completa (NA20239, tamanhos de repetição de 20 e 200) são mostrados na Figura 1a e na Figura 1b, respectivamente. Normalmente, dois picos de marcador (menor marcador 50 pares de base [BP] e marcador superior 10.380 BP) são incluídos no perfil de tamanho do fragmento. Há geralmen...

Discussão

O FXS é a segunda causa mais comum de comprometimento intelectual após a trisminha 21, representando quase metade do retardo mental ligado ao X30, que pode afetar aproximadamente 1 em 4.000 machos e 1 em 8.000 fêmeas. Mais importante, quase 1 em 250 – 1000 fêmeas carregam uma pré-mutação, e esta freqüência é 1 em 250 – 1600 nos machos26,31,32,33. Desde que ...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada por subsídios do projeto de gerenciamento de emergência da NSFC (Grant no. 81741004), a Fundação Nacional de ciências naturais da China (Grant no. 81860272), o principal plano de pesquisa da Fundação provincial de ciência e tecnologia de Guangxi ( Grant no. AB16380219), o Grant da Fundação da ciência de pós-doutorado de China (Grant no. 2018M630993), e a Fundação da ciência natural de Guangxi (Grant no. 2018GXNSFAA281067).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubesAxygenPCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-freeAmbionAM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrumentAgilentG2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR PlateThermo FisherAB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridgeAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixerAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert softwareAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chipsAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent DNA 7500 kitAgilent5067-1506For Fragment sizing
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chipsAgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode CleanerAgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin FilterAgilentSupplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: SyringeAgilentSupplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Chip priming stationAgilent5065-4401Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Cubee Mini-centrifugeGeneReachaqbd-i
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum ManifoldMerck MilliporeMSVMHTS00Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopperMerck MilliporeXX2004718Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pumpMerck MilliporeWP6122050Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vesselMerck MilliporeXX1004705Filter plate vacuum Manifold
FragilEase Fragile X PCR kitPerkinElmer3101-0010For PCR amplification
FragilEase Fragile X PCR kit: Sample DiluentPerkinElmerIn kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )
FragilEase PCR Buffer mixPerkinElmerIn kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward)
FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse)
FragilEase PolymerasePerkinElmerIn kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )
FraXsoft analysis softwarePerkinElmer
NanoDrop ND-2000 SpectrophotometerThermo Fisher
Paper towels
PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plateMACHEREY-NAGEL743100
reference DNA sampleCoriellNA20240 & NA20239
S1000 96-well Thermal CyclerBio-Rad1852196This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti™ 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786)
TriNEST Incubator/Shaker instrumentPerkinElmer1296-0050
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterLife Technologies10977015For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning
Vortex-Genie 2Scientific IndustriesSI-0256 (Model G560E)Conventional vortex mixer

Referências

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