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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Ein genauer und robuster, auf Polymerasekettenreaktion basierender Assay zur Quantifizierung von Cytosin-Guanin-Guanin-Trinukleotid-Wiederholungen im Fragile X-Gen für geistige Retardierung-1 erleichtert die molekulare Diagnose und das Screening des Fragile X-Syndroms und des fragilen X-bezogenen Störungen mit kürzerer Umschaltzeit und Investitionen in Ausrüstung.

Zusammenfassung

Fragiles X-Syndrom (FXS) und damit verbundene Störungen werden durch die Ausdehnung des Cytosin-Guanin-Guanin-Guin-Tricleid-Repeats (CGG) in der5' unübersetzten Region (UTR) des fragilen X-Genpromotors verursacht. Konventionell wird die Kapillarelektrophoresefragmentanalyse auf einem genetischen Analysator für die Dimensionierung der CGG-Wiederholungen von FMR1verwendet, aber für die genaue Messung, wenn die Wiederholungszahl höher als 200 ist, ist eine zusätzliche Südfleckanalyse erforderlich. Hier stellen wir eine genaue und robuste Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Methode zur Quantifizierung der CGG-Wiederholungen von FMR1vor. Der erste Schritt dieses Tests ist die PCR-Verstärkung der Wiederholungssequenzen in der 5'UTR des FMR1-Promotors mit einem Fragile X PCR-Kit, gefolgt von der Reinigung der PCR-Produkte und der Fragmentierung auf einem mikrofluidischen Kapillarelektrophorese-Instrument, und anschließende Interpretation der Anzahl der CGG-Wiederholungen durch Verweise auf Standards mit bekannten Wiederholungen mithilfe der Analysesoftware. Dieser PCR-basierte Assay ist reproduzierbar und in der Lage, die gesamte Bandbreite der CGG-Wiederholungen von FMR1-Promotoren zu identifizieren, einschließlich derjenigen mit einer Wiederholungszahl von mehr als 200 (klassifiziert als vollständige Mutation), 55 bis 200 (Vormutation), 46 bis 54 (Zwischen- und 10 bis 45 (normal). Es ist eine kostengünstige Methode, die die Klassifizierung der FXS und Fragile X-assoziierten Störungen mit Robustheit und schneller Berichtszeit erleichtert.

Einleitung

Fragiles X-Syndrom (FXS) und fragile X-assoziierte Erkrankungen, z. B. Tremor- und Ataxie-Syndrom (FX-TAS), und primäre Ovarialinsuffizienz (FX-POI) werden hauptsächlich durch Cytosin-Guanin-Guanin (CGG) Trinukleotid-Wiederholungsexpansion in der 5' unübersetzten (UTR) des fragilen X-Gens für geistige Retardierung-1 (FMR1) auf Xq27.31,2. Das FMR1-kodierte Protein (FMRP) ist ein polyribosom-assoziiertes RNA-bindendes Protein, das in der neuronalen Entwicklung und synaptischen Plastizität funktioniert, indem es alternative Spleiß-, Stabilitäts- und dendritische Transporte von mRNA oder modulierender Synthese reguliert. von partiellen postsynaptischen Proteinen3,4,5,6,7.

Die dynamische Variation mit einer CGG-Wiederholungsgröße von >200 wird als vollständige Mutation beschrieben, die die aberrante Hypermethylierung und die anschließende Transkriptionssilencing des FMR1-Promotors 8induziert. Das daraus resultierende Fehlen oder Fehlen des FMRP-Proteins stört die normale neuronale Entwicklung und verursacht FXS9, gekennzeichnet durch verschiedene klinische Symptome, einschließlich mittelschwerer bis schwerer geistiger Behinderung, Entwicklungsverzögerung, hyperaktives Verhalten, schlechte Kontakte und autistische Manifestationen10,11,12. Die Darstellung bei weiblichen FXS-Patienten ist in der Regel milder als bei Männern. Die CGG-Wiederholungsgröße von 55 bis 200 bzw. 45 bis 54 wird als Vormutation bzw. Zwischenstatus klassifiziert. Aufgrund des hohen Grades an Instabilität dehnt sich die CGG-Wiederholungsgröße in einem Vormutations- oder Zwischenallel vermutlich aus, wenn sie von den Eltern auf den Nachwuchs übertragen wird13,14. So sind Träger mit Prämutationsallelen aufgrund der wiederholten Expansion einem hohen Risiko ausgesetzt, Kinder mit FXS zu haben, und in einigen Fällen können Zwischenallele ihre Wiederholungsgröße über zwei Generationen auf den vollen Mutationsbereich ausdehnen15, 16. Darüber hinaus vermitteln Männchen mit Vormutation auch ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung von FX-TAS17,18,19, während Prämutationsweibchen sowohl für FX-TAS als auch FX-POI20prädisponiertsind, 21,22. Kürzlich wurde berichtet, dass autistische Spektrumstörungen mit Entwicklungsverzögerung und Probleme im Sozialen Verhalten bei Kindern mit Vormutation FMR1-Alleles 23,24dargestellt werden.

Um die genaue CGG-Wiederholungsgröße zu bestimmen, ist von großer Bedeutung für die Klassifizierung und Vorhersage der FXS und Fragile X-assoziierten Störungen25,26. Historisch gesehen war die CGG-Repeat-regionsspezifische Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit Fragmentgrößen- und Südfleckanalyse der Goldstandard für die molekulare Profilierung der FMR1 CGG-Wiederholung27. Herkömmliche spezifische PCR ist jedoch weniger empfindlich gegenüber großen Vormutationen mit mehr als 100 bis 130 Wiederholungen und ist nicht in der Lage, vollständige Mutationen zu verstärken27,28. Darüber hinaus kann die Kapillarelektrophorese auf einem herkömmlichen genetischen Analysator für die Wiederholte Dimensionierung FMR1-PCR-Produkte mit mehr als 200 CGG-Wiederholungen nicht erkennen. Die Southern Blot-Analyse ermöglicht die Differenzierung eines größeren Spektrums von Wiederholungsgrößen, von normalen bis zu vollständigen Mutations-Wiederholungszahlen, und wurde häufig zur Bestätigung vollständiger Mutationen (bei Männern) und zur Differenzierung heterozygoter Allele mit einer vollständigen Mutation von scheinbar homozygote Allele mit normalen Wiederholungsgrößen (bei Weibchen). Die Auflösung für die Quantifizierung der Wiederholungen ist jedoch begrenzt. Noch wichtiger ist, dass diese Schritt-für-Schritt-Teststrategie arbeitsintensiv, zeitaufwändig und kostenlos ist.

Hier stellen wir eine genaue und robuste PCR-basierte Methode zur Quantifizierung der CGG-Wiederholungen von FMR1vor. Der erste Schritt dieses Tests ist die PCR-Verstärkung der Wiederholungssequenzen im 5'UTR des FMR1-Promotors mit fragilem X PCR-Kit. Die PCR-Produkte werden gereinigt und die Fragmentgröße wird auf einem mikrofluidischen Kapillarelektrophorese-Instrument durchgeführt, und die anschließende Interpretation der Anzahl der CGG-Wiederholungen mit hilfe der Analysesoftware erfolgt, indem Aufschluss über Standards mit bekannten Wiederholungen auf der Grundlage der Begründung, dass die PCR-Fragmentlänge direkt proportional zur Anzahl der CGG-Wiederholungen ist. Das PCR-System enthält Reagenzien, die die Amplifikation des hochGC-reichen Trinukleotid-Repeat-Bereichs erleichtern. Dieser PCR-basierte Assay ist reproduzierbar und in der Lage, alle Bereiche von CGG-Wiederholungen von FMR1-Promotern zu identifizieren. Dies ist eine kostengünstige Methode, die eine breite Anwendung in der molekularen Diagnose und Screening von FXS und Fragile X-bezogenen Störungen mit weniger Umlaufzeit und Investitionen in Ausrüstung finden kann und somit in einem breiteren Spektrum von klinischen Labors.

Protokoll

Die ethische Zulassung wurde von der Joint Chinese University of Hong Kong–New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee erteilt (Referenznummer: 2013.055)

1. PCR-Verstärkung

  1. Entfernen Sie vor dem Start PCR-Puffermischung, Probenverdünnungs- und DNA-Proben (sowohl Test- als auch Referenz-DNA) (siehe Materialtabelle)aus dem Gefrierschrank von -20 °C und halten Sie sie 20–30 min bei Raumtemperatur, um sicherzustellen, dass alle Reagenzien und DNA vollständig aufgetaut sind. Wirbel und kurz nach unten drehen vor der Verwendung.
  2. Messen Sie die Konzentration der DNA-Proben mit einem Spektralphotometer (siehe Materialtabelle). Die DNA-Konzentration sollte 25 ng/l betragen; falls erforderlich, mit Probenverdünnung auf die entsprechende Konzentration verdünnen.
    HINWEIS: Die DNA sollte extrahiert und gereinigt werden, um störende Substanzen wie Proteine und hohe Salzkonzentrationen zu entfernen. Nicht degradierte, hochwertige DNA sollte für die nachfolgende PCR-Verstärkung und Analyse verwendet werden (A260/A280: 1.8–2.0 und A260/A230: >1.0).
  3. Beschriften Sie Brunnen einer PCR-Platte oder 0,2 ml PCR-Röhren, um Referenz- und getestete DNA-Proben zu identifizieren.
  4. Berechnen Sie die Anzahl der PCR-Reaktionen, die für die Testproben, 2 Referenzproben und negative Kontrollproben erforderlich sind. Bereiten Sie den PCR-Master-Mix vor, indem Sie 15 L PCR-Puffermischung, 2,6 l Probenverdünnungsmittel und 0,4 l Polymerase für jede Reaktion hinzufügen.
    HINWEIS: Eine negative Kontrolle mit Probenverdünnungsmittel ist wichtig, um die PCR-Leistung zu überwachen. Bereiten Sie die PCR-Master-Mischung bei Raumtemperatur, nicht Pipette auf Eis. Der PCR-Puffermix ist viskos. Mischen Sie das Rohr und drehen Sie dann kurz nach unten vor der Verwendung.
  5. Vortex den PCR-Master-Mix von Schritt 1.4 für 10-20 s und Spin-down. Geben Sie langsam 18 l der Mischung in jeden Brunnen oder jedes Rohr.
  6. Wirbel und Spinnen Sie die DNA-Proben. Pipette 2 l jeder DNA in den entsprechenden Brunnen oder Rohr für ein endgültiges PCR-Volumen von 20 l. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten 5 mal.
    HINWEIS: Die Gesamtmenge der DNA pro Reaktion sollte 50–100 ng betragen. DNA-Mengen größer als 150 ng pro 20 L PCR-Reaktion können zu einer schlechten Amplifikation großer Wiederholungsallele führen. Bei niedriger konzentrierten DNAs kann die Menge des Probenverdünnungsmittels im PCR-Mastermix durch eine DNA-Lösung ersetzt werden.
  7. Versiegeln Sie die Platte mit Klebeplattenversiegelung oder mit Rohrkappen.
  8. Legen Sie die versiegelte PCR-Platte oder Die Rohre in den Thermocycler mit beheiztem Deckel. Führen Sie das Programm mit den folgenden Einstellungen aus: 95 °C für 5 min, gefolgt von 25 Denaturierungszyklen bei 98 °C für 35 s, Glühen bei 59 °C für 35 s und Verlängerung bei 72 °C für 4 min; einen letzten Schritt bei 72 °C für 10 min. Halten Sie die PCR-Produkte bei 4 °C im Cycler bis zur Entfernung zur Weiterverarbeitung.
  9. Nach der PCR-Verstärkung die Produkte sofort reinigen und analysieren oder über Nacht bei +2 bis +8 °C lagern. Alternativ kann das Produkt bis zu 30 Tage bei -30 bis -16 °C gelagert werden.

2. Reinigung der PCR-Produkte

  1. Den Inkubator-Shaker auf 65 °C vorheizen.
  2. Fügen Sie für jede PCR-Reaktion 80 L 1x TE-Puffer (siehe Materialtabelle)zu den 20 L jedes PCR-Produkts aus Abschnitt 1 hinzu.
  3. Übertragen Sie das Probengemisch mit einer Mehrkanalpipette in eine PCR-Reinigungsplatte (siehe Materialtabelle).
  4. Halten Sie die Platte freigelegt und legen Sie sie in den Inkubator-Shaker, und bebrüten Sie bei 65 °C, während Sie bei 1.200 Umdrehungen für 10 min schütteln.
  5. Stellen Sie das Vakuumgerät nach der Inkubation auf 250 mbar (oder 25 kPa, 188 mmHg, 7,4 in Hg) und aspirieren Sie die Lösung 15 min durch den Filter. Brunnen sollten keine Flüssigkeit mehr haben.
  6. Den Inkubator-Shaker auf 25 °C abkühlen.
  7. Schalten Sie nach der ersten Aspiration das Vakuum aus und fügen Sie jedem Bohrwert 50 L 1x TE-Puffer hinzu. Nicht mischen. Aspirieren Sie die Lösung für 10 min mit den Vakuumeinstellungen in Schritt 2.5.
  8. Trocknen Sie den Boden der Filterplatte, indem Sie sie fest auf einen Stapel Papiertücher drücken.
  9. Fügen Sie 20 L 1x TE-Puffer in die untere Mitte jedes Brunnens ein. Legen Sie die Platte in den Inkubator-Shaker und brüten Bei 25 °C beim Schütteln bei 1.200 Umdrehungen für 5 Min. ein.
  10. Übertragen Sie nach der Inkubation >15 l jeder gereinigten PCR-DNA von Schritt 2.9 auf eine frische 96-Well-PCR-Platte. Die gereinigte DNA kann direkt analysiert oder alternativ bei -30 bis -16 °C gespeichert werden, bis erforderlich.

3. FragmentGröße von PCR-Produkten

  1. Vor dem Start erlauben SIE DNA-Farbstoffkonzentrat, DNA-Gel-Matrix, DNA-Marker, DNA-Leiter und gereinigte DNA-Proben von Schritt 2 zu Gleichginieren auf Raumtemperatur für 30 min.
  2. Richten Sie die Grundierungsstation ein.
    1. Ersetzen Sie die Spritze (siehe Materialtabelle), wenn Sie eine neue Charge von Reagenzien verwenden.
    2. Stellen Sie die Grundplatte ein, lassen Sie den Hebel des Spritzenclips los und schieben Sie ihn bis zur oberen Position.
  3. Starten Sie die Größensoftware (siehe Tabelle der Materialien) und bereiten Sie den Gel-Dye-Mix vor.
  4. Wirbelfarbstoffkonzentrat für 10 s und Spin-down. Fügen Sie 25 l des Farbstoffs zu einer Gelmatrix-Durchstechflasche hinzu. Wirbel die gemischte Lösung gut und spindown.
    1. Die Gel-Farbstoff-Mischung in einen Spinfilter geben. Den Spinfilter in eine Mikrozentrifuge geben und 10 min bei Raumtemperatur bei 1.500 x g bei 20 % drehen.
      HINWEIS: Schützen Sie die Lösung mit Farbstoff vor Licht und lagern Sie sie nach Gebrauch bei 4 °C. Die Gel-Dye-Mischung kann für ca. 15 Chips verwendet werden, einmal zubereitet. Lassen Sie die Gel-Dye-Mischung vor Gebrauch auf Raumtemperatur für 30 min ausdemieren.
  5. Die Gel-Farbstoff-Mischung aufladen.
    1. Legen Sie einen neuen DNA-Chip auf die Grundierstation ein. Fügen Sie 9 L Gel-Farbstoff-Mix in die gut markierte mit "G" markiert. Bitte stellen Sie sicher, dass der Kolben an der 1 ml-Marke positioniert ist, und schließen Sie dann die Grundierungsstation.
    2. Drücken Sie den Spritzenkolben nach unten, bis er durch den Clip gehalten wird. Warten Sie genau 30 s und geben Sie den Clip dann los. Warten Sie 5 s, und ziehen Sie den Kolben dann langsam zurück in die 1 ml Position.
    3. Öffnen Sie die Grundierstation und fügen Sie 9 L Gel-Farbstoff-Mix in die mit "G" markierten Brunnen hinzu.
  6. Fügen Sie 5 l Marker in den mit dem Leitersymbol markierten Brunnen hinzu und fügen Sie außerdem 5 l Marker in jede der 12 Probenbohrungen ein. Lassen Sie keine Brunnen leer.
  7. Fügen Sie 1 L DNA-Leiter in den mit dem Leitersymbol markierten Brunnen hinzu. Fügen Sie in jedem der 12 Probenbrunnen 1 L PCR-Produkt (gebrauchte Brunnen) aus Schritt 3,1 oder 1 L L Reinstwasser (ungenutzte Brunnen) hinzu. Setzen Sie den Chip horizontal in den Adapter des Wirbelmischers und Wirbels für 1 min an der angegebenen Einstellung (2.400 Rpm).
  8. Legen Sie den Chip in das Bioanalyzer-Instrument ein und führen Sie den Chip innerhalb von 5 min im Instrument aus.
  9. Nachdem der Test abgeschlossen ist, entfernen Sie sofort den verwendeten Chip aus dem Instrument.
  10. Fügen Sie langsam 350 l entionisiertes Wasser in einen der Brunnen des Elektrodenreinigers. Öffnen Sie den Deckel des Bioanalysators und legen Sie den Elektrodenreiniger hinein. Schließen Sie den Deckel und inkubieren Sie ca. 10 s. Öffnen Sie den Deckel und entfernen Sie den Elektrodenreiniger. Warten Sie weitere 10 s, damit das Wasser an den Elektroden verdunstet und schließen Sie dann den Deckel.

4. Analysieren sie die Ergebnisse der Fragmentgröße

HINWEIS: Die Referenzproben sollten von demselben thermischen Cycler und Bioanalyzer in derselben Charge mit den unbekannten Proben verstärkt und analysiert werden.

  1. Nachdem der Bioanalyzer ausgeführt wurde, exportieren Sie die Spitzendaten aus jedem Durchlauf als CSV-Tabellendatei für die nachfolgende Analyse.
  2. Starten Sie die Analysesoftware, und öffnen Sie die exportierte Csv-Spitzentabellendatei aus Schritt 4.1.
  3. Überprüfen Sie über die Registerkarte QC-Menü die Regressionslinie, die an die vier Punkte (als blaue Diamanten auf dem Diagramm dargestellt) aus den beiden Referenzbeispielen angepasst ist. DerR2-Wert der Regressionslinie sollte >0,98 (typische Werte über 0,999) sein.
  4. Überprüfen Sie über die Registerkarte Ergebnisse die Wiederholungsgröße jeder Probe, deren Fragmentlänge(n) automatisch mit der linearen Regressionsstandardkurve dargestellt wird, die von den Referenzstichproben abgeleitet wird. Die Software bietet auch die Klassifizierung jeder Probe nach verschiedenen Richtlinien.
  5. Exportieren Sie über die Registerkarte Export den Ergebnisbericht für jede Stichprobe mit den Wiederholungsnummern und der Diagnoseklassifizierung sowie eine Zusammenfassung der Beispielinformationen und des QC-Berichts für jede Ausführung.
    HINWEIS: Analysesoftware ermöglicht die Verwendung von benutzerdefinierten Klassifizierungsrichtlinien, wie Z. H. American College of Medical Genetics (ACMG) oder Clinical Molecular Genetics Society/ European Society of Human Genetics (CMGS/ESHG) Richtlinien, sowie vordefinierte Klassifizierungen. Kriterien.

Ergebnisse

Die Größenergebnisse der weiblichen Referenzprobe vor der Vormutation (NA20240, Wiederholungsgrößen von 30 und 80) und der vollständigen weiblichen Mutationsreferenzprobe (NA20239, Wiederholungsgrößen von 20 bzw. 200) sind in Abbildung 1A bzw. Abbildung 1Bdargestellt. In der Regel sind zwei Markerspitzen (untere Marker 50 Basenpaare [bp] und obere Marker 10.380 bp) im Fragmentgrößenprofil enthalten. Es gibt in der Regel eine Primer komplexe Spitze mit e...

Diskussion

FXS ist die zweithäufigste Ursache für geistige Beeinträchtigung nach Trisomie 21, die für fast die Hälfte der X-verknüpften mentalen Retardierung30, die etwa 1 von 4.000 Männern und 1 von 8.000 Frauen betreffen kann. Noch wichtiger ist, fast 1 von 250–1.000 Weibchen tragen eine Vormutation, und diese Häufigkeit ist 1 in 250–1.600 bei Männern26,31,32,33. Da ...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Forschung wurde durch Stipendien des NSFC Emergency Management Project (Grant No. 81741004), der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81860272), des Großen Forschungsplans der Provincial Science and Technology Foundation of Guangxi ( Grant-Nr. AB16380219), dem China Postdoctoral Science Foundation Grant (Grant No. 2018M630993) und der Guangxi Natural Science Foundation (Grant No. 2018GXNSFAA281067).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubesAxygenPCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-freeAmbionAM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrumentAgilentG2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR PlateThermo FisherAB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridgeAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixerAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert softwareAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chipsAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent DNA 7500 kitAgilent5067-1506For Fragment sizing
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chipsAgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode CleanerAgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin FilterAgilentSupplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: SyringeAgilentSupplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Chip priming stationAgilent5065-4401Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Cubee Mini-centrifugeGeneReachaqbd-i
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum ManifoldMerck MilliporeMSVMHTS00Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopperMerck MilliporeXX2004718Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pumpMerck MilliporeWP6122050Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vesselMerck MilliporeXX1004705Filter plate vacuum Manifold
FragilEase Fragile X PCR kitPerkinElmer3101-0010For PCR amplification
FragilEase Fragile X PCR kit: Sample DiluentPerkinElmerIn kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )
FragilEase PCR Buffer mixPerkinElmerIn kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward)
FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse)
FragilEase PolymerasePerkinElmerIn kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )
FraXsoft analysis softwarePerkinElmer
NanoDrop ND-2000 SpectrophotometerThermo Fisher
Paper towels
PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plateMACHEREY-NAGEL743100
reference DNA sampleCoriellNA20240 & NA20239
S1000 96-well Thermal CyclerBio-Rad1852196This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti™ 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786)
TriNEST Incubator/Shaker instrumentPerkinElmer1296-0050
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterLife Technologies10977015For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning
Vortex-Genie 2Scientific IndustriesSI-0256 (Model G560E)Conventional vortex mixer

Referenzen

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