АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Точный и надежный полимеразы цепной реакции на основе анализ для количественной цитозин-гуанин-гуанин тринуклеотид повторяется в хрупкий X умственной отсталости-1 ген облегчает молекулярную диагностику и скрининг хрупкий X синдром и хрупкие X-связанных расстройства с более коротким временем оборота и инвестициями в оборудование.

Аннотация

Хрупкий X синдром (FXS) и связанные с ним расстройства вызваны расширением цитозин-гуанин-гуанин (CGG) тринуклеотид повторить в 5' непереведенных региона (UTR) хрупкой X умственной отсталости-1 (FMR1) гена промоутер. Условно, анализ фрагмента капиллярного электрофореза на генетическом анализе используется для калибровки CGG повторяет FMR1, но дополнительный анализ южной поточности требуется для точного измерения, когда число повторений выше 200. Здесь мы представляем точный и надежный полимеразной цепной реакции (PCR) на основе метода количественной оценки CGG повторяет FMR1. Первым шагом этого теста является пЧР усиление повторяющихся последовательностей в 5'UTR промоутера FMR1 с использованием хрупких X PCR комплект, а затем очистка продуктов ПЦР и размер фрагментов на микрофлюидных капиллярных электрофореза инструмент, и последующее толкование числа cGG повторяется по ссылкам стандартов с известными повторами с использованием программного обеспечения анализа. Этот анализ на основе ПЦР воспроизводим и способен определить весь спектр CGG повторов промоутеров FMR1, в том числе с повторным числом более 200 (классифицируется как полная мутация), от 55 до 200 (премутация), от 46 до 54 (промежуточные), и от 10 до 45 (нормально). Это экономически эффективный метод, который облегчает классификацию FXS и хрупких X-связанных расстройств с надежностью и быстрым временем отчетности.

Введение

Хрупкий X синдром (FXS) и Хрупкие X связанных расстройств, например, тремор и синдром атаксии (FX-TAS), и первичной недостаточности яичников (FX-POI) в основном вызваны цитозин-гуанин-гуанин (CGG) тринуклеотид повторить расширение в 5 'непереведенных области (UTR) хрупкой X умственной отсталости-1(FMR1) гена на Xq27.31,2. FMR1 закодированный белок (FMRP) является полирибоом связанных РНК-связывающий белок, который функционирует в развитии нейронов и синаптической пластичности путем регулирования альтернативного сплайсинга, стабильности и дендритной транспортировки мРНК или модулирующий синтез частичных постсинаптических белков3,4,5,6,7.

Динамический вариант с CGG повторить размер йgt;200 описывается как полная мутация, которая вызывает аномальные гиперметилирования и последующего транскрипционного глушить FMR1 промоутер8. В результате отсутствие или отсутствие белка FMRP нарушает нормальное развитие нейронов и вызывает FXS9, характеризуется различными клиническими симптомами, в том числе умеренной до тяжелой умственной неполноценности, задержки развития, гиперактивного поведения, плохие контакты и аутичные проявления10,11,12. Презентация у женщин FXS пациентов, как правило, мягче, чем у мужчин. Размер повтора CGG в диапазоне от 55 до 200 и 45 до 54 классифицируются как премутационный и промежуточный статус, соответственно. Из-за высокой степени нестабильности, CGG повторить размер в премутации или промежуточный аллель предположительно расширяется при передаче от родителей к потомству13,14. Таким образом, носители с аллелями премутации подвергаются высокому риску иметь детей, пострадавших от FXS из-за повторного расширения, а в некоторых случаях, промежуточные аллели могут расширить их размер повторения до полного диапазона мутации в течение двух поколений15, 16. Кроме того, мужчины с премутацией также передать повышенный риск развития позднего начала FX-TAS17,18,19, в то время как премутации женщины предрасположены как fx-TAS и FX-POI20, 21,22. Недавно было сообщено, что расстройства аутистического спектра с задержкой развития и проблемы в социальном поведении представлены у детей с перестановкой FMR1 аллелей23,24.

Для определения точного cGG повторить размер имеет большое значение для классификации и прогнозирования FXS и хрупкие X-ассоциированных расстройств25,26. Исторически сложилось так, что CGG повторить регион-специфических полимеразы цепной реакции (PCR) с размером фрагмента плюс анализ южной подевой были золотым стандартом для молекулярного профилирования FMR1 CGG повторить27. Тем не менее, традиционные специфические ПЦР менее чувствительны к большим премутации с более чем 100 до 130 повторов и не способен к усилению полной мутации27,28. Кроме того, капиллярный электрофорез на традиционном генетическом анализаторе для повторного калибровки не обнаруживает продукты ПЦР FMR1 с более чем 200 cGG повторами. Анализ южной подётой поля позволяет дифференизировать более широкий диапазон повторяющихся размеров, от нормальных до полных мутаций повторяющихся чисел, и широко используется для подтверждения полных мутаций (у мужчин) и дифференциации гетерозиготных аллелей с полной мутацией от по-видимому гомозиготные аллели с нормальными размерами повтора (у женщин). Однако резолюция для количественной оценки повторов ограничена. Что еще более важно, эта пошаговая стратегия тестирования является трудоемкой, трудоемкой и неэффективной с точки зрения затрат.

Здесь мы представляем точный и надежный метод на основе ПЦР для количественной оценки CGG повторов FMR1. Первым шагом этого теста является pcR усиление повторяющихся последовательностей в 5'UTR промоутера FMR1 с использованием хрупких X PCR комплект. Продукты ПЦР очищаются, а размер фрагментов выполняется на микрофлюидном инструменте электрофорасиса капилляров, а последующая интерпретация количества CGG повторяется с помощью программного обеспечения анализа, ссылаясь на стандарты с известными повторами, основанными на обоснование того, что длина фрагмента ПЦР прямо пропорциональна количеству повторов CGG. Система ПЦР включает в себя реагенты, которые облегчают усиление высоко богатой ГК области тринуклеотида. Этот ПЦР-ассес воспроизводим и способен идентифицировать все диапазоны CGG повторов промоутеров FMR1. Это экономически эффективный метод, который может найти широкое применение в молекулярной диагностики и скрининга FXS и хрупких X связанных расстройств с меньшим оборотом вокруг времени и инвестиций в оборудование и, таким образом, могут быть использованы в более широком спектре клинических Лаборатории.

протокол

Этические утверждения были предоставлены Объединенным китайским университетом Гонконга и Новых территорий Восточного кластера клинических исследований комитета по этике (Справочный номер: 2013.055)

1. Усиление ПЦР

  1. Перед началом, удалить ПЦР буферсмесь, образец разбавитель и образцы ДНК (как тест и ссылка ДНК) (см. таблицу материалов) из -20 qC морозильник и держать их при комнатной температуре в течение 20-30 минут, чтобы убедиться, что все реагенты и ДНК полностью разморожены. Вихрь и кратко спина вниз перед использованием.
  2. Измерьте концентрацию образцов ДНК с помощью спектрофотометра (см. Таблицу Материалов). Концентрация ДНК должна быть 25 нг/Л; разбавить образец разбавитель до соответствующей концентрации, если это необходимо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК должна быть извлечена и очищена для удаления интерферирующих веществ, таких как белки и высокая концентрация соли. Недеградированная, высококачественная ДНК должна использоваться для последующего усиления и анализа ПЦР (A260/A280: 1.8-2.0 и A260/A230:
  3. Этикетка скважины пЦР пластины или 0,2 мл ПЦР труб для выявления ссылки и испытания образцов ДНК.
  4. Рассчитайте количество реакций ПЦР, необходимых для тестовых образцов, 2 эталонных образцов и отрицательного контрольного образца. Подготовьте PCR Master Mix, добавив 15 qL буферной смеси ПЦР, 2,6 л разбавителя образцов и 0,4 л полимеразы для каждой реакции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательный контроль с использованием разбавитель образец имеет важное значение для мониторинга производительности ПЦР. Подготовка PCR мастер смесь при комнатной температуре, не пипетка на льду. Буферная смесь ПЦР вязкая. Смешайте трубку, а затем кратко спина вниз до использования.
  5. Vortex МАСТЕР-микс ПЦР от шага 1,4 на 10-20 с и спина вниз. Медленно распределяйте 18 л смеси в каждую скважину или трубку.
  6. Вихрь и спина вниз образцы ДНК. Пипетка 2 зл и л каждой ДНК в соответствующую скважину или трубку для окончательного объема ПЦР 20 ЗЛ. Mix путем пипетки вверх и вниз 5 раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество ДНК на реакцию должно быть 50-100 нг. Количество ДНК, превышающее 150 нг на 20 ПЦР, может привести к плохому усилению больших повторных аллелей. Для низкоконцентрированных ДНК количество разбавительа образцов в мастер-миксе ПЦР может быть заменено раствором ДНК.
  7. Запечатайте тарелку клеевым уплотнителем пластины или трубчатыми колпачками.
  8. Поместите герметичную пластину ПЦР или трубки в тепловой циклс с нагретой крышкой. Запустите программу со следующими настройками: 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут, затем 25 циклов денатурации при 98 градусах по Цельсию на 35 с, аннулирование при 59 градусах по Цельсию на 35 с и расширение на 72 градуса х 4 мин; заключительный шаг при 72 градусах по Цельсию в течение 10 мин. Держите продукты ПЦР при 4 градусах по Цельсию в циклере до удаления для дальнейшей обработки.
  9. После усиления ПЦР очистите и проанализируйте продукты немедленно, или храните на уровне от 2 до 8 градусов Цельсия на ночь. Кроме того, продукт может храниться до 30 дней при от -30 до -16 градусов по Цельсию.

2. Очистка продуктов ПЦР

  1. Разогреть инкубатор шейкер до 65 градусов по Цельсию.
  2. Для каждой реакции ПЦР добавьте 80 кЛ буфера 1x TE (см. таблицу материалов)к 20 Зл каждого продукта ПЦР из раздела 1.
  3. Перенесите образец смеси в чистую пластину ПЦР (см. Таблицу Материалов)с помощью многоканального пипетка.
  4. Держите пластину непокрытой и поместите его в шейкер инкубатора, и инкубировать при 65 градусов по Цельсию, вторите при 1200 об/мин в течение 10 минут.
  5. После инкубации установите вакуумный инструмент на 250 мбар (или 25 кПа, 188 мм рт. ст., 7,4 в Hg) и аспирируй раствор через фильтр в течение 15 мин. Уэллс не должно иметь жидкости.
  6. Охладите вшейку инкубатора до 25 градусов по Цельсию.
  7. После первого стремления выключите вакуум и добавьте 50 кВ 1x TE буфера к каждой скважине. Не смешивайте. Приготовьте раствор в течение 10 минут, используя вакуумные настройки в шаге 2.5.
  8. Высушите дно фильтра пластины, нажав его твердо на стопку бумажных полотенец.
  9. Добавьте 20 кЛ 1x TE буфера в нижний центр каждого колодца. Поместите тарелку в шейкер инкубатора и инкубировать при 25 градусах Цельсия, встряхивая при 1200 об/мин в течение 5 минут.
  10. После инкубации, передача йgt;15 qL каждой очищенной ПЦР ДНК от шага 2.9 к свежей 96-хорошо ПЦР пластины. Очищенная ДНК может быть проанализирована непосредственно, или же может храниться при -30 до -16 градусов по Цельсию до тех пор, пока это необходимо.

3. Размер фрагмента продуктов ПЦР

  1. Перед началом, позволяют ДНК красителя концентрат, матрицы геля ДНК, ДНК маркер, ДНК лестницы и очищенных образцов ДНК от шага 2 до уравновешивают до комнатной температуры в течение 30 минут.
  2. Настроили грунтовочная станция.
    1. Замените шприц (см. таблицу материалов)при использовании новой партии реагентов.
    2. Отрегулируйте базовую пластину и отпустите рычаг зажима шприца и сдвиньте его до верхнего положения.
  3. Начните программное обеспечение для размеров (см. Таблица материалов)и подготовьте смесь гель-красителя.
  4. Vortex красителя концентрат на 10 с и спина вниз. Добавьте 25 л красителя в флакон гелевой матрицы. Vortex смешанное решение хорошо и спина вниз.
    1. Перенесите смесь геля-красителя на спин-фильтр. Поместите спин-фильтр в микроцентрифуге и вращайтесь в течение 10 минут при комнатной температуре при температуре 1500 х г и 20%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите раствор краситель от света и храните при 4 градусах Цельсия после использования. Смесь гель-красителя может быть использована для около 15 фишек после того, как подготовлены. Разрешить гель-краситель смесь уравновесить до комнатной температуры в течение 30 минут каждый раз перед использованием.
  5. Загрузите смесь гель-красителя.
    1. Вставьте новый чип ДНК на грунтовке станции. Добавьте 9 л гель-красителя в хорошо отмеченный "G". Пожалуйста, убедитесь, что поршень расположен на отметке 1 мл, а затем закройте грунтовую станцию.
    2. Нажмите шприц поршень вниз, пока он не удерживается клип. Подождите ровно 30 с, а затем выпустить клип. Подождите 5 с, а затем медленно потяните поршень обратно в положение 1 мл.
    3. Откройте грунтовочная станцию и добавьте 9 л гель-красителя в колодцы, отмеченные "G".
  6. Добавьте 5 зл маркера в колодец, отмеченный символом лестницы, а также добавьте 5 зл маркера в каждую из 12 образецов скважин. Не оставляйте колодцы пустыми.
  7. Добавьте 1 зл днк-лестницы в колодец, отмеченный символом лестницы. Добавьте 1 зЛ продукта ПЦР (использованные скважины) из ступени 3,1 или 1 л ультрачистой воды (неиспользованных скважин) в каждую из 12 образов скважин. Поместите чип горизонтально в адаптер вихревого миксера и вихря в течение 1 мин при указанной настройке (2400 об/мин).
  8. Вставьте чип в инструмент биоанализатора и запустите чип в инструменте в течение 5 минут.
  9. После завершения ассеа немедленно удалите использованный чип с инструмента.
  10. Медленно добавьте 350 л деионизированной воды в одну из колодцев электродного очистителя. Откройте крышку биоанализатора и поместите в него очиститель электрода. Закройте крышку и инкубировать около 10 с. Откройте крышку и удалите электрод чище. Подождите еще 10 с, чтобы вода на электродах испарилась, а затем закрыла крышку.

4. Проанализируйте результаты размеров фрагмента

ПРИМЕЧАНИЕ: Эталонные образцы должны быть усилены и проанализированы тем же тепловым велосипедистом и биоанализатором в одной партии с неизвестными образцами.

  1. После завершения запуска биоанализа экспортируйте пиковые данные с каждого запуска в виде файла таблицы .csv для последующего анализа.
  2. Запустите программное обеспечение для анализа и откройте экспортируемый файл пиковой таблицы .csv с шага 4.1.
  3. Через вкладку меню КК просмотрите линию регрессии, установленную на четыре точки (показанные как синие бриллианты на участке) из двух эталонных образцов. Значение R2 регрессионной линии должно быть 0,98 (типичные значения превышают 0,999).
  4. Через вкладку меню «Результаты» проверьте размер повтора каждого образца, длина фрагмента которого (s) автоматически накладывается на стандартную кривую линейной регрессии, полученную из эталонных образцов. Программное обеспечение также обеспечивает классификацию каждого образца в соответствии с различными руководящими принципами.
  5. Через вкладку меню «Экспорт» вывемите отчет о результатах по каждому образцу с повторными числами и диагностической классификацией, а также резюме информации о выборке и отчета к КК для каждого запуска.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для анализа позволяет использовать пользовательские руководящие принципы классификации, такие как Американский колледж медицинской генетики (ACMG) или Клинической молекулярной генетики общества / Европейского общества генетики человека (CMGS/ESHG) руководящие принципы, а также предопределенная классификация Критерии.

Результаты

Результаты размеров женской эталонной выборки (NA20240, повторные размеры 30 и 80) и полная женская эталонная выборка мутации (NA20239, повторные размеры 20 и 200) показаны на рисунке 1A и Рисунке 1B, соответственно. Как правило, в профиль размера фрагмента включены два...

Обсуждение

FXS является второй наиболее распространенной причиной интеллектуальных нарушений после трисомии 21, на долю которой приходится почти половина X-связанных умственной отсталости30, которые могут затронуть примерно 1 в 4000 мужчин и 1 в 8000 женщин. Что еще более важно, почти 1 из 250-10...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантами от NSFC Проект управления чрезвычайными ситуациями (Грант No 81741004), Национальный фонд естественных наук Китая (Грант No 81860272), Главный исследовательский план провинциального научно-технического фонда Гуанси ( Грант Но. AB16380219), Грант Фонда постдокторской науки (Грант No 2018М630993) и Гуанси-Фонд естественных наук (Грант No 2018GXNSFAA281067).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubesAxygenPCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-freeAmbionAM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrumentAgilentG2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR PlateThermo FisherAB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridgeAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixerAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert softwareAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chipsAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent DNA 7500 kitAgilent5067-1506For Fragment sizing
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chipsAgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode CleanerAgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin FilterAgilentSupplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: SyringeAgilentSupplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Chip priming stationAgilent5065-4401Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Cubee Mini-centrifugeGeneReachaqbd-i
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum ManifoldMerck MilliporeMSVMHTS00Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopperMerck MilliporeXX2004718Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pumpMerck MilliporeWP6122050Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vesselMerck MilliporeXX1004705Filter plate vacuum Manifold
FragilEase Fragile X PCR kitPerkinElmer3101-0010For PCR amplification
FragilEase Fragile X PCR kit: Sample DiluentPerkinElmerIn kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )
FragilEase PCR Buffer mixPerkinElmerIn kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward)
FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse)
FragilEase PolymerasePerkinElmerIn kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )
FraXsoft analysis softwarePerkinElmer
NanoDrop ND-2000 SpectrophotometerThermo Fisher
Paper towels
PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plateMACHEREY-NAGEL743100
reference DNA sampleCoriellNA20240 & NA20239
S1000 96-well Thermal CyclerBio-Rad1852196This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti™ 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786)
TriNEST Incubator/Shaker instrumentPerkinElmer1296-0050
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterLife Technologies10977015For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning
Vortex-Genie 2Scientific IndustriesSI-0256 (Model G560E)Conventional vortex mixer

Ссылки

  1. Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
  2. Fu, Y. H., et al. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox. Cell. 67, 1047-1058 (1991).
  3. Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses. Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).
  4. Didiot, M. C., et al. The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer. Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).
  5. Bechara, E. G., et al. A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation. PLoS Biology. 7, e16 (2009).
  6. Ascano, M., et al. FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression. Nature. 492, 382-386 (2012).
  7. Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).
  8. Oberle, I., et al. Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. Science. 252, 1097-1102 (1991).
  9. Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. Fragile X syndrome and targeted treatment trials. Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).
  10. Hatton, D. D., et al. Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP. American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).
  11. Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families. Human Genetics. 59, 281-289 (1981).
  12. Backes, M., et al. Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data. American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).
  13. Nolin, S. L., et al. Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010. Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).
  14. Nolin, S. L., et al. Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles. American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).
  15. Fernandez-Carvajal, I., et al. Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations. Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).
  16. Terracciano, A., et al. Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations. European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).
  17. Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. Advances in understanding the molecular basis of FXTAS. Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).
  18. Juncos, J. L., et al. New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS). Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).
  19. Hagerman, R. J., et al. Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X. Neurology. 57, 127-130 (2001).
  20. Conway, G. S. Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update. Annales d'endocrinologie. 71, 215-217 (2010).
  21. Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. Fragile X premutations in familial premature ovarian failure. Lancet. 346, 309-310 (1995).
  22. Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation. European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).
  23. Bourgeois, J. A., et al. A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective. Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).
  24. Farzin, F., et al. Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation. Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).
  25. Hantash, F. M., et al. FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States. Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).
  26. Kraan, C. M., et al. FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts. Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).
  27. Saul, R. A., Tarleton, J. C. FMR1-Related Disorders. GeneReviews. , (2012).
  28. Amos Wilson, J., et al. Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study. Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).
  29. Kwok, Y. K., et al. Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats. Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).
  30. Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene--and implications for the population genetics of the fragile X syndrome. American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).
  31. Tassone, F., et al. FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States. Genome Medicine. 4, 100 (2012).
  32. Dombrowski, C., et al. Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles. Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).
  33. Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis. Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).
  34. Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. Recent advances in assays for the fragile X-related disorders. Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).
  35. Seltzer, M. M., et al. Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample. American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).
  36. Hayward, B. E., Usdin, K. Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders. Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).
  37. Orrico, A., et al. Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case. American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).
  38. Schmucker, B., Seidel, J. Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males. American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

151X 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены