JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يستخدم الترسيب المناعي المتعدد الكمية (QMI) قياس التدفق الخلوي للكشف الحساس عن الاختلافات في وفرة التفاعلات المستهدفة بين البروتين والبروتين بين عينتين. يمكن إجراء QMI باستخدام كمية صغيرة من المواد الحيوية، ولا يتطلب علامات هندسية وراثيا، ويمكن تكييفها لأي شبكة تفاعل البروتين المحددة سابقا.

Abstract

تتحكم التفاعلات الديناميكية بين البروتين والبروتين في السلوك الخلوي، من الحركة إلى النسخ المتماثل للحمض النووي إلى تحويل الإشارة. ومع ذلك، فإن رصد التفاعلات الديناميكية بين البروتينات المتعددة في شبكة تفاعل البروتين أمر صعب من الناحية التقنية. هنا، نقدم بروتوكول اتونى الكمية متعددة المناعة (QMI)، والذي يسمح بالتقييم الكمي للتغيرات أضعاف في تفاعلات البروتين على أساس قياسات الفلورة النسبية من البروتينات في المجمعات المشتركة التي تم الكشف عنها من قبل يتعرض الepitopes السطحية (PiSCES). في QMI، يتم تسريع مجمعات البروتين من الليسات الخلوية المناعية على الميكروسفيرات، ومن ثم يتم فحصها بجسم مضاد مسمى لبروتين مختلف من أجل تحديد كمية وفرة PiSCES. يتم الجمع بين الأجسام المضادة الترسيب المناعي إلى مناطق الطيفية MagBead مختلفة، مما يسمح لمقياس التدفق للتمييز بين الترسيب المناعي الموازي المتعدد وتحديد كمية الأجسام المضادة للمسبار المرتبطة بكل منها في نفس الوقت. لا يتطلب QMI وضع علامات وراثية ويمكن القيام به باستخدام الحد الأدنى من المواد الحيوية مقارنة بأساليب الترسيب المناعي الأخرى. يمكن تكييف QMI لأي مجموعة محددة من البروتينات المتفاعلة، وقد استخدمت حتى الآن لوصف شبكات الإشارات في الخلايا T ونقاط الاشتباك العصبية الغلوتامات. وقد أدت النتائج إلى توليد فرضية جديدة مع التطبيقات التشخيصية والعلاجية المحتملة. يتضمن هذا البروتوكول إرشادات لتنفيذ QMI، من التحديد الأولي للوحة الأجسام المضادة حتى تشغيل الاختبارات وتحليل البيانات. التجميع الأولي لفحص QMI ينطوي على فحص الأجسام المضادة لإنشاء لوحة، وتحديد تجريبيا ً المخزن المؤقت للlysis المناسب. ويشمل إعداد الكاشف اللاحق اقتران الأجسام المضادة لهطول الأمطار المناعية إلى MagBeads، والأجسام المضادة التحقيق biotinylating بحيث يمكن وصفها من قبل الفلوروفور مترافق streptavidin. لتشغيل فحص، يتم خلط lysate مع MagBeads بين عشية وضحاها، ومن ثم يتم تقسيم الخرز وحضانة مع الأجسام المضادة التحقيق مختلفة، ومن ثم تسمية فلوروفور، وقراءة من قبل قياس التدفق. يتم إجراء اختبارين إحصائيين لتحديد PiSCES التي تختلف بشكل كبير بين الظروف التجريبية، ويتم تصور النتائج باستخدام خرائط الحرارة أو الرسومات التخطيطية على حافة العقدة.

Introduction

التفاعلات الديناميكية بين البروتين والبروتين تشكل سلاسل الإشارات الجزيئية والهياكل motile التي هي الأساس الوظيفي لمعظم علم وظائف الأعضاء الخلوية1. وغالبا ما تصور هذه العمليات على أنها مسارات الإشارات الخطية التي تحول بين الدول الثابتة على أساسمدخلات واحدة، ولكن البيانات التجريبية والنمذجة تبين بوضوح أنها تعمل كشبكات متكاملة 2،3، 4.في حالة البروتينات G, مستقبلات مختلفة غالبا ما يكون القدرة على تنشيط نفس البروتين G, ومستقبلات واحدة يمكن أيضا تنشيط أكثر من نوع واحد من البروتين G5,6. من أجل عدد صغير نسبيا من فئات البروتين G لتعديل على وجه التحديد مجموعة واسعة من الوظائف الخلوية مثل انتقال متشابك, تنظيم هرمون, وهجرة الخلايا, الخلايا يجب على حد سواء دمج وتمييز هذه الإشارات4 , 5.وقد أظهرت الأدلة أن هذه الخصوصية إشارة، للبروتينات G وغيرها، وتستمد في المقام الأول على أساس التفاعلات البروتين البروتين ضبطها بدقة ودينامياتها الزمنية 1،3، 4 , 5 , 6 , 7.لأن شبكات الإشارات تتكون من مجمعات البروتين الديناميكي مع مدخلات متعددة، والمخرجات، وحلقات التغذية المرتدة، اضطراب واحد لديه الفرصة لتغيير التوازن المنزلي العام من علم وظائف الأعضاء الخلية4 ،7. ومن المتفق عليه الآن على نطاق واسع أنه ينبغي فحص الإشارات من منظور الشبكة من أجل فهم أفضل لكيفيةدمج المدخلات المتعددة يتحكم في الوظائف الخلوية المنفصلة في الصحة والمرض 7،8، 9،10،11،12،13. في ضوء ذلك، تم تطوير الكم ّي متعددة المناعة (QMI) لجمع متوسطة الإنتاجية، والبيانات الكمية حول التغيرات أضعاف في شبكات التفاعل البروتين الديناميكي.

QMI هو فحص يستند إلى الأجسام المضادة حيث يتم احتضان الليسات الخلية مع لوحة من الأجسام المضادة لهون الأمطار المناعية التي تقترن بشكل مشترك إلى الخرز المغناطيسي التي تحتوي على نسب متميزة من الأصباغ الفلورية. وجود أجسام مضادة محددة إلى جانب فئات حبة المغناطيسي متميزة يسمح لمتزامنة co-immunoprecipitation من البروتينات المستهدفة متعددة من نفس lysate. بعد هطول الأمطار المناعية (IP)، يتم احتضان الخرز المغناطيسي مع ثاني، جسم مضاد للمسبار الفلوري المترافق (أو الأجسام المضادة biotinylated جنبا إلى جنب مع streptavidin الفلوروفوري المترافق). ثم يتم الكشف عن الارتباطات المشتركة بين البروتينات المعترف بها من قبل كل زوج الأجسام المضادة للأجسام IP، أو PiSCES (البروتينات في المجمعات المشتركة التي تم الكشف عنها من قبل epitopes السطح المكشوفة)، عن طريق قياس التدفق ويمكن مقارنتها كميا بين مختلف عينة الشروط14. تُظهر الرسوم التوضيحية في الشكل 1 الخطوات التي ينطوي عليها إجراء فحص QMI، بما في ذلك رسم تخطيطي للحبات المغناطيسية مع مجمعات البروتين المُعفية المناعية التي تحمل هالاً مضادة للمسبار المترافق بشكل فلوري (الشكل1C).

حساسية QMI يعتمد على تركيز البروتين من lysate نسبة إلى عدد من الخرز المغناطيسي المستخدمة لمناعة الترسيب، وتحقيق قرار للكشف عن 10٪ أضعاف التغييرات يتطلب سوى كمية صغيرة من المواد البداية بالمقارنة مع غيرها من أساليب الملكية الفكرية المشتركة14،15. على سبيل المثال، كمية المواد الأولية المستخدمة في QMI مشابهة لتلك المطلوبة لشطيرة مرتبطة بالإنزيم المناعيSorbent الفحص (ELISA)، ولكن يتم الكشف عن تفاعلات متعددة في الفحص QMI واحد. تم إجراء فحص QMI باستخدام 20 نقطة IPs و20 هدف مسبار باستخدام 1-5 × 105 خلايا T الأولية معزولة عن خزعة الجلد 4 مم، والاستعدادات متشابك P2 من قسم الإكليل 3 مم من القشرة الأمامية للماوس، أو 3 × 106 الماوس المستزرع الابتدائي الخلايا العصبية القشرية14،16،17. هذه الحساسية تجعل QMI مفيدة لتحليل الخلايا أو الأنسجة ذات التوافر المحدود، مثل العينات السريرية.

يمكن تكييف QMI لأي شبكة تفاعل بروتين محددة مسبقًا (شريطة أن تكون الأجسام المضادة متوفرة)، وقد تم تطويرها حتى الآن لتحليل مستقبلات مستضد الخلايا T (TCR) الإشارة ومجموعة فرعية من البروتينات في نقاط الاشتباك العصبي الجلوتاساتفية في الخلايا العصبية 17 سنة , 18.في دراسات إشارات مستقبلات الخلايا T، تم استخدام QMI لأول مرة لتحديد التغيرات الناجمة عن التحفيز في PiSCES، ومن ثم للتمييز بين مرضى المناعة الذاتية من مجموعة التحكم، والكشف عن إشارات المناعة الذاتية الذاتية، وأخيرا لتوليد فرضية تنطوي على شبكة فرعية غير متوازنة المرتبطة بالمرض من التفاعلات14. في الآونة الأخيرة، تم استخدام نفس لوحة QMI لتحديد أن يتم تحديد الخلايا الصعترية من خلال الاختلافات الكمية بدلا من النوعية في البروتين المرتبط بـ TCR مما يشيرإلى 19. في الخلايا العصبية، تم استخدام QMI لوصف إعادة ترتيب المدخلات المحددة لشبكة تفاعل البروتين لأنواع متميزة من إشارات الإدخال بطريقة تدعم النماذج الناشئة حديثا من اللدونة متشابك17. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام لوحة QMI متشابك لتحديد الاختلافات في سبعة نماذج الماوس من التوحد، وتجميع النماذج في مجموعات فرعية على أساس التوقيعات الحيوية PiSCES الخاصة بهم، ويفترض بدقة العجز الجزيئي المشترك الذي لم يتم التعرف عليه سابقا في واحدة من النماذج16. ويمكن استخدام نهج مماثل لفحص المجموعات الفرعية الأخرى التي قد تستجيب لمختلف علاجات المخدرات، أو لتعيين عقاقير لمجموعات فرعية متجاوبة محددة. QMI لديها تطبيقات محتملة في التشخيص، والكتابة الفرعية للمرضى، وتطوير المخدرات، بالإضافة إلى العلوم الأساسية.

لتجميع لوحة الأجسام المضادة QMI، يتم وصف البروتوكولات الأولية لفحص الأجسام المضادة واختيارها في القسم 1 أدناه. وبمجرد تحديد ألواح الأجسام المضادة، يتم وصف بروتوكولات لاقتران الأجسام المضادة المختارة للحبات المغناطيسية للملكية الفكرية، وللتحلل الحيوي للأجسام المضادة المسبارية المختارة، في القسم 2. ويرد وصف بروتوكول تشغيل فحص QMI على الخلايا أو الأنسجة lysates في القسم 3. وأخيراً، بما أن تجربة واحدة يمكن أن تولد حوالي 5 x 105 نقاط بيانات فردية، يتم توفير التعليمات ورموز الكمبيوتر للمساعدة في معالجة البيانات وتحليلها والتصور في القسم 4. وترد في الشكل 1نظرة عامة على سير العمل الوارد وصفه في الأبواب من 2 إلى 4.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تصميم الساي

  1. إعداد الأجسام المضادة المرشح
    1. لكل بروتين من الفائدة، اختر 3 إلى 5 أجسام مضادة للشاشة. عند الإمكان، استخدم الأجسام المضادة أحادية النسيلة التي تعترف بالإبالعامة المختلفة. وتشمل أيضا واحد الأجسام المضادة عنصر تحكم غير محددة.
    2. لإزالة Tris، قم بإجراء تبادل المخزن المؤقت عن طريق إضافة الجسم المضاد إلى فلتر دوران 30 كيلوDa، والدوران وصولاً إلى الحد الأدنى لحجمها، وإضافة 500 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)، وتكرار 3 مرات. لإزالة البروتينات الحاملة، قم بتنقية الأجسام المضادة وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة (راجع جدول المواد للاطلاع على توصية تنقية محددة).
      ملاحظة: يتم ذلك لأن البروتينات الناقل والمخازن المؤقتة مع مجموعات الأمين الحرة (مثل تريس) سوف تتفاعل مع مجموعات COOH وإرواء اقتران حبة اللاحقة وردود الفعل biotinylation. تأكد من تنقية جميع الأجسام المضادة (لا البروتينات الناقل) وفي عازلة خالية من الأمينات الأولية (أي، لا تريس).
    3. زوجان كل الأجسام المضادة لcarboxylate تعديل اللاتكس (CML) الخرز كما هو موضح من قبل ديفيس وSchrum20. للحفاظ على الأجسام المضادة، قم بتقليص تفاعلات اقتران الخرز بنسبة تصل إلى 1/5 (أي 3.6 × 106 حبات مع 10 ميكرولتر من 0.2-1 ملغ / مل الأجسام المضادة).
    4. تقدير أرقام حبة باستخدام مقياس الهيموكيتومات (عادة ~ 108/ مل) وتخزينها في 4 درجة مئوية. تم تخزين الخرز لأكثر من عام واستخدم بنجاح في الاختبارات QMI، ولكن لم يتم تحديد تاريخ الصلاحية أو انتهاء الصلاحية رسميا. NaN3 في المخزن المؤقت B /S يمنع النمو البكتيري.
    5. Biotinylate جزء من كل الأجسام المضادة (انظر القسم 2.2 أدناه). يُحفظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    6. تأكيد فعالة CML حبة اقتران ودقيقة العد عن طريق تلطيخ 1 × 105 الخرز مع الأجسام المضادة PE-مترافق رد فعل على الأنواع التي تم رفع الأجسام المضادة والقراءة على مقياس التدفق.
    7. تأكيد biotinylation الأجسام المضادة بواسطة نقطة وصمة عار باستخدام streptavidin-HRP.
    8. وبمجرد أن يولد المختبر الكواشف المعروفة بأنها فعالة، استخدم تلك الكواشف كضوابط إيجابية في ردود فعل التأكيد في الخطوتين 1-1-5 و1-1-6.
  2. فحص الأجسام المضادة من قبل IP-FCM (الترسيب المناعي التي تم الكشف عنها عن طريق قياس التدفق الخلوي)
    1. اتخاذ قرار بشأن lysate الفرز المناسب. لهذا ولجميع خطوات الفحص الأخرى قبل QMI (أي شيء المدرجة في هذا القسم 1: تصميم الفحص)، لا تستخدم العينات الحيوية مع توافر محدود. بدلاً من ذلك، اختر مادة تحكم قابلة للمقارنة مثل أنسجة الماوس من النوع البري أو خطوط الخلايا أو أنسجة المتبرع البشري العادية التي ليست موردًا مقيدًا.
      ملاحظة: اختيار المخزن مؤقت lysis لهذا الاختبار ليست تافهة، وتناقش في القسم 1.5: تحديد المنظفات، وكذلك في الفقرة قبل الأخيرة من المقطع مناقشة. المخازن العازلة اللليس القياسية لديها قاعدة من 150 مل NaCl، 50 MM تريس (الحموضة 7.4)، 10 mM فلوريد الصوديوم، 2 MM أورثوفادات الصوديوم، والبروتياز وكوكتيلات مثبطات الفوسفاتيز. المنظفات المتوافقة مع QMI تشمل 1٪ NP-40، 1٪ Digitonin، 0.1-1٪ تريتون X-100، و 0.5-1٪ deoxycholate14،16،17،18،19،21.
    2. حساب الحجم الإجمالي للlysate لاستخدامها لكل IP، وذلك باستخدام 10 ميكرولتر لكل تركيبة IP-probe ليتم فحصها. إذا فحص X الأجسام المضادة التحقيق واستخدام عنصر تحكم IgG واحد، كل IP سوف تستخدم (X + 1) * (10 درجة مئوية) * (1.1 لخطأ الأنابيب)؛ X + 1 هو لحساب التحكم التحقيق IgG المطلوبة. على سبيل المثال، في شاشة الأجسام المضادة 3x3، يجب أن يستخدم كل IP 44 ul. تذكر تضمين عنصر تحكم IP IgG (راجع إعداد الفحص على سبيل المثال في الشكل 2).
    3. حساب رقم حبة CML ليتم استخدامها. إذا كنت فحص X الأجسام المضادة التحقيق، واستخدام [(X + 1) * 5 × 104 الخرز]. من الناحية المثالية، 5000 الخرز لكل بئر سوف يؤدي إلى > 2000 الخرز في قراءة جيدة من قبل مقياس السيتومتر تدفق. على سبيل المثال، في شاشة الأجسام المضادة 3 × 3، يجب على كل IP استخدام 20،000 الخرز، وهو ما يقرب من 0.66 درجة مئوية من الأرصدة حبة CML المعدة من الخطوة 1.1.3 (يجب أولاً قياس الخرز كمياً باستخدام مقياس الهيموكيتومتر لضمان الدقة).
    4. احتضان حجم lysate من الخطوة 1.2.2 مع حجم كل حبة CML ليتم فحصها من الخطوة 1.2.3، بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع تناوب لمنع الخرز من الاستقرار. عادة، إجراء الحضانة في العمود الأول من لوحة PCR 96 جيدا، وغطاء مع قبعات شريط أنبوب PCR.
    5. تدور أسفل الخرز CML في 3200 × ز لمدة 1 دقيقة وإزالة lysate من قبل واحد، نفض الغبار السريع من لوحة على الحوض. يجب أن تكون بيليه بيضاء صغيرة مرئية في الجزء السفلي من كل بئر على حد سواء قبل وبعد نفض الغبار.
    6. إعادة تعليق الخرز CML في حجم من العازلة FlyP لتساوي 20 درجة مئوية لكل زوج حبة التحقيق؛ للأجسام المضادة التحقيق X، استخدم (X +1) * (20 درجة مئوية) * (1.1 لخطأ الأنابيب)، على غرار الخطوة 1.2.2. بالنسبة لشاشة 3 × 3، قم بإعادة الإيقاف المؤقت في 88 ميكرولتر من المخزن المؤقت FlyP. الحاجز FlyP هو 100 مل NaCl، 50 mM تريس الحموضة 7.4، 1٪BSA، 0.01٪ NaN 3.
    7. توزيع كل IP عبر (X +1) الآبار من لوحة PCR 96-well، حيث X هو عدد الأجسام المضادة التحقيق التي يتم فحصها، وذلك باستخدام 20 درجة مئوية / جيدا. الشكل 2 يظهر مثال إعداد الفحص.
    8. اغسل مرتين إضافيات باستخدام 200 ميكرولتر من مخزن FlyP المؤقت لكل بئر. تدور لوحة كما هو الحال في الخطوة 1.2.5 ونفض الغبار لوحة لإزالة العازلة غسل بعد كل غسل. الكريات ستكون صغيرة للغاية، ولكن ينبغي أن تكون مرئية بعد كل غسل.
    9. لكل الأجسام المضادة biotinylated ليتم فحصها، حساب الحجم الإجمالي كما (Y + 1) * 1.1 * 50 درجة مئوية، حيث Y هو عدد الأجسام المضادة IP التي يجري فحصها. تخفيف الأجسام المضادة إلى تركيز العمل في هذا الحجم من العازلة FlyP، وعادة ما تبدأ مع 1:100 تخفيف من مخزون 0.5 ملغ / مل.
    10. توزيع كل الأجسام المضادة المخففة أسفل كل عمود من لوحة الآبار 96، وضمان إعادة تعليق الخرز CML.
    11. الحضانة في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، إما مع دوران أو pipetting في فترات 15 دقيقة لضمان الخرز CML لا تزال في تعليق.
    12. اغسل 3 x في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FlyP، لكل جهاز طرد مركزي للغسيل وإزالة lysate كما هو الحال في الخطوة 1.2.5.
    13. إعادة تعليق جميع الخرز CML في 50 درجة مئوية من 1:200 Streptavidin-PE في العازلة FlyP.
    14. حضانة في 4 درجة مئوية في الظلام لمدة 30 دقيقة.
    15. اغسل 3 x في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FlyP، لكل جهاز طرد مركزي للغسيل وإزالة lysate كما هو الحال في الخطوة 1.2.5.
    16. إعادة تعليق في 200 μL من المخزن المؤقت FlyP ثم قم بتشغيل على مقياس تدفق.
  3. اختيار الأجسام المضادة لتضمينها في التساي
    1. بوابة على حجم باستخدام FSC-H مقابل SSC-H، والقضاء على doublets باستخدام FSC-H مقابل FSC-A.
    2. توليد الرسوم البيانية من كثافة الفلورة PE وتراكب كل من الضوابط IgG (IgG حبة اختبارالتحقيق، اختبار حبة-IgG التحقيق) على أزواج اختبار (الشكل 2).
    3. ابحث عن زوج حبة التحقيق الذي يعطي إشارة واضحة على الضوضاء (الشكل2B). بالإضافة إلى ذلك، فإنه ليس مثاليا لاستخدام نفس الجسم المضاد لكل من حبة والتحقيق. يزيد التعرف على الظهارة التفاضلية من فرص مراقبة التفاعلات لأن بعض الepitopes قد تكون مُقَلَّبة في بعض مجمعات البروتين. إذا لم تكن هناك خيارات مقبولة، كرر الشاشة مع الأجسام المضادة الإضافية.
  4. تأكيد خصوصية الأجسام المضادة
    1. لضمان خصوصية الأجسام المضادة للأهداف المقصودة، استخدم عينة lysate التي تم فيها ضرب الهدف؛ على سبيل المثال، ماوس خروج المغلوب أو خط خلية RNAi. بدلا ً من ذلك، استخدم lysate من خط الخلية السلبيالمستهدف الذي تم التعبير عن البروتين المستهدف بشكل مصطنع.
    2. تنفيذ IP-FCM كما هو موضح في الخطوة 1.2 تعديل لاحتواء التجربة.
  5. اختيار المنظفات
    1. وبما أن المنظفات حاسمة في تجارب الملكية الفكرية المشتركة، فإن اختبار الاختلافات المختلفة تجريبياً للتأكد من أن الفحص له احتمال أقصى للكشف عن التغيرات. للبدء، اختر لوحة صغيرة نسبيامن التفاعلات (4-8) التي من المعروف أن تتغير في حالة معينة و / أو ذات أهمية خاصة لدراستك.
    2. باستخدام حبات CML غير الفلورية، وكدمات الجسم المضاد للجسم المصنوعة للشاشات الأولية، قم بإجراء IP-FCM كما هو موضح في 1.2 باستخدام ظروف المنظفات العازلة المتنوعة للتخدير. يمكن إجراء شاشات المنظفات مع المنظفات كمتغير وحيد، أو مع ظروف خلية مختلفة لكل المنظفات. دائما استخدام الضوابط IgG لكل من الخرز وتحقيقات، منذ المنظفات تنتج في بعض الأحيان خلفية غير متوقعة في بعض تركيبات IP-التحقيق.
    3. استنادًا إلى مؤسسات التمويل الأصغر من الشاشة، اختر المنظفات التي تعمل على تحسين الإشارة لـ PiSCES ذات الأهمية. ومن المرجح أن بعض التنازلات سوف تحتاج إلى تقديم22.

2. إعداد كاشف متعددة

  1. المغناطيسي حبة اقتران
    1. باستخدام خريطة منطقة الخرز المغناطيسي، حدد مناطق الخرز لاستخدامها في نمط يقلل من خطر الكشف المتبادل. حبة المغناطيسي تشويه عادة صعودا وإلى اليمين، لذلك تجنب المناطق حبة التي هي متاخمة قطريا. ينصح الخرز من كل عمود آخر من الرسم التخطيطي حبة هو مبين على موقع Luminex (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/).
    2. إعداد الأجسام المضادة خالية من الناقل في 0.1 ملغ / مل في PBS (كما هو الحال في 1.1.2) في 250 درجة مئوية.
    3. دوامة الخرز المغناطيسي على نطاق واسع، ومن ثم aliquot 250 ميكرولتر في أنبوب الكهرمان (لحماية الخرز من تبييض الصور).
    4. حبات مغناطيسية منفصلة مغناطيسيا لمدة 60 ق وإزالة supernatant.
    5. إضافة 250 درجة مئوية من المخزن المؤقت MES (50 مل MES درجة الحموضة 6.0، 1 MM EDTA)، دوامة، منفصلة مغناطيسيا لمدة 60 ثانية، وإزالة supernatant. كرر وإعادة تعليق الخرز المغناطيسي في 200 درجة مئوية من المخزن المؤقت MES.
    6. إضافة 40 درجة مئوية من MES إلى 2 ملغ من أنبوب استخدام واحد من Sulfo-NHS لجعل 50 ملغ / مل الأسهم.
    7. إضافة 25 درجة مئوية من Sulfo-NHS الطازجة إلى الخرز المغناطيسي. دوامه.
    8. إضافة 25 ميكرولتر من 50 ملغ / مل المذاب حديثا EDAC [1-إيثيل-3-(-3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) هيدروكلوريد كاربوديميدي، ويسمى أيضا EDC] في المنطقة العازلة MES. دوامه.
    9. تغطية ويهز على دوامة مع مرفق أنبوب عقد لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، 1000 دورة في الدقيقة.
    10. منفصلة مغناطيسيا لمدة 60 ق وإزالة supernatant.
    11. إعادة تعليق في 500 درجة مئوية من PBS، دوامة، منفصلة مغناطيسيا لمدة 60 ثانية وإزالة supernatant. كرر.
    12. إعادة تعليق في 250 درجة مئوية من محلول الأجسام المضادة من الخطوة 2.1.2. دوامه.
    13. احتضان 2 ح في درجة حرارة الغرفة مع الهز على دوامة في 1000 دورة في الدقيقة.
    14. إضافة 500 درجة مئوية من PBS إلى الخرز المغناطيسي، دوامة، منفصلة مغناطيسيا لمدة 60 ثانية، وإزالة supernatant.
    15. إضافة 750 μL من حظر /تخزين (B / S) المخزن المؤقت (1٪ BSA فيPBS درجة الحموضة 7.4، 0.01٪ NaN 3). تغطية وحضانة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، 1000 دورة في الدقيقة.
    16. منفصلة مغناطيسيا لمدة 60 ق وإزالة supernatant. إعادة تعليق في 100 μL من B / S المخزن المؤقت.
    17. يُحفظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم تخزين الخرز لأكثر من عام واستخدم بنجاح في الاختبارات QMI، ولكن لم يتم تحديد تاريخ الصلاحية أو انتهاء الصلاحية رسميا. يجب أن يمنع NaN3 في المخزن المؤقت B/S نمو البكتيريا.
    18. التحقق من صحة اقتران حبة المغناطيسي عن طريق تلطيخ ~ 0.25 درجة مئوية من الخرز المغناطيسي المقترنة مع الأنواع الفلورية المضادة للمضيف الثانوية والقراءة على مقياس التدفق، كما هو الحال في الخطوة 1.1.5.
  2. التبوية الحيوية
    1. تأكد من أن الأجسام المضادة في PBS مع عدم وجود بروتين الناقل.
    2. حساب مجموع ميكروغرام من الأجسام المضادة لتكون biotinylated (100-200 ميكروغرام الموصى بها للاستخدام في مضاعفات، 25-50 ميكروغرام الموصى بها للفحص).
    3. إعداد الطازجة 10 مل سلفو-NHS-البيوتين (يمكن أن يتم عن طريق إضافة 224 درجة مئوية من ddH2O إلى أنبوب 1 ملغ لا تزن).
    4. إضافة 1 ميكرولتر من 10 مل سلفو-NHS-البيوتين لكل 25 ميكروغرام من الأجسام المضادة، دوامة أو ماصة صعودا وهبوطا لخلط.
    5. حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    6. حضانة في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    7. استخدام مرشح تدور 30 كيلودا لإزالة البيوتين غير منضم ووقف رد الفعل. إضافة 500 μL من PBS وتدور العمود حتى يتم الوصول إلى الحد الأدنى لحجم. إضافة 500 μL من PBS إضافية وتكرار ل3 إجمالي التبادلات المخزن المؤقت.
    8. تقدير التركيز بقياس امتصاص 1-2 ميكرولتر على مقياس الطيف الضوئي، ومن ثم إحضار تركيز الأجسام المضادة إلى 0.5 ملغم/مل.
    9. يُحفظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.

3. الكم المتعدد المناعيةه

  1. تخطيط اللوحة
    ملاحظة: يعمل هذا النموذج بشكل أفضل عند إجراء باستخدام لوحات 96-well و 2-4 شروط العينة.
    1. قم دائمًا بتشغيل الضوابط المناسبة (أي الخلايا المحفزة ضد الخلايا غير المحفزة) على نفس اللوحة من أجل الكشف عن التغيرات بين الظروف. توزيع كل عينة أفقيا عبر لوحة، واستخدام كل عمود لجسم مضاد مسبار مختلفة. يجب تشغيل مجموعة من التكرارات التقنية لكل مسبار مباشرة بعد المجموعة الأولى. انظر الشكل 3 للحصول على مثال.
    2. توثيق تخطيط اللوحة بعناية لتسهيل تحميل اللوحة وتحليلها بدقة.
  2. إعداد العينة وهطول الأمطار المناعية (اليوم 1)
    1. الأنسجة أو الخلايا الليسية في المنظفات المناسبة مع مثبطات البروتياز والفوسفاتيز وحضانة على الجليد لمدة 15 دقيقة. الحرص على الحفاظ على lysate الباردة في جميع الأوقات.
      ملاحظة: يجب تحديد الكمية الدقيقة لتركيز المواد الأحيائية وبروتين الليسات تجريبياً، وترد بعض الأمثلة على العينات المستخدمة سابقاً في الفقرة الثالثة من المقدمة. بشكل عام، في نطاق 200 ميكرولتر من 2 ملغ /مل بروتين لكل عينة كانت ناجحة في الماضي ل 20 IP و 20 أهداف التحقيق، ولكن يجب تحديد المدخلات المثالية لكل لوحة الأجسام المضادة ونوع الخلية أو الأنسجة تجريبيا.
    2. تدور إلى أسفل في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في 16،000 × ز لإزالة الأغشية والحطام؛ الحفاظ على supernatant كما lysate.
    3. إجراء فحص BCA أو ما شابه ذلك لتحديد تركيزات البروتين، ومن ثم تطبيع تركيز البروتين بين العينات. في حالة استخدام الخلايا، ابدأ بعدد متساوٍ من الخلايا لكل شرط وكان التطبيع اختياريًا.
    4. إعداد مزيج حبة المغناطيسي الرئيسي الذي يحتوي على ~ 250 الخرز المغناطيسي من كل فئة في بئر في فحص. ضبط أرقام حبة بعد تحليل البيانات بحيث في الاختبارات في المستقبل سيتم قراءة ما متوسطه 110 الخرز من كل فئة لكل بئر.
      ملاحظة: حساب المثال: (حجم حبة جديدة) = [(متوسط تشغيل) / 110] * (حجم حبة السابقة). وينبغي تعديل وحدات التخزين حبة بهذه الطريقة عن كل 8 أشواط أو حسب الحاجة. عادة، 3-4 ميكرولتر من كل حبة مغناطيسية (أعدت على النحو الوارد أعلاه) وتستخدم لتجربة 2-لوحة.
    5. اغسل مزيج الخرزة المغناطيسية 2x في مخزن FlyP المؤقت مع الفصل المغناطيسي، ثم قم بإعادة الإيقاف مؤقتًا في مخزن FlyP المؤقت. لإعادة التعليق، استخدم 10 ميكرولتر لكل عينة لكل طبق. الحاجز FlyP هو 100 مل NaCl، 50 mM تريس الحموضة 7.4، 1٪BSA، 0.01٪ NaN 3.
    6. بعد دوامة تماما مزيج حبة المغناطيسي، aliquot 10 € L في أنابيب الطرد المركزي الباردة الجليد (أنبوب واحد لكل عينة). إضافة كميات متساوية من lysate (مع تركيزات طبيعية) إلى كل أنبوب لهطول الأمطار المناعية.
    7. Aliquot خليط حبة lysate المغناطيسي في أنبوب واحد لكل لوحة يجري تشغيلها. على سبيل المثال لتجربة 2-لوحة، وتقسيم lysate إلى اثنين من الأنابيب. وضع أنابيب على الدوار في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها لهطول الأمطار المناعية، مغطاة للحفاظ على الضوء.
  3. تشغيل التساي (اليوم 2)
    1. تبدأ مع أنابيب حبة lysate المغناطيسي للوحة #1. استخدام رف حبة المغناطيسي لإزالة lysate من الخرز المغناطيسي، وحجز lysate للتحليل في المستقبل. غسل الخرز 2X في 500 درجة مئوية من الجليد الباردة FlyP العازلة. الحفاظ على أنابيب أنابيب دائما على الجليد أو في 4 درجة مئوية.
    2. حساب وحدة التخزين إعادة التعليق على أنها (عدد المسبارات) * (2 تكرار التقنية) * (25 درجة مئوية لكل بئر) * (1.1 لخطأ الأنابيب). إعادة تعليق IPs في الحجم المحسوب للمخزن المؤقت FlyP الباردة الجليد.
    3. بعد إعادة تعليق تماما الخرز المغناطيسي عن طريق الأنابيب لطيف، وتوزيع 25 درجة مئوية لكل بئر عبر لوحة 96 جيدا مسطحة القاع، على الجليد.
    4. في لوحة مختلفة 96 جيدا، تمييع الأجسام المضادة التحقيق biotinylated إلى تركيز العمل 2X (تركيز العمل هو عادة 1:100 أو 1:200، محددة تجريبيا) في العازلة FlyP بحيث يطابق ترتيبها الأعمدة على تخطيط لوحة (انظر الشكل 3 ). الحجم النهائي للأجسام المضادة التحقيق في تركيز العمل سيكون 50 ميكرولتر لكل بئر، وبالتالي فإن حجم كل 2X الأجسام المضادة أعدت ينبغي أن يكون (25 درجة مئوية) * (عدد العينات البيولوجية) * (2 تكرار التقنية) * (1.1 لخطأ الأنابيب).
    5. استخدام ماصة متعددة القنوات لتوزيع 25 درجة مئوية من كل تخفيف الأجسام المضادة التحقيق في لوحة فحص المغناطيسي التي تحتوي على حبة.
    6. يهز على لوحة أفقية شاكر لخلط وإعادة تعليق الخرز المغناطيسي، ومن ثم حضانة في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، ويهز في 450 دورة في الدقيقة في الظلام.
    7. اغسل 3x مع عازل FlyP على غسالة لوحة مغناطيسية عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
    8. إعادة تعليق الخرز المغناطيسي في 50 درجة مئوية من 1:200 Streptavidin-PE.
    9. يُرج المزيج وإعادة تعليق الخرز، ثم يُقبّع عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة، ويهز عند 450 دورة في الدقيقة في الظلام.
    10. اغسل 3x مع عازل FlyP على غسالة لوحة مغناطيسية عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
    11. إعادة تعليق في 125 μL من المخزن المؤقت FlyP.
    12. يُرج لمدة دقيقة واحدة عند 900 دورة في الدقيقة لإعادة تعليق الخرز.
    13. تشغيل على مقياس السيتومتر تدفق المبردة (انظر الرسم البياني في الشكل S1). استخدم إعداد "الهدف RP1 العالي" في برنامج مقياس السيتومتر، وحالة إيقاف 1000 حبة لكل منطقة (تجاوز كبير الرقم الذي ينبغي أن يكون في أي بئر فردي لمنع الجهاز من التوقف قبل الأوان) وحجم العينة من 80 ميكرولتر.
    14. إيقاف تشغيل في منتصف الطريق من خلال وإعادة تعليق الخرز لمنع تسوية.
    15. تصدير ملفات البيانات بتنسيق .xml.
    16. كرر عملية اللوحات المتبقية، بدءاً من الخطوة 3.3.1.

4 - تحليل البيانات

ملاحظة: تم تصميم التعليمات البرمجية ANC لمقارنة شرطين من N = 4 تجارب كل مع 2 النسخ المتماثل التقنية لكل شرط. على سبيل المثال، يتم تحفيز الخلايا أربع مرات مستقلة، يتم تشغيل QMI على أربعة أيام مختلفة على التحكم (غير محفز) والخلايا المحفزة، مع تكرار التقنية كما هو موضح أعلاه، وعائدات تحليل البيانات كما هو موضح أدناه.

  1. غير بارامترية التكيف مع قطع ألفا قابل للتعديل (ANC)
    1. افتح MATLAB وتعيين الدليل النشط إلى مجلد يحتوي على مكونات برنامج ANC وملفات .xml التي تم تصديرها من مقياس التدفق.
    2. املأ ملف "إدخال المؤتمر عن الشعب" ليعكس تفاصيل التصميم التجريبي. تم تعبئة ملف المثال المضمن في "ملف تكميلي" مسبقاً لتشغيل بيانات المثال المتوفرة أيضاً.
    3. تشغيل البرنامج الذي سيقوم بكتابة ملف .csv في الدليل النشط. تقارير الملف PiSCES التي تختلف بشكل ملحوظ، على مستوى إيجابي زائف (ألفا) من 0.05، بين التحكم والظروف التجريبية، في كافة النسخ المتماثل التجريبية 4، أو على الأقل 3/4 النسخ المتماثل.
    4. ملاحظة 'يضرب ANC،' التي يتم تعريفها على أنها PiSCES مع اختلافات كبيرة في ما لا يقل عن 3 عمليات تكرار تجريبية، ممثلة في 3/4 € 4/4 في الملف، للاستخدام في الخطوة 4.3.1.
  2. تحليل شبكة الارتباط المرجح23 (CNA)
    1. لصق تبديل عناوين الأعمدة إخراج ملف البيانات بواسطة Matlab تنتهي في "_MFI. CSV" في الصف الأول من ورقة excel جديدة. إضافة الأعمدة "تجربة" لرقم التجربة، و "العلاج"، للعلاج التجريبي، أو أي متغيرات أخرى لتحليلها. حفظ هذا الملف كـ "traits.csv".
    2. افتح Studio R وتعيين دليل العمل إلى مجلد يحتوي على "_MFI. CSV" و "الصفات. CSV" الملفات.
    3. قم بتشغيل أوامر R كما هو موضح في ملف الأمر الذي تمت تعليقه والمفصلة في الإرشادات المضمنة مع الملفات. وحدات WCNA ترتبط بشكل كبير مع كل سمة تجريبية هي الإخراج كملف رسومي، والارتباط بين كل تفاعل IPi_ProbeJ مع كل وحدة نمطية هو الإخراج كملف .csv.
    4. ملاحظة 'CNA يضرب،' التي يتم تعريفها على أنها تفاعلات مع عضوية الوحدة النمطية (MM) > 0.7 و p < 0.05 للعضوية في وحدة نمطية تم تحديدها على أنها مرتبطة بشكل كبير مع المتغير التجريبي للاهتمام، للاستخدام في الخطوة 4.3.1.
  3. "الزيارات" الإيجابية والتصور
    1. لكل تفاعل في قائمة "3/4 € 4/4 مرات الدخول" في ملف إخراج المؤتمر الوطني العام (من الخطوة 4.1.4) ، حدد ما إذا كان هذا التفاعل أيضاً "ضرب CNA" عن طريق التحقق من ملف إخراج CNA (انظر الخطوة 4.2.6). إنشاء عمود جديد يشير إلى ما إذا كان كل ضرب ANC أيضاً ضرب CNA.
    2. حساب متوسط قيمة تغيير ضعف السجل2 لكل ANC - CNA ضرب عن طريق حساب متوسط القيم المعطاة في جدول بيانات إخراج ANC "_Hits.csv" من الخطوة 4.1.3. تحويل القيم إلىتغيير 2 أضعاف قبل المتوسط. للتفاعلات التي كانت هامة في نسخ متماثل 3/4 فقط، احذف القيمة الخارجية.
    3. قم بإجراء جدول بيانات مع كل ضرب ANC - CNA مدرج كـ IP في عمود واحد، ومسبار في العمود الثاني، وقيمة تغيير الطي في العمود الثالث. استخدم جدول البيانات هذا لإنشاء رسم تخطيطي على حافة العقدة في Cytoscape عن طريق استيراد الملف كشبكة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

فحص الأجسام المضادة
الشكل 2 B يظهر نتائج شاشة للبروتين Connexin36. معظم تركيبات IP_probe تنتج أي إشارة عبر عناصر التحكم IgG. IP مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة 1E5 والتحقيق مع إما 1E5 أو الأجسام المضادة متعددة النسيلة 6200 تنتج تحولا نحو اليمين في توزيع حبة مقارنة مع ا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يتطلب اختبار QMI استثمارات كبيرة في تطوير لوحة الأجسام المضادة والمعدات والكواشف، ولكن بمجرد إنشاء الفحص، يمكن للمرء جمع بيانات عالية الأبعاد لمراقبة شبكات التفاعل البروتينية لأنها تستجيب للرقابة التجريبية المحفزات. من الناحية الفنية، QMI يتطلب الأنابيب الدقيقة وتتبع مواقع العينة والأجس...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنها.

Acknowledgements

يرغب المؤلفون في الاعتراف بـ Tessa Davis لمساهماتها الهامة في تطوير تحليل QMI، والأعضاء الحاليين والسابقين في مختبرات سميث وشروم للتوجيه التقني والمدخلات الفكرية. تم تمويل هذا العمل من خلال منح NIMH R01 MH113545 و R00 MH 102244.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well flat bottomed platesBio Rad171025001
96-well PCR platesVWR82006-704
Bioplex 200 System with HTFBio Rad171000205modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash StationBio Rad30034376
BSASigma
CML beadsInvitrogenC37481
EDTASigmaE6758
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo ScientificA39256
MagPlex MicrospheresLuminexMC12xxx-01xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification KitThermo Scientific45206used for antibody purification
MESSigmaM3671
Microplate film, non-sterileUSA Scientific2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2SigmaP5726
Protease inhibitor cocktailSigmaP8340
Sandwich Prep RefrigeratorNorlakeSMP 36 15for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluorideSigma201154
Sodium orthovanadateSigma450243
Streptavidin-PEBioLegend405204
Sulfo NHSThermo ScientificA39269
TrisFisher ScientificBP152

References

  1. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  2. Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
  3. Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
  4. Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
  5. Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
  6. Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
  7. Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
  8. Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
  9. Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23(2005).
  10. Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
  11. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807(2010).
  12. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
  13. Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
  14. Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7(2016).
  15. Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science's STKE. 2007 (389), (2007).
  16. Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48(2018).
  17. Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
  18. Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
  19. Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
  20. Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
  21. Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722(2012).
  22. Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
  23. Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559(2008).
  24. Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

150 IP FCM QMI

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved