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  • matériels
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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Un test précis et robuste basé sur la réaction en chaîne de polymérase pour quantifier les répétitions de trinucleotide cytosine-guanine-guanine dans le gène fragile x de retardmental-1 facilite le diagnostic moléculaire et le criblage du syndrome de LX fragile et du X fragile-connexe avec un délai d'attente plus court et des investissements dans l'équipement.

Résumé

Le syndrome de X fragile (FXS) et les désordres associés sont provoqués par l'expansion du cytosine-guanine-guanine (CGG) répétition de trinucleotide dans la région non traduite de 5' (UTR) du retardement mental fragile x-1 (FMR1) promoteur de gène. Traditionnellement, l'analyse de fragment d'électrophoresis capillaire sur un analyseur génétique est utilisée pour le dimensionnement des répétitions CGG de FMR1, mais une analyse supplémentaire de tache méridionale est nécessaire pour la mesure exacte lorsque le nombre de répétition est supérieur à 200. Ici, nous présentons une méthode précise et robuste de réaction en chaîne de polymérase (PCR) pour quantifier les répétitions de CGG de FMR1. La première étape de ce test est l'amplification PCR des séquences répétitifs dans le 5'UTR du promoteur FMR1 à l'aide d'un kit Fragile X PCR, suivie de la purification des produits PCR et du dimensionnement par fragment sur un instrument d'électrophorèse capillaire microfluidique, et l'interprétation ultérieure du nombre de répétitions cGG en faisant référence à des normes avec des répétitions connues à l'aide du logiciel d'analyse. Cet analyse à base de PCR est reproductible et capable d'identifier toute la gamme des répétitions CGG des promoteurs FMR1, y compris ceux avec un nombre répété de plus de 200 (classés comme mutation complète), 55 à 200 (prémutation), 46 à 54 (intermédiaire), et 10 à 45 (normal). Il s'agit d'une méthode rentable qui facilite la classification des troubles associés au FXS et à l'X fragile avec robustesse et temps de déclaration rapide.

Introduction

Le syndrome de L'X fragile (FXS) et les troubles associés à l'X fragile, par exemple, le syndrome des tremblements et de l'ataxie (FX-TAS) et l'insuffisance ovarienne primaire (FX-POI) sont principalement causés par l'expansion du trinuccléotide cytosine-guanine-guanine (CGG) dans le 5' non traduit région (UTR) du fragile X mental retardation-1 (FMR1) gène sur Xq27.31,2. La protéine codée FMR1 (FMRP) est une protéine liant l'ARN associée au polyribosome qui fonctionne dans le développement neuronal et la plasticité synaptique en régulant l'épissage alternatif, la stabilité, et le transport dendritique de l'ARNm ou la synthèse modulatrice des protéines postsynaptiques partielles3,4,5,6,7.

La variation dynamique avec une taille de répétition CGG de 'gt;200 est décrite comme mutation complète, qui induit l'hyperméthylation aberrante et le silençage transcriptionnel suivant du promoteur FMR1 8. L'absence ou l'absence résultante de la protéine FMRP perturbe le développement neuronal normal et cause FXS9, caractérisé par divers symptômes cliniques, y compris une déficience intellectuelle modérée à sévère, retard de développement, comportements hyperactifs, contacts pauvres et manifestations autistiques10,11,12. La présentation dans les patients féminins de FXS est généralement plus douce que cela chez les mâles. La taille de répétition de CGG s'étendant de 55 à 200 et 45 à 54 sont classifiées comme prémutation et statut intermédiaire, respectivement. En raison du degré élevé d'instabilité, la taille de répétition de CGG dans un allèle de prémutation ou intermédiaire se développe vraisemblablement une fois transmise des parents à la progéniture13,14. Ainsi, les porteurs avec des allèles de prémutation sont à haut risque d'avoir des enfants affectés avec FXS en raison de l'expansion répétée, et dans certains cas, les allèles intermédiaires peuvent augmenter leur taille de répétition à la gamme complète de mutation sur deux générations15, 16. En outre, les mâles avec la prémutation transmettent également le risque accru de développer le FX-TAS de tard-de-démarrage17,18,19, tandis que les femelles de prémutation sont prédisposées pour FX-TAS et FX-POI20, 21,22. Récemment, il a été rapporté que les désordres de spectre autistique avec le retard développemental et les problèmes dans les comportements sociaux sont présentés chez les enfants avec des alleles fMR1 de prémutation23,24.

Pour déterminer la taille exacte de répétition de CGG est d'une grande importance pour la classification et la prévision des désordres FXS et X-associés fragiles25,26. Historiquement, la réaction en chaîne de polymérase (PCR) spécifique à la région de CGG avec le dimensionnement de fragment plus l'analyse méridionale de tache ont été l'étalon-or pour le profilage moléculaire de la répétition de FMR1 CGG27. Cependant, pcR spécifique traditionnel est moins sensible aux grandes prémutations avec plus de 100 à 130 répétitions et est incapable d'amplifier les mutations complètes27,28. En outre, l'électrophoresis capillaire sur un analyseur génétique traditionnel pour le dimensionnement répété ne détecte pas les produits FMR1 PCR avec plus de 200 répétitions CGG. L'analyse de tache méridionale permet la différenciation d'une plus large gamme de taille de répétition, des nombres normaux aux nombres complets de répétition de mutation, et a été employée couramment pour confirmer des mutations complètes (chez les mâles) et différencier des allèles hétérozygotes avec une mutation complète de apparemment homozygous alleles avec des tailles normales de répétition (chez les femelles). Cependant, la résolution pour quantifier les répétitions est limitée. Plus important encore, cette stratégie de test étape par étape est laborieuse, longue et inefficace sur le plan des coûts.

Ici, nous présentons une méthode précise et robuste basée sur PCR pour quantifier les répétitions CGG de FMR1. La première étape de ce test est l'amplification PCR des séquences répétées dans le 5'UTR du promoteur FMR1 à l'aide du kit Fragile X PCR. Les produits PCR sont purifiés et le dimensionnement des fragments est effectué sur un instrument d'électrophorèse capillaire microfluidique, et l'interprétation ultérieure du nombre de répétitions CGG à l'aide du logiciel d'analyse en faisant référence à des normes avec des répétitions connues basées sur le justification que la longueur du fragment de PCR est directement proportionnelle au nombre de répétitions CGG. Le système PCR comprend des réactifs qui facilitent l'amplification de la région de répétition du trinucleotide très riche en GC. Cet analyse à base de PCR est reproductible et capable d'identifier toutes les gammes de répétitions CGG des promoteurs FMR1. Il s'agit d'une méthode rentable qui peut trouver une large application dans le diagnostic moléculaire et le dépistage des maladies et des troubles liés à l'X fragile avec moins de temps de contournement et d'investissement dans l'équipement et, par conséquent, peut être utilisé dans un plus large éventail de cliniques Laboratoires.

Protocole

L'approbation éthique a été accordée par le Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee (Numéro de référence: 2013.055)

1. Amplification de PCR

  1. Avant de commencer, retirez le mélange tampon PCR, les échantillons de diluant et d'ADN (ADN de test et d'ADN de référence) (voir le tableau des matériaux)du congélateur de -20 oC et gardez-les à température ambiante pendant 20 à 30 min pour s'assurer que tous les réactifs et l'ADN sont complètement décongelés. Vortex et tourner brièvement vers le bas avant utilisation.
  2. Mesurer la concentration des échantillons d'ADN à l'aide d'un spectrophotomètre (voir Tableau des matériaux). La concentration d'ADN doit être de 25 ng/L; diluer avec le diluant d'échantillon à la concentration appropriée si nécessaire.
    REMARQUE: L'ADN doit être extrait et purifié pour éliminer les substances interférantes, telles que les protéines et les fortes concentrations de sel. L'ADN non dégradé et de haute qualité devrait être utilisé pour l'amplification et l'analyse ultérieures de PCR (A260/A280 : 1.8-2.0 et A260/A230 : '1.0).
  3. Étiqueter les puits d'une plaque PCR ou de tubes PCR de 0,2 ml pour identifier les échantillons d'ADN de référence et testés.
  4. Calculer le nombre de réactions DE PCR requises pour les échantillons d'essai, 2 échantillons de référence et l'échantillon de contrôle négatif. Préparer pcR Master Mix en ajoutant 15 l de mélange tampon PCR, 2,6 l de diluant d'échantillon et 0,4 L de polymérase pour chaque réaction.
    REMARQUE: Un contrôle négatif à l'aide d'un diluant d'échantillon est essentiel pour surveiller les performances du PCR. Préparer le mélange PCR maître à température ambiante, ne PAS pipette sur la glace. Le mélange de mémoire tampon PCR est visqueux. Mélanger le tube, puis tourner brièvement vers le bas avant l'utilisation.
  5. Vortex le mélange PCR maître de l'étape 1.4 pour 10-20 s et spin vers le bas. Distribuer lentement 18 l de mélange dans chaque puits ou tube.
  6. Vortex et faire tourner les échantillons d'ADN. Pipette 2 'L de chaque ADN dans le puits ou le tube approprié pour un volume final de PCR de 20 L. Mélanger par pipetting de haut en bas 5 fois.
    REMARQUE: La quantité totale d'ADN par réaction doit être de 50 à 100 ng. Les quantités d'ADN supérieures à 150 ng par réaction PCR de 20 L peuvent entraîner une mauvaise amplification des grands allèles répétitifs. Pour les ADN moins concentrés, la quantité de diluant d'échantillon dans le mix principal PCR peut être remplacée par une solution d'ADN.
  7. Scellez la plaque avec un scellant adhésif ou des bouchons tubulaires.
  8. Placez la plaque ou les tubes PCR scellés dans le cycleur thermique avec le couvercle chauffé. Exécuter le programme avec les réglages suivants : 95 oC pendant 5 min, suivi de 25 cycles de dénaturation à 98 oC pour 35 s, d'annealing à 59 oC pour 35 s et d'extension à 72 oC pendant 4 min; une dernière étape à 72 oC pendant 10 min. Maintenir les produits PCR à 4 oC dans le cycler jusqu'à ce qu'ils soient enlevés pour un traitement ultérieur.
  9. Après l'amplification du PCR, purifie et analysez immédiatement les produits, ou entreposez-les à 2 à 8 oC pendant la nuit. Alternativement, le produit peut être stocké jusqu'à 30 jours à -30 à -16 oC.

2. Purification des produits PCR

  1. Préchauffer le shaker de l'incubateur à 65 oC.
  2. Pour chaque réaction PCR, ajoutez 80 L de tampon 1x TE (voir le Tableau des Matériaux) aux 20 L de chaque produit PCR de la section 1.
  3. Transférer le mélange d'échantillons dans une plaque de nettoyage PCR (voir Tableau des matériaux) à l'aide d'une pipette multicanal.
  4. Gardez la plaque à découvert et placez-la dans le shaker de l'incubateur, et incubez-la à 65 oC tout en secouant à 1 200 tr/min pendant 10 min.
  5. Après l'incubation, mettre l'instrument à vide à 250 mbar (ou 25 kPa, 188 mmHg, 7,4 po hg) et aspirer la solution à travers le filtre pendant 15 min. Wells ne devrait plus avoir de liquide.
  6. Refroidir le shaker de l'incubateur jusqu'à 25 oC.
  7. Après la première aspiration, éteignez le vide et ajoutez 50 L de tampon 1x TE à chaque puits. Ne pas mélanger. Aspirez la solution pendant 10 min en utilisant les réglages du vide à l'étape 2.5.
  8. Séchez le fond de la plaque de filtre en la pressant fermement sur une pile de serviettes en papier.
  9. Ajouter 20 l de tampon 1x TE dans le centre inférieur de chaque puits. Placer la plaque dans le shaker de l'incubateur et couver à 25 oC tout en secouant à 1 200 tr/min pendant 5 min.
  10. Après l'incubation, transférer l'ADN PCR purifié de l'étape 2.9 à une plaque PCR fraîche de 96 puits. L'ADN purifié peut être analysé directement, ou alternativement peut être stocké à -30 à -16 oC jusqu'à ce que nécessaire.

3. Fragment de dimensionnement des produits PCR

  1. Avant de commencer, laissez le concentré de teinture d'ADN, la matrice de gel d'ADN, le marqueur d'ADN, l'échelle d'ADN et les échantillons d'ADN purifiés de l'étape 2 à l'équilibre à la température ambiante pendant 30 min.
  2. Installez la station d'amorçage.
    1. Remplacer la seringue (voir Tableau des matériaux)lors de l'utilisation d'un nouveau lot de réactifs.
    2. Ajustez la plaque de base, relâchez le levier de l'agrafe de seringue et faites-la glisser jusqu'à la position supérieure.
  3. Démarrer le logiciel de dimensionnement (voir Tableau des matériaux) et préparer le mélange gel-teinture.
  4. Concentré de colorant Vortex pendant 10 s et spin vers le bas. Ajouter 25 l l de la teinture dans un flacon de matrice de gel. Vortex la solution mixte bien et spin vers le bas.
    1. Transférer le mélange gel-teint dans un filtre à spin. Placer le filtre de spin dans un microcentrifugeet et tourner pendant 10 min à température ambiante à 1 500 x g et 20 %.
      REMARQUE: Protégez la solution avec du colorant de la lumière et entreposez-le à 4 oC après utilisation. Le mélange gel-teinture peut être utilisé pour environ 15 croustilles une fois préparé. Laisser le mélange gel-teint raccorder à la température ambiante pendant 30 minutes à chaque fois avant l'utilisation.
  5. Chargez le mélange gel-teinture.
    1. Insérez une nouvelle puce d'ADN sur la station d'amorçage. Ajouter 9 ll de mélange gel-teinture dans le bien marqué avec "G". S'il vous plaît assurez-vous que le piston est positionné à la marque 1 mL, puis fermer la station d'amorçage.
    2. Appuyez sur le piston de seringue vers le bas jusqu'à ce qu'il soit tenu par le clip. Attendez exactement 30 s puis relâchez le clip. Attendez 5 s, puis tirez lentement le piston vers la position de 1 ml.
    3. Ouvrez la station d'amorçage et ajoutez 9 l de mélange gel-teinture dans les puits marqués de « G ».
  6. Ajouter 5 ll de marqueur dans le puits marqué avec le symbole de l'échelle et ajouter 5 ll de marqueur dans chacun des 12 puits d'échantillon. Ne laissez pas les puits vides.
  7. Ajouter 1 l l d'échelle d'ADN dans le puits marqué avec le symbole de l'échelle. Ajouter 1 l de produit PCR (puits usagés) à partir de l'étape 3.1 ou 1 L d'eau ultrapure (puits inutilisés) dans chacun des 12 puits d'échantillonnage. Placez la puce horizontalement dans l'adaptateur du mélangeur à vortex et vortex pendant 1 min au réglage indiqué (2 400 tr/min).
  8. Insérez la puce dans l'instrument de bioanalyseur et exécutez la puce dans l'instrument dans un délai de 5 minutes.
  9. Une fois l'extrait terminé, retirez immédiatement la puce utilisée de l'instrument.
  10. Ajoutez lentement 350 l'eau déionisée dans l'un des puits du nettoyant pour électrodes. Ouvrez le couvercle du bioanalyseur et placez le nettoyant d'électrode dedans. Fermer le couvercle et couver pendant environ 10 s. Ouvrez le couvercle et retirez le nettoyant pour électrodes. Attendez encore 10 s pour permettre à l'eau sur les électrodes de s'évaporer, puis fermez le couvercle.

4. Analyser les résultats de dimensionnement des fragments

REMARQUE: Les échantillons de référence doivent être amplifiés et analysés par le même cycleur thermique et bioanalyseur dans le même lot avec les échantillons inconnus.

  1. Une fois l'exécution de bioanalyseur terminée, exportez les données de pointe de chaque exécution comme fichier de table .csv pour l'analyse ultérieure.
  2. Démarrez le logiciel d'analyse et ouvrez le fichier de table de pointe exporté .csv à partir de l'étape 4.1.
  3. À travers l'onglet menu QC, passez en revue la ligne de régression adaptée aux quatre points (indiqués comme diamants bleus sur la parcelle) à partir des deux échantillons de référence. La valeur R2 de la ligne de régression doit être de 0,98 (les valeurs typiques dépassent 0,999).
  4. À travers l'onglet Menu Résultats, vérifiez la taille répétée de chaque échantillon dont la longueur du fragment est automatiquement tracée par rapport à la courbe standard de régression linéaire dérivée des échantillons de référence. Le logiciel fournit également la classification de chaque échantillon selon des directives différentes.
  5. Grâce à l'onglet Menu Exportation, exportez le rapport de résultat pour chaque échantillon avec les numéros de répétition et la classification diagnostique, ainsi qu'un résumé de l'information de l'échantillon et le rapport QC pour chaque exécution.
    REMARQUE: Le logiciel d'analyse permet l'utilisation de lignes directrices de classification personnalisées, telles que l'American College of Medical Genetics (ACMG) ou la Clinical Molecular Genetics Society/European Society of Human Genetics (CMGS/ESHG), ainsi que des classifications prédéfinies critères.

Résultats

Les résultats de dimensionnement de l'échantillon de référence féminin de prémutation (NA20240, tailles de répétition de 30 et 80) et de l'échantillon de référence féminin de mutation complète (NA20239, tailles de répétition de 20 et 200) sont indiqués dans la figure 1A et la figure 1B,respectivement. En règle générale, deux pics de marqueurs (marqueur inférieur 50 paires de base [bp] et marqueur supérieur 10 380 pb) sont inclus dans le prof...

Discussion

FXS est la deuxième cause la plus fréquente de déficience intellectuelle après la trisomie 21, représentant près de la moitié du retard mental lié à l'X30, qui peut affecter environ 1 homme sur 4 000 et 1 femme sur 8 000. Plus important encore, près d'une femme sur 250 à 1 000 porte une prémutation, et cette fréquence est de 1 sur 250 à 1 600 chez les hommes26,31,32,

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Cette recherche a été appuyée par des subventions du NSFC Emergency Management Project (Grant no 81741004), de la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81860272), du Plan de recherche majeur de la Provincial Science and Technology Foundation of Guangxi ( Subvention No. AB16380219), la China Postdoctoral Science Foundation Grant (Grant No. 2018M630993) et la Guangxi Natural Science Foundation (Grant No. 2018GXNSFAA281067).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubesAxygenPCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1x TE buffer, pH 8.0, Rnase-freeAmbionAM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrumentAgilentG2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR PlateThermo FisherAB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridgeAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixerAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert softwareAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chipsAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent DNA 7500 kitAgilent5067-1506For Fragment sizing
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chipsAgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode CleanerAgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin FilterAgilentSupplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: SyringeAgilentSupplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Chip priming stationAgilent5065-4401Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Cubee Mini-centrifugeGeneReachaqbd-i
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum ManifoldMerck MilliporeMSVMHTS00Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopperMerck MilliporeXX2004718Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pumpMerck MilliporeWP6122050Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vesselMerck MilliporeXX1004705Filter plate vacuum Manifold
FragilEase Fragile X PCR kitPerkinElmer3101-0010For PCR amplification

Références

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