JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Fragile X mental retardasyon-1 genindeki sitozin-guanin-guanin trinükleotid tekrarlarının ölçülmesi için doğru ve sağlam polimeraz zincir reaksiyonu esaslı bir test, Kırılgan X sendromu ve Fragile X ile ilişkili moleküler tanı ve taramayı kolaylaştırır daha kısa dönüş süresi ve ekipman yatırımı ile bozukluklar.

Özet

Kırılgan X sendromu (FXS) ve ilişkili bozukluklar, Fragile X mental retardation-1(FMR1)gen organizatörünün 5' çevrilmemiş bölgesinde (UTR) sitozin-guanin-guanin (CGG) trinükleotid tekrarının genişlemesinden kaynaklanır. Geleneksel olarak, genetik bir analizör üzerinde kapiller elektroforez parça analizi FMR1CGG tekrarları boyutlandırma için kullanılır , ancak tekrar sayısı 200 daha yüksek olduğunda tam ölçüm için ek Güney leke analizi gereklidir. Burada, FMR1CGG tekrarlarının sayısallaştırılması için doğru ve sağlam polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı bir yöntem salıyoruz. Bu testin ilk adımı, Kırılgan X PCR kiti kullanılarak FMR1 organizatörü5'UTR'deki tekrar dizilerinin PCR amplifikasyonudur, ardından PCR ürünlerinin saflaştırılması ve mikroakışkan kapiller elektroforez aletinde parça boyutlandırması ve analiz yazılımı kullanarak bilinen tekrarlar ile standartlaratıfta bulunarak CGG tekrarları sayısının sonraki yorumu. Bu PCR tabanlı test tekrarlanabilir ve 200'den fazla (tam mutasyon olarak sınıflandırılır), 55-200 (premutasyon olarak sınıflandırılır), 46-54 (orta) ve 10'dan fazla tekrar numarası na sahip olanlar da dahil olmak üzere FMR1 organizatörlerinin CGG tekrarlarının tüm yelpazesini tanımlayabilme yeteneğine sahiptir ve 10 45 (normal). FXS ve Fragile X ile ilişkili bozuklukların sağlamlık ve hızlı raporlama süresi ile sınıflandırılmasını kolaylaştıran uygun maliyetli bir yöntemdir.

Giriş

Kırılgan X sendromu (FXS) ve Kırılgan X ilişkili bozukluklar, örneğin, titreme ve ataksi sendromu (FX-TAS) ve primer yumurtalık yetmezliği (FX-POI) esas olarak 5' çevrilmemiş trinükleotid tekrar genişleme sitozin-guanin-guanin (CGG) neden olur Xq27.31,2'deKırılgan X mental retardasyon-1(FMR1)geninin bölge (UTR) FMR1 kodlanmış protein (FMRP), mRNA veya modüle sentezin inkbiyotasyon, stabilite ve dendritik taşınmasını düzenleyerek nöronal gelişim ve sinaptik plastisitede işlev veren poliribozom ile ilişkili RNA-bağlayıcı bir proteindir. kısmi postsinaptik proteinlerin3,4,5,6,7.

>200 CGG tekrar boyutu ile dinamik varyasyon tam mutasyon olarak tanımlanır, hangi anormal hipermetilasyon ve FMR1 organizatörü sonraki transkripsiyonel susturma neden olur8. Ortaya çıkan fmrp protein yokluğu veya eksikliği normal nöronal gelişimi bozar veFXSneden 9 , çeşitli klinik belirtiler ile karakterize, şiddetli zihinsel özürlülük orta dahil olmak üzere, gelişimsel gecikme, hiperaktif davranışlar, kötü temas ve otistik belirtileri10,11,12. Kadın FXS hastalarında sunum genellikle erkeklerde olduğundan daha hafiftir. 55-200 ve 45-54 arasında değişen CGG tekrar boyutu sırasıyla premutasyon ve ara durum olarak sınıflandırılır. İstikrarsızlık yüksek derecede nedeniyle, bir premutasyon veya ara alel CGG tekrar boyutu muhtemelenyavru13,14iletildiğinde genişletir . Bu nedenle, premutasyon alelleri olan taşıyıcılar tekrar genişleme nedeniyle FXS etkilenen çocuk sahibi olma riski yüksektir, ve bazı durumlarda, ara aleller iki nesil boyunca tam mutasyon aralığına tekrar boyutunu genişletebilirsiniz15, 16. yıl. Ayrıca, premutasyon ile erkekler de geç başlangıçlı FX-TAS17,18,19gelişme riski iletmek, premutasyon kadın hem FX-TAS ve FX-POI için yatkın iken20, 21,22. Son zamanlarda, bu gelişimsel gecikme ve sosyal davranışlarda sorunlar ile otistik spektrum bozuklukları premutasyon FMR1 alelleri23olan çocuklarda sunulmaktadır bildirilmiştir,24.

Tam CGG tekrar boyutunu belirlemek için sınıflandırma ve FXS ve Kırılgan X ilişkili bozuklukların tahmini için büyük öneme sahiptir25,26. Tarihsel olarak, CGG tekrar bölgeye özgü polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) parça boyutlandırma artı Güney leke analizi ile FMR1 CGG tekrar27moleküler profilleme için altın standart olmuştur. Ancak, geleneksel spesifik PCR 100-130'dan fazla tekrarile büyük premütasyonlara karşı daha az duyarlıdır ve tam mutasyonları yükseltmekten acizdir27,28. Ayrıca, tekrar boyutlandırma için geleneksel bir genetik analizör üzerinde kılcal elektroforez fazla 200 CGG tekrarları ile FMR1 PCR ürünleri tespit etmek için başarısız olur. Güney leke analizi, normalden tam mutasyon tekrar sayılarına kadar daha geniş bir tekrar boyutu aralığının farklılaşmasını sağlar ve tam mutasyonu doğrulamak için (erkeklerde) ve heterozigot alelleri tam mutasyonile ayırt etmek için yaygın olarak kullanılmıştır. normal tekrar boyutları ile görünüşte homozigot aleller (kadınlarda). Ancak, yinelemeleri ölçmek için çözünürlük sınırlıdır. Daha da önemlisi, bu adım adım test stratejisi emek yoğun, zaman alıcı ve maliyet-etkisiz.

Burada, FMR1CGG tekrarları nicelleştirme için doğru ve sağlam PCR tabanlı bir yöntem salıyoruz. Bu testin ilk adımı, Fragile X PCR kitini kullanarak FMR1 organizatörün 5'UTR'deki tekrar dizilerinin PCR yükseltilmesidir. PCR ürünleri saflaştırılır ve parça boyutlandırma bir mikroakışkan kapiller elektroforez aleti üzerinde gerçekleştirilir ve analiz yazılımı kullanılarak CGG tekrarlarının sayısının daha sonra yorumlanması, PCR parça uzunluğunun CGG tekrarlarının sayısıyla doğru orantılı olduğu gerekçesi. PCR sistemi, gc açısından zengin trinükleotid tekrar bölgesinin amplifikasyonunu kolaylaştıran reaktifler içerir. Bu PCR tabanlı test tekrarlanabilir ve FMR1 organizatörleri CGG tekrarları tüm aralıkları tespit yeteneğine sahiptir. Bu daha az dönüş süresi ve ekipman yatırım ile FXS ve Kırılgan X ile ilgili bozuklukların moleküler tanı ve tarama geniş uygulama bulabilirsiniz ve böylece, klinik daha geniş bir yelpazede kullanılabilir maliyet-etkin bir yöntemdir Laboratuvar.

Protokol

Hong Kong Ortak Çin Üniversitesi tarafından etik onay verildi―Yeni Bölgeler Doğu Küme Klinik Araştırma Etik Komitesi (Referans Numarası: 2013.055)

1. PCR amplifikasyon

  1. Başlamadan önce, -20 °C'lik dondurucudan PCR tampon karışımını, numune dilüent ve DNA örneklerini (hem test hem de referans DNA) çıkarın ve tüm reaktiflerin ve DNA'nın tamamen çözülmesini sağlamak için 20-30 dakika oda sıcaklığında tutun. Vorteks ve kısaca kullanmadan önce aşağı spin.
  2. DNA örneklerinin konsantrasyonunu bir spektrofotometre kullanarak ölçün (bkz. Malzeme Tablosu). DNA konsantrasyonu 25 ng/μL olmalıdır; gerekirse uygun konsantrasyona seyreltici numune ile seyreltin.
    NOT: DNA ayıklanır ve proteinler ve yüksek tuz konsantrasyonları gibi müdahale maddeleri kaldırmak için saflaştırılmalıdır. Sonraki PCR amplifikasyon ve analizi için (A260/A280: 1.8-2.0 ve A260/A230: >1.0) bozulmamış, yüksek kaliteli DNA kullanılmalıdır.
  3. Referansı ve test edilmiş DNA örneklerini belirlemek için bir PCR plaka veya 0,2 mL PCR tüplerinin kuyularını etiketleyin.
  4. Test numuneleri, 2 referans örneği ve negatif kontrol numunesi için gerekli PCR reaksiyonlarının sayısını hesaplayın. HER reaksiyon için 15 μL PCR tampon karışımı, 2,6 μL numune dilüent ve 0,4 μL polimeraz ekleyerek PCR Master Mix'i hazırlayın.
    NOT: PCR performansını izlemek için örnek dilüent kullanarak negatif kontrol esastır. PcR ana karışımını oda sıcaklığında hazırlayın, buz üzerinde pipet yapmayın. PCR tampon karışımı viskoz. Tüpü karıştırın ve kullanmadan önce kısa bir süre aşağı doğru döndürün.
  5. Vortex 10-20 s için adım 1.4 PCR ana karışımı ve aşağı spin. Karışımın 18 μL'sini her kuyuya veya tüpe yavaşça dağıtın.
  6. Girdap ve DNA örneklerini aşağı çevir. 20 μL'lik son bir PCR hacmi için her DNA'nın 2 μL'si uygun kuyuya veya tüpe. 5 kez yukarı ve aşağı boru lar atarak karıştırın.
    NOT: Reaksiyon başına toplam DNA miktarı 50-100 ng olmalıdır. 20 μL PCR reaksiyonu başına 150 ng'den büyük DNA miktarları büyük tekrar alellerinin zayıf amplifikasyonuna neden olabilir. Daha düşük konsantre DNA'lar için, PCR ana karışımındaki numune dilüent miktarı DNA çözeltisi ile değiştirilebilir.
  7. Plakayı yapışkan plakalı mühürleyici veya tüp kapaklı kapatın.
  8. Mühürlü PCR plakayı veya tüpleri ısıtmalı kapaklı termal döngüye yerleştirin. Programı aşağıdaki ayarlarla çalıştırın: 5 dk için 95 °C, ardından 98 °C'de 35 s için 25 devir denaturing, 59 °C'de 35 s ve 72 °C'de 4 dk boyunca uzatma; 10 dk. PCR ürünlerini daha fazla işleme için çıkarılana kadar devre arasında 4 °C'de tutun.
  9. PCR amplifikasyonundan sonra ürünleri hemen arındırın ve analiz edin veya bir gecede +2 ila +8 °C'de saklayın. Alternatif olarak, ürün -30 ila -16 °C'de 30 güne kadar saklanabilir.

2. PCR Ürünlerinin Saflaştırılması

  1. Kuvöz çalkalayıcıyı 65 °C'ye önceden ısıtın.
  2. Her PCR reaksiyonu için, bölüm 1'deki her PCR ürününün 20 μL'sine 80°L 1x TE tamponu ekleyin (Malzeme Tablosunabakın).
  3. Örnek karışımı çok kanallı bir pipet kullanarak pcr temizleme plakasına aktarın (Bkz. Malzeme Tablosu).
  4. Plakayı ortaya çıkarın ve kuvöz çalkalayıcının içine yerleştirin ve 10 dakika boyunca 1.200 rpm sallayarak 65 °C'de kuluçkaya yatırın.
  5. Kuluçkadan sonra vakum aleti250 mbar (veya 25 kPa, 188 mmHg, Hg'de 7,4) olarak ayarlayın ve çözeltiyi 15 dk. Kuyular'ın sıvı kalmaması için filtreden aspire edin.
  6. Kuvöz çalkalayıcıyı 25 °C'ye kadar soğutun.
  7. İlk aspirasyondan sonra, vakumu kapatın ve her kuyuya 50°L 1x TE tampon ekleyin. Karıştırmayın. Adım 2.5 vakum ayarlarını kullanarak 10 dk için çözüm aspire.
  8. Filtre plakasının altını kağıt havlu yığınına sıkıca bastırarak kurulayın.
  9. Her kuyunun alt merkezine 20°L 1x TE tampon ekleyin. 5 dakika boyunca 1.200 rpm sallayarak 25 °C'de kuvöz shaker ve kuluçka plaka yerleştirin.
  10. Kuluçkadan sonra, saflaştırılmış her PCR DNA'sının >15 μL'sini adım 2,9'dan yeni bir 96 kuyulu PCR plakasına aktarın. Saflaştırılmış DNA doğrudan analiz edilebilir veya alternatif olarak -30 ila -16 °C'de istenilen ekadar saklanabilir.

3. PCR Ürünlerinin Parça Boyutlandırılması

  1. Başlamadan önce, DNA boyası konsantresi, DNA jel matrisi, DNA markeri, DNA merdiveni ve saflaştırılmış DNA örneklerini adım 2'den 30 dakika oda sıcaklığına kadar dengelemesine izin verin.
  2. Astar istasyonunu kur.
    1. Yeni bir reaktif ler kullanırken şırıngayı değiştirin (Bkz. Malzemeler Tablosu).
    2. Taban plakasını ayarlayın ve şırınga klibinin kolu serbest bırakın ve üst konuma doğru kaydırın.
  3. Boyutlandırma yazılımını başlatın (Bkz. Malzeme Tablosu)ve jel-boya karışımını hazırlayın.
  4. Girdap boya 10 s için konsantre ve aşağı spin. Bir jel matris şişeye boyanın 25 μL'sini ekleyin. Girdap karışık çözüm iyi ve aşağı spin.
    1. Jel-boya karışımını bir spin filtresine aktarın. Spin filtresini mikrosentrifuge yerleştirin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 1.500 x g ± %20 oranında döndü.
      NOT: Çözeltiyi Boya ile ışıktan koruyun ve kullanımdan sonra 4 °C'de saklayın. Jel-boya karışımı yaklaşık 15 cips için bir kez hazırlandıktan için kullanılabilir. Jel-boya karışımı kullanmadan önce her zaman 30 dakika oda sıcaklığına dengelemek için izin verin.
  5. Jel boya karışımını yükleyin.
    1. Astar istasyonuna yeni bir DNA çipi yerleştirin. Kuyuya 9 μL jel boya karışımı ekleyin "G" ile işaretlenmiş. Lütfen pistonun 1 mL işaretine yerleştirdiğinden emin olun ve astar istasyonunu kapatın.
    2. Şırınga pistonuna klip tarafından tutulana kadar bastırın. Tam olarak 30 s bekleyin sonra klibi bırakın. 5 s bekleyin ve sonra yavaş yavaş 1 mL konumuna geri piston çekin.
    3. Astar istasyonunu açın ve "G" ile işaretlenmiş kuyulara 9 μL jel-boya karışımı ekleyin.
  6. Merdiven simgesiyle işaretlenmiş kuyuya 5 μL işaretleyici ekleyin ve ayrıca 12 örnek kuyunun her birine 5 μL marker ekleyin. Kuyuları boş bırakmayın.
  7. Merdiven sembolü ile işaretlenmiş kuyuya 1 μL DNA merdiveni ekleyin. 12 numune kuyunun her birine 3,1 veya 1 μL ultra saf su (kullanılmayan kuyular) adımlarından 1 000 ADET PCR ürünü (kullanılmış kuyular) ekleyin. Çipi belirtilen ayarda (2.400 rpm) 1 dakika boyunca girdap karıştırıcıve girdap adaptörüne yatay olarak koyun.
  8. Çipi biyoanalizör aletine yerleştirin ve çipi 5 dakika içinde alete çalıştırın.
  9. Titretamamı tamamlandıktan sonra, kullanılan çipi hemen cihazdan çıkarın.
  10. Elektrot temizleyicisinin kuyularından birine yavaşça 350 μL deiyonize su ekleyin. Biyoanalizörün kapağını açın ve elektrot temizleyicisini içine yerleştirin. Kapağı kapatın ve yaklaşık 10 s. Kapağı açın ve elektrot temizleyici çıkarın. Elektrotlar üzerindeki suyun buharlaşmasını sağlamak için 10 s daha bekleyin ve kapağı kapatın.

4. Parça Boyutlandırma Sonuçlarını Analiz Etme

NOT: Referans numuneler, bilinmeyen numunelerle aynı toplu olarak aynı termal döngücü ve biyoanalizör tarafından güçlendirilmeli ve analiz edilmelidir.

  1. Bioanalyzer çalışması tamamlandıktan sonra, sonraki çözümleme için her çalıştırmadaki en yüksek verileri .csv tablo dosyası olarak dışa aktarın.
  2. Analiz yazılımını başlatın ve dışa aktarılan .csv tepe tablosu dosyasını adım 4.1'den açın.
  3. QC menü sekmesi aracılığıyla, iki referans örneğinden dört noktaya (arsa üzerinde mavi elmas olarak gösterilir) monte edilen regresyon çizgisini gözden geçirin. Regresyon çizgisinin R2 değeri >0.98 olmalıdır (tipik değerler 0.999'u aşar).
  4. Sonuçlar menüsü sekmesi nden, parça uzunluğu(lar) referans örneklerinden türetilen doğrusal regresyon standart eğrisine göre otomatik olarak çizilen her numunenin yinelenen boyutunu kontrol edin. Yazılım aynı zamanda her numunenin farklı yönergelere göre sınıflandırını sağlar.
  5. Dışa Aktarma menüsü sekmesi aracılığıyla, her örnek için sonuç raporunu yinelenen sayılar ve tanılama sınıflandırması ile birlikte her çalıştırma için örnek bilgilerin ve QC raporunun bir özetini dışa aktarın.
    NOT: Analiz yazılımı, American College of Medical Genetics (ACMG) veya Clinical Molecular Genetics Society/ European Society of Human Genetics (CMGS/ESHG) yönergeleri ve önceden tanımlanmış sınıflandırma gibi özel sınıflandırma kılavuzlarının kullanılmasına olanak sağlar. Ölçüt.

Sonuçlar

Mutasyon öncesi kadın referans örneğinin boyutlandırma sonuçları (NA20240, 30 ve 80 tekrar boyutları) ve tam mutasyon kadın referans örneği (NA20239, 20 ve 200 tekrar boyutları) sırasıyla Şekil 1A ve Şekil 1B'degösterilmiştir. Tipik olarak, parça boyutu profilinde iki işaretçi tepe noktası (alt marker 50 baz çifti [bp] ve üst marker 10.380 bp) yer almaktadır. Genellikle yaklaşık 95 bp boyutu ile bir astar karmaşık zirve vardır. Refe...

Tartışmalar

FXS trizomi sonra entelektüel bozukluğun ikinci en sık nedenidir 21, X bağlı zeka geriliği yaklaşık yarısı için muhasebe30, yaklaşık 1 etkileyebilir 4,000 erkek ve 1 8.000 kadın. Daha da önemlisi, yaklaşık 1 250-1.000 kadın bir premutasyon taşımak, ve bu frekans 1 250-1.600 erkeklerde26,31,32,33. CGG'nin premutasyon alelleri yavrulara iletildiğinde t...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu araştırma NSFC Acil Durum Yönetimi Projesi (Hibe No. 81741004), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 81860272), Guangxi İl Bilim ve Teknoloji Vakfı Ana Araştırma Planı hibe tarafından desteklenmiştir ( Hibe No AB16380219), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı Hibe (Grant No. 2018M630993) ve Guangxi Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No. 2018GXNSFAA281067).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubesAxygenPCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1x TE buffer, pH 8.0, Rnase-freeAmbionAM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrumentAgilentG2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR PlateThermo FisherAB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridgeAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixerAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert softwareAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chipsAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent DNA 7500 kitAgilent5067-1506For Fragment sizing
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chipsAgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode CleanerAgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin FilterAgilentSupplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: SyringeAgilentSupplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Chip priming stationAgilent5065-4401Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Cubee Mini-centrifugeGeneReachaqbd-i
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum ManifoldMerck MilliporeMSVMHTS00Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopperMerck MilliporeXX2004718Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pumpMerck MilliporeWP6122050Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vesselMerck MilliporeXX1004705Filter plate vacuum Manifold
FragilEase Fragile X PCR kitPerkinElmer3101-0010For PCR amplification

Referanslar

  1. Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
  2. Fu, Y. H., et al. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox. Cell. 67, 1047-1058 (1991).
  3. Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses. Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).
  4. Didiot, M. C., et al. The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer. Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).
  5. Bechara, E. G., et al. A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation. PLoS Biology. 7, e16 (2009).
  6. Ascano, M., et al. FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression. Nature. 492, 382-386 (2012).
  7. Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).
  8. Oberle, I., et al. Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. Science. 252, 1097-1102 (1991).
  9. Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. Fragile X syndrome and targeted treatment trials. Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).
  10. Hatton, D. D., et al. Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP. American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).
  11. Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families. Human Genetics. 59, 281-289 (1981).
  12. Backes, M., et al. Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data. American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).
  13. Nolin, S. L., et al. Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010. Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).
  14. Nolin, S. L., et al. Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles. American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).
  15. Fernandez-Carvajal, I., et al. Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations. Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).
  16. Terracciano, A., et al. Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations. European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).
  17. Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. Advances in understanding the molecular basis of FXTAS. Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).
  18. Juncos, J. L., et al. New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS). Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).
  19. Hagerman, R. J., et al. Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X. Neurology. 57, 127-130 (2001).
  20. Conway, G. S. Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update. Annales d'endocrinologie. 71, 215-217 (2010).
  21. Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. Fragile X premutations in familial premature ovarian failure. Lancet. 346, 309-310 (1995).
  22. Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation. European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).
  23. Bourgeois, J. A., et al. A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective. Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).
  24. Farzin, F., et al. Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation. Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).
  25. Hantash, F. M., et al. FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States. Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).
  26. Kraan, C. M., et al. FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts. Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).
  27. Saul, R. A., Tarleton, J. C. FMR1-Related Disorders. GeneReviews. , (2012).
  28. Amos Wilson, J., et al. Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study. Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).
  29. Kwok, Y. K., et al. Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats. Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).
  30. Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene--and implications for the population genetics of the fragile X syndrome. American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).
  31. Tassone, F., et al. FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States. Genome Medicine. 4, 100 (2012).
  32. Dombrowski, C., et al. Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles. Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).
  33. Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis. Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).
  34. Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. Recent advances in assays for the fragile X-related disorders. Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).
  35. Seltzer, M. M., et al. Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample. American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).
  36. Hayward, B. E., Usdin, K. Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders. Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).
  37. Orrico, A., et al. Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case. American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).
  38. Schmucker, B., Seidel, J. Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males. American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

GenetikSay 151Polimeraz zincir reaksiyonumikroak kan kapiller elektroforezsitozin guanin guanin tekrarlartrin kleotidK r lgan X mental retardasyon 1promot rk r lgan X sendromutam mutasyonpremutasyon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır