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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Un accurato e robusto saggio basato sulla reazione basato sulla reazione della catena di polimerasi per quantificare le ripetizioni della trinucleotide della citosina-guanina-guanina nel gene del ritardo mentale Fragile X-1 facilita la diagnosi molecolare e lo screening della sindrome di Fragile X e della Fragile X-correlati con tempi di consegna più brevi e investimenti in attrezzature.

Abstract

Sindrome X fragile (FXS) e disturbi associati sono causati dall'espansione della citosina-guanina-guanina (CGG) trinucleotide ripetere nella regione non tradotta 5' del promotore genico di ritardo mentale Fragile X-1(FMR1). Convenzionalmente, l'analisi del frammento di elettroforesi capillare su un analizzatore genetico viene utilizzata per il dimensionamento delle ripetizioni CGG di FMR1, ma è necessaria un'ulteriore analisi della macchia meridionale per la misurazione esatta quando il numero di ripetizione è superiore a 200. Qui, presentiamo un metodo accurato e robusto a catena di polimerasi (PCR) per la quantificazione delle ripetizioni CGG di FMR1. Il primo passo di questo test è l'amplificazione PCR delle sequenze ripetute nel 5'UTR del promotore FMR1 utilizzando un kit PCR X fragile, seguita dalla purificazione dei prodotti PCR e dal dimensionamento dei frammenti su uno strumento microfluidico di elettroforesi capillare, e successiva interpretazione del numero di ripetizioni CGG facendo riferimento a standard con ripetizioni note utilizzando il software di analisi. Questa prova basata su PCR è riproducibile e in grado di identificare l'intera gamma di ripetizioni CGG dei promotori FMR1, comprese quelle con un numero ripetuto di più di 200 (classificate come mutazione completa), da 55 a 200 (premutazione), da 46 a 54 (intermedio) e 10 a 45 (normale). Si tratta di un metodo conveniente che facilita la classificazione dei disturbi associati a FXS e Fragile X con robustezza e tempi di segnalazione rapidi.

Introduzione

Sindrome di Fragile X (FXS) e fragili X disturbi associati, ad esempio, tremore e sindrome di atassia (FX-TAS), e insufficienza ovarica primaria (FX-POI) sono principalmente causati da citosina-guanina-guanina (CGG) espansione trinucleotide nel 5' non traducibile (UTR) del gene fragile X ritardo mentale-1 (FMR1) su Xq27.31,2. La proteina codificata FMR1 (FMRP) è una proteina legante all'RNA associata al poliriboso che funziona nello sviluppo neuronale e nella plasticità sinaptica regolando lo splicing alternativo, la stabilità e il trasporto dendritico di mRNA o modulando la sintesi di proteine postanitiche parziali3,4,5,6,7.

La variazione dinamica con una dimensione di ripetizione CGG di >200 è descritta come mutazione completa, che induce l'ipermetilazione aberrante e il successivo silenziamento trascrizionale del promotore FMR1 8. L'assenza o la mancanza della proteina FMRP interrompe il normale sviluppo neuronale e provoca FXS9, caratterizzato da vari sintomi clinici, tra cui disabilità intellettiva da moderata a grave, ritardo dello sviluppo, comportamenti iperattivi, contatti poveri e manifestazioni autistiche10,11,12. La presentazione in pazienti FXS femminili è generalmente più lieve di quella nei maschi. Le dimensioni di ripetizione CGG che vanno da 55 a 200 e da 45 a 54 sono classificate rispettivamente come premutation e status intermedio. A causa dell'elevato grado di premutabilità, la dimensione di ripetizione CGG in un allele intermedio si espande presumibilmente quando viene trasmessa dai genitori alla prole13,14. Così, i portatori con alleli di premutazione sono ad alto rischio di avere bambini affetti da FXS a causa dell'espansione di ripetizione, e in alcuni casi, gli alleli intermedi possono espandere la loro dimensione di ripetizione all'intera gamma di mutazioni su due generazioni15, 16. Inoltre, i maschi con premutazione trasmettono anche un aumento del rischio di sviluppare FX-TAS17ad esordiotardivo,18,19, mentre le donne premutation sono predisposte sia per FX-TAS che per FX-POI20, 21,22. Recentemente, è stato riferito che disturbi dello spettro autistico con ritardo dello sviluppo e problemi nei comportamenti sociali sono presentati nei bambini con arili FMR1 premutation23,24.

Per determinare l'esatta dimensione di ripetizione CGG è di grande importanza per la classificazione e la previsione dei disturbi ASSOCIATI a X FXS e Fragile25,26. Storicamente, la reazione a catena di polimerasi (PCR) ripetuta CGG con il dimensionamento dei frammenti più l'analisi delle macchie meridionali è stato il gold standard per la profilazione molecolare della ripetizione FMR1 CGG27. Tuttavia, la PCR specifica tradizionale è meno sensibile alle grandi premutazioni con più di 100-130 ripetizioni ed è incapace di amplificare le mutazioni complete27,28. Inoltre, l'elettroforesi capillare su un analizzatore genetico tradizionale per il dimensionamento ripetuto non riesce a rilevare i prodotti PCR FMR1 con più di 200 ripetizioni CGG. L'analisi meridionale delle macchie consente la differenziazione di una gamma più ampia di dimensioni di ripetizione, dai numeri di ripetizione della mutazione normale a quella completa, ed è stata ampiamente utilizzata per confermare le mutazioni complete (nei maschi) e differenziare gli alleli eterozigoli con una mutazione completa alleli apparentemente omozici con dimensioni di ripetizione normali (nelle femmine). Tuttavia, la risoluzione per quantificare le ripetizioni è limitata. Ancora più importante, questa strategia di test passo-passo è laboriosa, dispendiosa in termini di tempo e inefficace in termini di costi.

Qui, presentiamo un metodo preciso e robusto basato su PCR per la quantificazione delle ripetizioni CGG di FMR1. Il primo passo di questo test è l'amplificazione PCR delle sequenze ripetute nel 5'UTR del promotore FMR1 utilizzando il kit FRAGILE X PCR. I prodotti PCR vengono purificati e il dimensionamento dei frammenti viene eseguito su uno strumento di elettroforesi capillare microfluidica, e la successiva interpretazione del numero di ripetizioni CGG utilizzando il software di analisi facendo riferimento a standard con ripetizioni note basate sul logica che la lunghezza del frammento PCR è direttamente proporzionale al numero di ripetizioni CGG. Il sistema PCR include reagenti che facilitano l'amplificazione della regione di ripetizione trinucleotide altamente ricca di GC. Questa prove basata su PCR è riproducibile e in grado di identificare tutte le gamme di ripetizioni CGG dei promotori FMR1. Si tratta di un metodo conveniente che può trovare un'ampia applicazione nella diagnosi molecolare e nello screening di disturbi FXS e X fragili con meno tempi di consegna e investimenti in attrezzature e, quindi, può essere utilizzato in un più ampio spettro di malattie cliniche Laboratori.

Protocollo

L'approvazione etica è stata concessa dalla Joint Chinese University of Hong Kong - Comitato etico per la ricerca clinica dei nuovi territori (numero di riferimento: 2013.055)

1. Amplificazione PCR

  1. Prima di iniziare, rimuovere il mix di buffer PCR, i campioni didiluenti e i campioni di DNA (sia il test che il DNA di riferimento) (vedi la tabella dei materiali)dal congelatore -20 gradi centigradi e conservarli a temperatura ambiente per 20-30 min per assicurarsi che tutti i reagenti e il DNA siano completamente scongelati. Vortice e brevemente girare verso il basso prima dell'uso.
  2. Misurare la concentrazione dei campioni di DNA utilizzando uno spettrofotometro (vedere Tabella dei materiali). La concentrazione del DNA deve essere di 25 ng/L; diluire con campione diluente alla concentrazione appropriata, se necessario.
    NOT: Il DNA deve essere estratto e purificato per rimuovere le sostanze interferenti, come proteine e alte concentrazioni di sale. Il DNA non degradato e di alta qualità deve essere utilizzato per la successiva amplificazione e analisi PCR (A260/A280: 1.8–2.0 e A260/A230: >1.0).
  3. Etichettare i pozze di una piastra PCR o di tubi PCR da 0,2 mL per identificare i campioni di DNA di riferimento e testati.
  4. Calcolare il numero di reazioni PCR necessarie per i campioni di prova, 2 campioni di riferimento e campioni di controllo negativi. Preparare la PCR Master Mix sommando 15 l of PCR buffer mix, 2,6 litri di diluente del campione e 0,4 l di polimerasi per ogni reazione.
    NOT: Un controllo negativo che utilizza il diluente del campione è essenziale per monitorare le prestazioni pcR. Preparare il mix master PCR a temperatura ambiente, NON pipetta sul ghiaccio. Il mix di buffer PCR è viscoso. Mescolare il tubo e poi ruotare brevemente verso il basso prima dell'uso.
  5. Vortex il master mix PCR da passo 1.4 per 10–20 s e spin down. Distribuiscono lentamente 18 l della miscela in ogni pozzo o tubo.
  6. Vortex e far girare giù i campioni di DNA. Pipetta 2 - L di ogni DNA nel pozzo appropriato o tubo per un volume PCR finale di 20 .L. Mescolare pipetting su e giù 5 volte.
    NOT: La quantità totale di DNA per reazione dovrebbe essere 50-100 ng. Quantità di DNA superiori a 150 ng per 20 : la reazione PCR può provocare una scarsa amplificazione di grandi alleli di ripetizione. Per le DNA a basso concentrato, la quantità di campione diluente nel mix master PCR può essere sostituita da una soluzione di DNA.
  7. Sigillare la piastra con il sigillante adesivo o con tappi a tubo.
  8. Collocare la piastra PCR sigillata o i tubi nel circolatore termico con coperchio riscaldato. Eseguire il programma con le seguenti impostazioni: 95 s per 5 min, seguito da 25 cicli di denatura a 98 gradi centigradi per 35 s, annealing a 59 s per 35 s, ed estensione a 72 s per 4 min; un passo finale a 72 s per 10 min. Tenere i prodotti PCR a 4 gradi centigradi nel ciclore fino alla rimozione per un'ulteriore lavorazione.
  9. Dopo l'amplificazione della PCR, purificare e analizzare immediatamente i prodotti, o conservarli a 2 o 8 gradi centigradi durante la notte. In alternativa, il prodotto può essere conservato per un massimo di 30 giorni a -30 a -16 gradi centigradi.

2. Purificazione dei prodotti PCR

  1. Preriscaldare lo shaker dell'incubatore a 65 gradi centigradi.
  2. Per ogni reazione PCR, aggiungere 80 L di 1x TE buffer (vedere la Tabella dei Materiali) al 20 l di ogni prodotto PCR dalla sezione 1.
  3. Trasferire la miscela del campione in una piastra di pulizia PCR (vedere Tabella dei materiali)utilizzando una pipetta multicanale.
  4. Tenere la piastra scoperta e metterla nello shaker dell'incubatrice, e incubare a 65 gradi centigradi mentre si agita a 1.200 giri/mm per 10 min.
  5. Dopo l'incubazione, impostare lo strumento a vuoto a 250 mbar (o 25 kPa, 188 mmHg, 7,4 in Hg) e aspirare la soluzione attraverso il filtro per 15 min.
  6. Raffreddare lo shaker dell'incubatrice fino a 25 gradi centigradi.
  7. Dopo la prima aspirazione, spegnere il vuoto e aggiungere 50 loff di 1 1 x buffer TE ad ogni pozzo. Non mescolare. Aspirare la soluzione per 10 min utilizzando le impostazioni di vuoto nel passaggio 2.5.
  8. Asciugare il fondo della piastra di filtro premendolo saldamente su una pila di asciugamani di carta.
  9. Aggiungere 20 l di 1x TE buffer nel centro inferiore di ogni pozzo. Collocare la piastra nello shaker dell'incubatore e incubare a 25 gradi centigradi agitando a 1.200 giri al secondo per 5 min.
  10. Dopo l'incubazione, trasferire >15 l di ogni DNA PCR purificato dal passo 2.9 a una piastra PCR fresca 96-well. Il DNA purificato può essere analizzato direttamente, o in alternativa può essere conservato a -30 a -16 gradi centigradi fino a quando richiesto.

3. Frammento di dimensionamento dei prodotti PCR

  1. Prima di iniziare, consentire il concentrato di colorante del DNA, la matrice del gel di DNA, il marcatore del DNA, la scalata del DNA e i campioni di DNA purificato dal punto 2 all'equilibrate a temperatura ambiente per 30 min.
  2. Impostare la stazione di innesco.
    1. Sostituire la siringa (vedere Tabella dei materiali) quando si utilizza un nuovo batch di reagenti.
    2. Regolare la piastra di base, rilasciare la leva della clip di siringa e farla scorrere fino alla posizione superiore.
  3. Avviare il software di dimensionamento (vedere Tabella dei materiali)e preparare il mix gel-dye.
  4. Vortex tinrito concentrato per 10 s e girare verso il basso. Aggiungere 25 - L del colorante ad una fiala a matrice di gel. Vorticare bene la soluzione mista e girare verso il basso.
    1. Trasferire il mix gel-dye su un filtro di spin. Posizionare il filtro di spin in una microcentrifuga e ruotare per 10 min a temperatura ambiente a 1.500 x g - 20%.
      NOT: Proteggere la soluzione con tintura dalla luce e conservare a 4 gradi centigradi dopo l'uso. Il mix gel-dye può essere utilizzato per circa 15 chip una volta preparato. Lasciare che il mix gel-dye eguaglia a temperatura ambiente per 30 min ogni volta prima dell'uso.
  5. Caricare il mix gel-dye.
    1. Inserire un nuovo chip di DNA sulla stazione di innesco. Aggiungere 9 oL di miscela gel-dye nel pozzo marcato con "G". Assicurarsi che lo stantuffo sia posizionato in corrispondenza del contrassegno di 1 mL, quindi chiudere la stazione di innesco.
    2. Premere lo stantuffo della siringa fino a quando non viene tenuta dalla clip. Attendere esattamente 30 s quindi rilasciare la clip. Attendere 5 s, e poi tirare lentamente lo stantuffo di nuovo alla posizione 1 mL.
    3. Aprire la stazione di innesco e aggiungere 9 oL di gel-dye mix nei pozzi contrassegnati con "G".
  6. Aggiungete 5 l di pennarello nel pozzo contrassegnato con il simbolo della scala e aggiungete anche 5 l' di marker in ciascuno dei 12 pozze campione. Non lasciare alcun pozzo vuoto.
  7. Aggiungete 1 : L di scala del DNA nel pozzo contrassegnato con il simbolo della scala. Aggiungete 1 - L di prodotto PCR (pozzi usati) dal passo 3.1 o 1 - L di acqua ultrapura (pozzi inutilizzati) in ciascuno dei 12 pozze campione. Mettere il chip orizzontalmente nell'adattatore del miscelatore vortice e vortice per 1 min all'impostazione indicata (2.400 rpm).
  8. Inserire il chip nello strumento di bioanalisi ed eseguire il chip nello strumento entro 5 min.
  9. Al termine del test, rimuovere immediatamente il chip usato dallo strumento.
  10. Aggiungere lentamente 350 l di acqua deionizzata in uno dei pozzi del pulitore dell'elettrodo. Aprire il coperchio del bio/resi/re e posizionare il detergente elettrodo in esso. Chiudere il coperchio e incubare per circa 10 s. Aprire il coperchio e rimuovere il pulitore di elettrodo. Attendere altri 10 s per consentire all'acqua degli elettrodi di evaporare e quindi chiudere il coperchio.

4. Analizzare i risultati del dimensionamento dei frammenti

NOT: I campioni di riferimento devono essere amplificati e analizzati dallo stesso ciclonte termico e bioanalizzatore nello stesso lotto con i campioni sconosciuti.

  1. Al termine dell'esecuzione del bioanalizzatore, esportare i dati di picco da ogni esecuzione come file di tabella CSV per l'analisi successiva.
  2. Avviare il software di analisi e aprire il file della tabella di picco .csv esportato dal passaggio 4.1.
  3. Tramite la scheda del menu QC, rivedere la retta di regressione adattata ai quattro punti (mostrati come diamanti blu sul grafico) dai due campioni di riferimento. Il valore R2 della retta di regressione deve essere >0.98 (i valori tipici superano 0,999).
  4. Tramite la scheda del menu Risultati, controllare la dimensione di ripetizione di ogni campione la cui lunghezza(e) di frammento viene tracciata automaticamente rispetto alla curva standard di regressione lineare derivata dai campioni di riferimento. Il software fornisce anche la classificazione di ogni campione in base alle diverse linee guida.
  5. Tramite la scheda del menu Esporta, esportare il report dei risultati per ogni campione con i numeri di ripetizione e la classificazione diagnostica, nonché un riepilogo delle informazioni di esempio e del report QC per ogni esecuzione.
    NOT: Il software di analisi consente l'uso di linee guida di classificazione personalizzate, come le linee guida dell'American College of Medical Genetics (ACMG) o della Clinical Molecular Genetics Society/European Society of Human Genetics (CMGS/ESHG), nonché la classificazione predefinita Criteri.

Risultati

I risultati di dimensionamento del campione di riferimento femminile di premutazione (NA20240, dimensioni di ripetizione di 30 e 80) e del campione di riferimento femminile di mutazione completa (NA20239, dimensioni ripetute di 20 e 200) sono illustrati rispettivamente nella Figura 1A e nella Figura 1B. In genere, due picchi marcatori (marcatore inferiore 50 coppie di base [bp] e marcatore superiore 10.380 bp) sono inclusi nel profilo dimensione del frammento. D...

Discussione

FXS è la seconda causa più comune di compromissione intellettuale dopo la trisomia 21, che rappresenta quasi la metà del ritardo mentale X-linked30, che può colpire circa 1 su 4.000 maschi e 1 su 8.000 femmine. Ancora più importante, quasi 1 su 250-1.000 femmine portano una premutation, e questa frequenza è 1 in 250–1,600 nei maschi26,31,32,33. Poiché il rischio...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni del NSFC Emergency Management Project (Grant no. N. di sovvenzione AB16380219), la China Postdoctoral Science Foundation Grant (Grant no. 2018M630993) e la Guangxi Natural Science Foundation (Grant No. 2018GXNSFAA281067).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubesAxygenPCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-freeAmbionAM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrumentAgilentG2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR PlateThermo FisherAB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridgeAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixerAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert softwareAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chipsAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent DNA 7500 kitAgilent5067-1506For Fragment sizing
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chipsAgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode CleanerAgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin FilterAgilentSupplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: SyringeAgilentSupplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Chip priming stationAgilent5065-4401Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Cubee Mini-centrifugeGeneReachaqbd-i
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum ManifoldMerck MilliporeMSVMHTS00Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopperMerck MilliporeXX2004718Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pumpMerck MilliporeWP6122050Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vesselMerck MilliporeXX1004705Filter plate vacuum Manifold
FragilEase Fragile X PCR kitPerkinElmer3101-0010For PCR amplification
FragilEase Fragile X PCR kit: Sample DiluentPerkinElmerIn kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )
FragilEase PCR Buffer mixPerkinElmerIn kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward)
FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse)
FragilEase PolymerasePerkinElmerIn kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )
FraXsoft analysis softwarePerkinElmer
NanoDrop ND-2000 SpectrophotometerThermo Fisher
Paper towels
PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plateMACHEREY-NAGEL743100
reference DNA sampleCoriellNA20240 & NA20239
S1000 96-well Thermal CyclerBio-Rad1852196This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti™ 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786)
TriNEST Incubator/Shaker instrumentPerkinElmer1296-0050
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterLife Technologies10977015For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning
Vortex-Genie 2Scientific IndustriesSI-0256 (Model G560E)Conventional vortex mixer

Riferimenti

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