JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כמותית מולטיפלקס Immunoprecipitation (QMI) משתמשת cy, לנסות לגילוי רגיש של הבדלים בשפע של אינטראקציות חלבונים בחלבון ממוקדות בין שתי דגימות. QMI ניתן לבצע באמצעות כמות קטנה של ביומטריה, אינו דורש תגים מהונדסים גנטית, והוא יכול להיות מותאם עבור כל רשת בעבר הגדרת חלבון אינטראקציה.

Abstract

אינטראקציות חלבון חלבונים דינאמיות שולטות בהתנהגות התאית, מתנועתיות ועד לשכפול דנ א לסימני התמרה. עם זאת, מעקב אחר אינטראקציות דינמיות בין מספר חלבונים ברשת אינטראקציה חלבון היא קשה מבחינה טכנית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור כמותיים מולטיפלקס Immunoprecipitation (QMI), המאפשר הערכה כמותית של שינויי מקפלים באינטראקציות חלבונים המבוססות על מדידות זריחה יחסית של חלבונים במערכות משותפות שזוהו על ידי חשופים אפיסקופים מפני השטח (דגים). ב QMI, מכלולי חלבון מ-lysates תא הם immunoprecipitated על מיקרוספירות, ולאחר מכן נחקר עם נוגדן בתווית עבור חלבון שונה כדי לכמת את השפע של דגים. נוגדנים Immunoprecipitation מובחנות אזורים ספקטרליים שונים, אשר מאפשר cytometer זרם להבדיל immunoprecipitations מקבילים מרובים ובמקביל לכמת את כמות נוגדן בדיקה הקשורים לכל. QMI אינו דורש תיוג גנטי ניתן לבצע באמצעות ביומטריה מינימלית לעומת שיטות immunoprecipitation אחרות. QMI יכול להיות מותאם עבור כל קבוצה מוגדרת של שימוש בחלבונים, ולכן יש עד כה שימש לאפיון רשתות איתות בתאי T ו-הסינפסות העצבית גלוטמט. התוצאות הובילו ליצירת השערה חדשה עם יישומים פוטנציאליים אבחון וטיפולי. פרוטוקול זה כולל הוראות לבצע qmi, מן הבחירה הראשונית הפאנל הנוגדן דרך להפעיל בחני וניתוח נתונים. ההרכבה הראשונית של שיטת QMI כרוכה בסינון נוגדנים ליצירת פאנל, וקביעת מאגר פירוק מתאים. ההכנה הכימית הבאה כוללת מצמד מimmunoprecipitation נוגדנים לחרוזי מאגי, ונוגדנים ביולוגיים מבוססי ביוטילוטינג כך שהם יכולים להיות מסומנים על-ידי fluorophore streptavidin. כדי להפעיל את הבדיקה, ליפוסט מעורבב עם מאגחרוזים בן לילה, ולאחר מכן חרוזים מחולקים מודבטים עם נוגדנים בדיקה שונים, ולאחר מכן תווית fluorophore ולקרוא על-ידי cy, הזרמת לנסות. שני בדיקות סטטיסטיות מתבצעות כדי לזהות את הדגים שונים באופן משמעותי בין התנאים הניסיוניים, והתוצאות מתדמיינו באמצעות מפות חום או דיאגרמות קצה הצומת.

Introduction

אינטראקציות חלבונים בחלבון חלבון מהוות מבני איתות מולקולריים ומבנים מורצפת המהווים את הבסיס התפקודי של רוב הפיזיולוגיה התאית1. תהליכים אלה מתוארים לעתים קרובות כמסלולים איתות ליניארי העוברים בין מצבים יציבים המבוססים על תשומות יחיד, אבל נתונים ניסיוניים ומידול מראים בבירור שהם מתפקדים כרשתות משולבות2,3, 4. במקרה של G חלבונים, קולטנים שונים לעתים קרובות יש את היכולת להפעיל את אותו חלבון G, ו קולטן יחיד יכול גם להפעיל יותר מסוג אחד של g חלבון5,6. על מנת מספר קטן יחסית של שיעורי חלבון G לווסת במיוחד מגוון רחב של פונקציות סלולריות כגון שידור סינפטית, רגולציה הורמונלי, ואת הגירה התא, תאים חייבים להשתלב ולהבחין אותות אלה4 , 5. ראיות הראו כי האות הזה ספציפיות, עבור החלבונים של G, כמו גם אחרים, נגזר בעיקר על בסיס של אינטראקציות חלבון חלבונים מכוונים דק ודינמיקה הטמפורלית שלהם1,3, ד , מיכל 5 , מיכל בן 6 , 7. מכיוון רשתות איתות מורכבות של מכלולי חלבון דינאמי עם מספר תשומות, תפוקות, ולולאות משוב, הזדמנות בודדת יש את ההזדמנות לשנות את המאזן הכולל הומסטטי של הפיזיולוגיה של התא4 ,7. כעת מוסכם באופן נרחב כי האיתות צריך להיבדק מנקודת מבט של רשת כדי להבין טוב יותר כיצד השילוב של תשומות מרובות שולט בפונקציות הסלולר הדיסקרטית בבריאות ובמחלות7,8, . תשע,עשר,11,12,13 לאור זה, כמותית מולטיפלקס Immunoprecipitation (QMI) פותחה כדי לאסוף תפוקה בינונית, נתונים כמותיים על שינויים לקפל ברשתות מגע דינמי של חלבון.

QMI הוא שיטת נוגדן מבוססת שבו ליפוסט התא הוא מודבטים עם פאנל של נוגדנים immunoprecipitation כי הם מצמידים מגנטי חרוזים מגנטיים המכילים יחסי צבע שונים של צבעי פלורסנט. לאחר נוגדנים ספציפיים מצמידים לכיתות שונות חרוז מגנטי מאפשר בו co-immunoprecipitation של מספר חלבונים מטרה מתוך ליפוסט זהה. לאחר immunoprecipitation (IP), חרוזים מגנטיים הם מודבטים עם שנייה, fluorophore מעלה באוב נוגדן בדיקה (או נוגדן biotinylated בשילוב עם fluorophore מצועם streptavidin). שיתוף אסוציאציות בין החלבונים המוכרים על ידי כל נוגדן IP בדיקה הצמד, או דגים (חלבונים במערכות משותפות שזוהו על ידי אפיסקופים חשופים משטח), מזוהים אז על ידי הזרמת cy, וניתן לכמת בהשוואה בין שונות תנאים לדוגמה14. איורים באיור 1 להראות את השלבים המעורבים בהפעלת שיטת qmi, כולל דיאגרמה של חרוזים מגנטיים עם immunoprecipitated מתחמי חלבון המסומנים על ידי פלואור בדיקה בדיקת נוגדנים (איור 1ג).

הרגישות של QMI תלוי בריכוז החלבון של ליפוסט ביחס למספר חרוזים מגנטיים המשמשים לimmunoprecipitation, והשגת החלטה לזהות 10% מקפלים שינויים דורש רק כמות קטנה של חומר התחלתי לעומת אחרים שיתוף IP שיטות14,15. לדוגמה, כמות חומר ההתחלה שנעשה בו שימוש QMI דומה לזה הנדרש עבור כריך חיסוני מקושר אנזים (אליסה), אבל אינטראקציות מרובות מזוהים בתוך שיטת QMI אחת. Qmi בחני באמצעות 20 IPs ו 20 מטרות המחקר בוצעו באמצעות 1-5 x 105 הראשי T תאים מבודדים מתוך 4 ביופסיה העור, P2 synaptosomal ההכנות מ 3 מ"מ בסעיף ילתית של קליפת העכבר הקדם, או 3 x 106 העכבר הראשי העיקרי , נוירונים, מ,מאוד. רגישות זו גורמת QMI שימושי ניתוח של תאים או רקמה עם זמינות מוגבלת, כגון דגימות קליניות.

QMI יכול להיות מותאם עבור כל רשת האינטראקציה הקודמת שהוגדרו חלבון (בתנאי שנוגדנים זמינים), ועד היום פותחה כדי לנתח את קולטן האנטיגן של תא T (TCR) מערכת המשנה של חלבונים ב glutamatergic הסינפסות בנוירונים מיכל בן 17 , 18. במחקרים של האיתות קולטן תא T, qmi השתמשו לראשונה לזהות שינויים גירוי המושרה בדגים, ולאחר מכן כדי להבחין חולים אוטואימוניות מקבוצת שליטה, לזהות מאותת אוטואימוניות אנדוסוגני, ולבסוף כדי ליצור השערה מעורבים רשת משנה לא מאוזנת הקשורה למחלה של אינטראקציות14. לאחרונה, את אותו פאנל QMI שימש כדי לקבוע כי thymocyte הבחירה נקבעת על ידי כמותית ולא הבדלים איכותניים ב-TCR-המשויך חלבון איתות19. בנוירונים, QMI שימש לתאר הסדר מחדש הקלט של רשת אינטראקציה חלבון עבור סוגים שונים של אותות קלט באופן התומך מודלים חדשים המתעוררים של הפלסטיות הסינפטית17. בנוסף, זה הפאנל QMI סינפטית שימש כדי לזהות הבדלים שבעה מודלים של העכבר אוטיזם, אשכול את המודלים לקבוצות משנה על בסיס הביוחתימות שלהם דגים, ובמדויק ההשערה גרעון מולקולרי משותף כי היה בעבר לא מוכר באחד מדגמי16. גישה דומה יכולה לשמש לצורך המסך עבור קבוצות מסחר אחרות שעלולות להגיב לטיפולי סמים שונים, או להקצות תרופות לקבוצות מסוימות המגיבים לתגובה. QMI יש יישומים פוטנציאליים באבחון, משנה הקלדה החולה, פיתוח סמים, בנוסף למדע בסיסי.

כדי להרכיב פאנל נוגדן QMI, הקרנת נוגדנים ראשונית ופרוטוקולי בחירה מתוארים בסעיף 1, להלן. לאחר לוחות נוגדנים מזוהים, פרוטוקולים עבור בניינים של נוגדנים שנבחרו לחרוזים מגנטיים עבור IP, ו עבור biotinylation של נוגדנים בדיקה שנבחרו, מתוארים בסעיף 2. הפרוטוקול להפעלת הערך QMI בתאים או ברקמות מתואר בסעיף 3. לבסוף, מאחר שניסוי בודד יכול להפיק ~ 5 x 105 נקודות נתונים בודדות, הוראות וקודי מחשב כדי לסייע בעיבוד נתונים, ניתוח והדמיה מסופקים בסעיף 4. מבט כולל על זרימת העבודה המתוארת בסעיפים 2-4 מוצג באיור 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. עיצוב שיטת התכנון

  1. הכנת נוגדן המועמד
    1. עבור כל חלבון של עניין, לבחור 3 כדי 5 נוגדנים למסך. במידת האפשר, השתמשו בנוגדנים חד-שבטיים המכירים באפיסקופים שונים. כלול גם נוגדן אחד שאינו ספציפי לפקד.
    2. כדי להסיר טריס, לבצע חילופי מאגר על ידי הוספת נוגדן למסנן 30 kDa ספין, מסתחרר למטה לנפח המינימלי שלה, הוספת 500 μL של מלוחים באגירה פוספט (PBS), ו חוזר 3 פעמים. כדי להסיר את החלבונים הנושא, לבצע טיהור נוגדנים בהתאם לפרוטוקול של היצרן (ראה טבלת חומרים להמלצה מסוימת של טיהור).
      הערה: זה נעשה בגלל חלבונים הנושא ומאגרים עם קבוצות אמין חינם (כגון טריס) יגיב עם הקבוצות COOH ולהרוות את צימוד חרוז הבאים ותגובות biotinylation. ודא כי כל הנוגדנים מטוהרים (אין חלבונים הספק) ובמאגר ללא אמינים הראשי (כלומר, לא טריס).
    3. זוג כל נוגדן שונה carboxylate אוחר לייטקס (CML) חרוזים כפי שמתואר על ידי דיוויס ו Schrum20. כדי לשמר את הנוגדן, לשנות את היקף תגובות צימוד חרוז על ידי עד 1/5 (כלומר, 3.6 x 106 חרוזים עם 10 μl של 0.2-1 מ"ג/mL נוגדן).
    4. הערכת מספרי חרוזים באמצעות הטקיטומטר (בדרך כלל~ 10/mL) ולאחסן ב-4 ° c. חרוזים אוחסנו במשך יותר משנה ובשימוש בהצלחה QMI assays, אבל חיי מדף או תאריכי תפוגה לא הוקמו רשמית. נאן3 במאגר B/S מונע צמיחה חיידקית.
    5. בbiotinylate אוחר חלק של כל נוגדן (ראה סעיף 2.2 להלן). חנות ב -4 ° c.
    6. אשר את הצימוד האפקטיבי CML חרוז וספירה מדויקת על ידי כתמים 1 x 105 חרוזים עם נוגדן PE מצוכני תגובתי למינים בהם הנוגדן הועלה וקרא על cytometer זרימה.
    7. לאשר ביוקטילציה נוגדן על ידי כתם בנקודה באמצעות streptavidin-HRP.
    8. לאחר המעבדה יצרה ריאגנטים כי ידועים להיות יעילים, להשתמש אלה ריאגנטים כמו פקדים חיוביים בתגובות אישור בשלבים 1.1.5 ו 1.1.6.
  2. הקרנת נוגדנים על ידי IP-FCM (immunoprecipitation שאותרו על ידי זרם cy, לנסות)
    1. החליטו על הקרנת מעגל מתאימה. בשביל זה וכל הפעולות האחרות לסינון טרום QMI (כל דבר הכלול בסעיף זה 1: עיצוב שיטת), אין להשתמש בדגימות biosamples בזמינות מוגבלת. במקום זאת, בחר בחומר שליטה דומה, כגון רקמת עכבר מסוג wildtype, קווי תאים או רקמה רגילה של תורם אנושי שאינו משאב מגביל.
      הערה: בחירת מאגר פירוק לצורך מיון זה אינה טריוויאלית, והיא נדונה בסעיף 1.5: בחירת חומרי ניקוי, כמו גם בפיסקה הפנסופית של המקטע ' דיון '. מאגרי הליזה הסטנדרטיים יש בסיס של 150 מ"מ היאנול, 50 mM טריס (pH 7.4), 10 מ"מ נתרן פלואוריד, 2 מ"מ מילימטר נתרן, ו פרוטאז ו פוספאטואז מעכבי קוקטיילים. חומרי ניקוי התואמים ל-qmi כוללים 1% NP-40, 1% דיגיטלי, 0.1-1% טריטון X-100, ו-0.5-1% ביטול המרה14,16,17,18,19,21.
    2. חישוב הנפח הכולל של lysate לשמש כל IP, באמצעות 10 μL עבור כל שילוב IP-בדיקה להיות מוקרן. אם הקרנת X בדיקה נוגדנים ושימוש אחד IgG בקרה, כל IP ישתמש (X +1) * (10 μL) * (1.1 עבור שגיאה pipetting); X + 1 מהווה חשבון עבור בקרת הבדיקה הדרושה של IgG. לדוגמה, במסך נוגדן 3x3, כל IP צריך להשתמש 44 ul. זכור לכלול בקרת IgG IP (ראה לדוגמה הגדרת הקרנה באיור 2).
    3. חשב את מספר חרוז ה-CML שישמש. אם אתם מהקרנה נוגדנים X הבדיקה, השתמש [(X +1) * 5 X 104 חרוזים]. באופן אידיאלי, 5,000 חרוזים לכל טוב יהיה התוצאה > 2000 חרוזים לכל טוב להיות לקרוא על ידי cytometer הזרימה. למשל, ב 3 x 3 מסך נוגדן, כל IP צריך להשתמש 20,000 חרוזים, שהוא כ 0.66 μL של הכין מלאי חרוז CML משלב 1.1.3 (חרוזים צריך להיות הראשון כימות באמצעות הומוציטוטומטר כדי להבטיח דיוק).
    4. מקרין את הנפח של ליפוסט משלב 1.2.2 עם הנפח של כל חרוז CML להיות מוקרן משלב 1.2.3, לילה ב 4 ° c עם סיבוב כדי למנוע חרוזים להתיישב. בדרך כלל, לבצע incubations בעמודה הראשונה של לוחית ה-PCR 96-ובכן, וכובע עם כמוסות רצועת צינור PCR.
    5. ספין למטה מחרוזות CML ב 3,200 x g עבור 1 דקות ולהסיר להוריד ידי אחד, מהיר הצליף של צלחת מעל הכיור. גלולה לבנה זעירה צריך להיות גלוי בתחתית של כל באר גם לפני ואחרי הצליף.
    6. השהה מחדש CML חרוזים בנפח של מאגר FlyP שווה 20 μL עבור כל מחרוזת חרוז-לחקור; עבור השימוש בנוגדנים X, השתמש (X + 1) * (20 μL) * (1.1 עבור שגיאת ליטוף), בדומה לשלב 1.2.2. עבור מסך 3 x 3, השהה מחדש ב-88 μL של מאגר FlyP. מאגר FlyP הוא 100 mM הנאל, 50 mM Tris pH 7.4, 1% BSA, 0.01% NaN3.
    7. הפץ כל IP לאורך (X + 1) בארות של צלחת 96-היטב PCR, כאשר X הוא מספר נוגדנים בדיקה להיות מוקרן, באמצעות 20 μL/טוב. איור 2 הצגה של הגדרת הקרנה לדוגמה.
    8. לשטוף 2 פעמים נוספות באמצעות 200 μL של מאגר FlyP לכל טוב. ספין הצלחת כמו בשלב 1.2.5 ו קפיצי את הצלחת להסיר את המאגר לשטוף לאחר כל לשטוף. כדורי יהיה קטן מאוד, אבל צריך להיות גלוי לאחר כל כביסה.
    9. עבור כל נוגדן biotinylated להיות מוקרן, לחשב את הנפח הכולל כמו (Y + 1) * 1.1 * 50 μL, כאשר Y הוא מספר נוגדנים IP הוקרן. לדלל נוגדן ריכוז עבודה בנפח זה של מאגר FlyP, בדרך כלל מתחיל עם 1:100 דילול של 0.5 mg/mL מניות.
    10. הפץ כל נוגדן מדולל למטה כל עמודה של 96 צלחת הבאר, ולהבטיח חרוזים CML הם מושעה מחדש.
    11. דגירה ב 4 ° צ' עבור 1 h, עם סיבוב או ליטוף ב 15 דקות במרווחי זמן כדי להבטיח חרוזים CML להישאר בהשעיה.
    12. שטוף 3x ב 200 μL של מאגר FlyP, עבור כל צנטריפוגה לשטוף ולהסיר lysate כמו בשלב 1.2.5.
    13. השהה מחדש את כל חרוזי CML ב-50 μL של 1:200 Streptavidin-PE במאגר FlyP.
    14. מודטה ב -4 ° c בחשכה במשך 30 דקות.
    15. שטוף 3x ב 200 μL של מאגר FlyP, עבור כל צנטריפוגה לשטוף ולהסיר lysate כמו בשלב 1.2.5.
    16. השהה מחדש ב-200 μL של מאגר FlyP ולאחר מכן הפעל על cytometer זרימה.
  3. בחירה באפשרות ' נוגדנים לכלילה ' בשיטת הבחירה
    1. שער בגודל באמצעות FSC-H vs-H, ולחסל doublets באמצעות FSC-H vs FSC-A.
    2. צור היסטגרמות של עוצמת הקרינה של PE ושכבת-על הן בקרות IgG (בדיקה IgG חרוז לבדוק, מבחן חרוז-IgG בדיקה) על זוגות נבדק (איור 2).
    3. חפש זוג חרוז-בדיקה שנותן אות ברור מעל רעש (איור 2ב). בנוסף, זה לא אידיאלי להשתמש באותו נוגדן עבור חרוז וגם לחקור. זיהוי אפירופה דיפרנציאלי מגדיל את הסיכויים להתבוננות באינטראקציות, מכיוון שחלק מהאפיסקופים עלולים להיות מפוספסים במערכות חלבונים מסוימות. אם אין אפשרויות מקובלות, חזור על המסך עם נוגדנים נוספים.
  4. אישור של נוגדנים ספציפיות
    1. כדי להבטיח ספציפיות של נוגדנים עבור המטרות המיועדות, השתמש במדגם ליפוסט שבו היעד הופל; לדוגמה, עכבר מנוקאאוט או קו תא RNAi. לחילופין, השתמש בליפוסט מתוך קו תא שלילי-יעד שבו חלבון היעד התבטא באופן מלאכותי.
    2. לבצע IP-FCM כפי שמתואר בשלב 1.2, שינוי כדי להתאים את הניסוי.
  5. אבקת בחירה
    1. כמו חומרי ניקוי הם קריטיים בניסויים שיתוף IP, בדיקה מדעית וריאציות שונות כדי להבטיח כי השינוי יש סבירות מקסימלית של גילוי שינויים. כדי להתחיל, לבחור פאנל קטן יחסית של אינטראקציות (4-8) כי ידועים לשנות בתנאי נתון ו/או הם מעניין במיוחד למחקר שלך.
    2. באמצעות שאינם פלורסנט, מעלה נוגדנים CML חרוזים שנעשו עבור מסכי הראשונית, לבצע IP-FCM כפי שמתואר בשנת 1.2 באמצעות מגוון לפירוק מאגר התנאים ניקוי. מסכי ניקוי ניתן לבצע עם תכשיר ניקוי כמשתנה היחיד, או עם תנאי תא שונים עבור כל ניקוי. תמיד להשתמש בפקדים IgG עבור החרוזים והגששים, מאז חומרי ניקוי מדי פעם לייצר רקע בלתי צפוי בכמה שילובים IP-בדיקה.
    3. בהתבסס על MFIs מהמסך, לבחור כביסה הממטבת את האות של מזל דגים. סביר להניח שיהיה צורך להתפשר על22.

2. הכנת מולטיפלקס

  1. מצמד חרוזים מגנטי
    1. באמצעות מפת אזור החרוזים המגנטי, בחר אזורי חרוז לשימוש בתבנית המקטינה את הסיכון לזיהוי צולב. חרוז מגנטי בדרך כלל למרוח למעלה וימינה, כך להימנע אזורי חרוז הסמוכים באלכסון. חרוזים מכל טור אחר של דיאגרמת חרוז המוצגת באתר לומיקס מומלצים (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/).
    2. הכינו את הנוגדן ללא ספק ב 0.1 מ"ג/mL ב-PBS (כמו ב-1.1.2) ב 250 μL. שמור על קרח לשימוש מאוחר יותר.
    3. מערבולת מגנטית חרוזים בהרחבה, ולאחר מכן סדרת מחלקים 250 μl לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה ענבר (כדי להגן על חרוזים מ photobleaching לבנה).
    4. חרוזים מגנטיים נפרדים עבור 60 s ולהסיר את הסופרנטאנט.
    5. הוסף 250 μL של מאגר MES (50 mM MES-pH 6.0, 1 מ"מ EDTA), מערבולת, נפרד מגנט עבור 60 s, ולהסיר את הסופרנטאנט. חזור והשהה מחדש חרוזים מגנטיים ב-200 μL של מאגר MES.
    6. הוסף 40 μL של MES ל 2 מ ג של שפופרת יחיד לשימוש של Sulfo-כמובן כדי לבצע מלאי mg/mL של 50.
    7. הוסף 25 μL של סולפו-מטפל טרי על החרוזים המגנטיים. ערבולת.
    8. הוסף 25 μL של 50 מ"ג/mL טרי מומס [1-אתיל-3-( -3-dimethylaminopropyl) קרבודיאימיד הידרוכלוריד, המכונה גם EDAC] ב-MES מאגר. ערבולת.
    9. לכסות ולטלטל על וורטקר עם אביזר החזקת שפופרת עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר, 1000 סל ד.
    10. נפרדים ממגנטים עבור 60 s ולהסיר את הסופרנטאנט.
    11. השהה מחדש ב-500 μL של PBS, מערבולת, נפרד באופן מגנט עבור 60 s ולהסיר את הסופרנטאנט. חזור על.
    12. השהה מחדש ב-250 μL של פתרון נוגדן משלב 2.1.2. ערבולת.
    13. דגירה 2 h ב temp בחדר עם טלטול על vortexer ב 1000 סל ד.
    14. הוסף 500 μL של PBS לחרוזים מגנטיים, מערבולת, נפרד מגנטית עבור 60 s, ולהסיר את supernatant.
    15. הוסף 750 μL של חסימת/אחסון (B/S) מאגר (1% BSA ב-PBS pH 7.4, 0.01% נאן3). כיסוי ו-דגירה 30 דקות בחדר temp, 1000 סל ד.
    16. נפרדים ממגנטים עבור 60 s ולהסיר את הסופרנטאנט. השהה מחדש ב-100 μL של מאגר B/S.
    17. חנות ב -4 ° c. חרוזים אוחסנו במשך יותר משנה ובשימוש בהצלחה QMI assays, אבל חיי מדף או תאריכי תפוגה לא הוקמו רשמית. נאן3 במאגר B/S צריך למנוע צמיחה חיידקית.
    18. אימות צימוד חרוזים מגנטי על ידי צביעת ~ 0.25 μL של בשילוב חרוזים מגנטיים עם מינים אנטי-מארחים פלורסנט משני וקריאה על cytometer כמו בשלב 1.1.5.
  2. ביוטילציה
    1. תוודא שנוגדנים נמצאים ב-PBS. ללא חלבון מוביל
    2. חישוב הסכום μg של נוגדן להיות biotinylated (100-200 μg מומלץ לשימוש במגה-פלקס, 25-50 μg מומלץ להקרנה).
    3. להכין טרי 10 מ"מ sulfo-ביוטין (ניתן לעשות על ידי הוספת 224 μL של ddH2O ל 1 mg ללא שקילה צינור).
    4. הוסף 1 μL של 10 מ"מ מילימטר sulfo-ביוטין לכל 25 μg של נוגדן, מערבולת או פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב.
    5. . מיכל החום של החדר בשעה 1
    6. מודטה ב -4 ° c עבור 1 h.
    7. השתמש במסנן טווח של 30 kda כדי להסיר ביוטין לא מאוגד ולהפסיק את התגובה. הוסף 500 μL של PBS וסובב את העמודה עד שיגיע לאמצעי האחסון המינימלי. הוסף 500 μL של PBS נוסף וחזור על 3 החלפת מאגר כולל.
    8. הערכת ריכוז על ידי מדידת ספיגה של 1-2 μL על ספקטרוסקופיה, ולאחר מכן להביא את הריכוז נוגדן 0.5 mg/mL.
    9. חנות ב -4 ° c.

3. מimmunoprecipitation לקולנוע כמותי

  1. מבנה לוח
    הערה: שיטת עבודה זו פועלת בדרך הטובה ביותר כאשר מבוצעת באמצעות 96-הצלחות לוחיות הרישוי ו2-4 התנאים
    1. הפעל תמיד פקדים מתאימים (כלומר, מוסטימולציה של תאים ממריצים) על אותה צלחת, כדי לזהות שינויים בין התנאים. הפץ כל דוגמה אופקית לאורך הצלחת, והשתמש בכל עמודה עבור נוגדן בדיקה שונה. סט של משכפל טכני עבור כל בדיקה יש להפעיל מיד לאחר הסט הראשון. ראה איור 3 לדוגמה.
    2. תעד בקפידה את פריסת הצלחת כדי להקל על טעינת וניתוח מדויקים של הצלחת.
  2. הכנה לדוגמה & immunoprecipitation (יום 1)
    1. Lyse רקמה או תאים בניקוי המתאים עם פרוטאז ו פוספספטאז מעכבי ו-דגירה על הקרח עבור 15 דקות. שמרו על הקור הצונן כל הזמן.
      הערה: בפיסקה השלישית של המבוא, יש לקבוע בדיוק את הכמות המדויקת של ריכוז החומר הניתן לשימוש בחלבונים והתרכזות בחלבון. באופן כללי, בטווח של 200 μL של 2 mg/mL חלבון לכל מדגם כבר הצליח בעבר 20 IP ו 20 מטרות הבדיקה, אבל התשומות האידיאלי עבור כל פאנל נוגדן תא או סוג רקמות יש לקבוע אמפירי.
    2. ספין למטה ב 4 ° צ' עבור 15 דקות ב 16,000 x g כדי להסיר ממברנות ופסולת; לשמור על הסופרנטאנט כליפוסט.
    3. בצע שיטת BCA או דומה לקביעת ריכוזי חלבונים, ולאחר מכן הנרמל את ריכוז החלבון בין הדגימות. בשעת שימוש בתאים, התחילו במספר שווה של תאים לכל תנאי ונורמליזציה היא אופציונלית.
    4. הכינו תמהיל חרוזים מגנטי מאסטר המכיל ~ 250 חרוזים מגנטיים של כל מחלקה בכל טוב בתוך השיטת. כוונן את מספרי החרוזים לאחר ניתוח נתונים כך שבעשור העתידי נאמר ממוצע של 110 חרוזים של כל מחלקה ייקרא בהתאם.
      הערה: חישוב לדוגמה: (נפח חרוז חדש) = [(ממוצע הפעלה)/110] * (כמות החרוז הקודמת). יש לכוונן אמצעי אחסון של חרוז באופן זה על כל 8 רצפים או לפי הצורך. בדרך כלל, 3-4 μL של כל חרוז מגנטי (מוכן לעיל) משמשים לניסוי של 2 צלחות.
    5. לשטוף את שילוב חרוז מגנטי 2x במאגר FlyP עם הפרדה מגנטית, ולאחר מכן להשעות מחדש במאגר FlyP. עבור השעיה מחדש, השתמש 10 μL לכל מדגם לכל צלחת. מאגר FlyP הוא 100 mM הנאל, 50 mM Tris pH 7.4, 1% BSA, 0.01% NaN3.
    6. לאחר ביסודיות והורטקסלערבב מגנטי חרוז, סדרת מחלקים 10 μl לתוך צינורות קרח קר מיקרוצנטריפוגה (שפופרת אחת לכל מדגם). הוסף כמויות שוות של ליפוסט (עם ריכוזים מנורמל) לכל צינור לimmunoprecipitation.
    7. מחלקים את התערובת ליפוסט-מגנטית לתוך צינור אחד עבור כל צלחת לרוץ; לדוגמה לניסוי של 2 צלחות, פצל את הליפוסט לשתי שפופרות. מניחים צינורות על מסובבי ב 4 ° c לילה לimmunoprecipitation, מכוסה לשמור על האור.
  3. הפעלת המנה (יום 2)
    1. התחל עם שפופרות ליפוסט-מגנטית ל#1 צלחת. השתמשו במדף חרוזים מגנטי כדי להסיר את הליפוסט מהחרוזים המגנטיים, והזמינו משמורת לניתוח עתידי. שטוף חרוזים 2x ב 500 μL של מאגר FlyP קר קרח. שמרו על צינוריות צינורות תמיד בקרח או ב -4 ° c.
    2. חישוב השעיה מחדש כמו (מספר של הבדיקות) * (2 משכפל טכני) * (25 μL לכל טוב) * (1.1 עבור שגיאת ליטוף). השהה מחדש את IPs בנפח מחושב של מאגר FlyP קר-קרח.
    3. לאחר השעיית מחדש ביסודיות חרוזים מגנטיים על ידי ליטוף עדין, לפזר 25 μL לכל טוב על פני התחתית שטוח 96 צלחת היטב, על קרח.
    4. בצלחת שונים 96-באר, לדלל נוגדנים בדיקה biotinylated כדי 2x העבודה הריכוז (עבודה ריכוז הוא בדרך כלל 1:100 או 1:200, הקבועים באופן אמפירי) במאגר FlyP כך הסדר שלהם תואם את העמודות על הלוח לוחית (ראה איור 3 ). הנפח הסופי של נוגדנים בדיקה בריכוז העבודה יהיה 50 μL לכל טוב, כך הנפח של כל נוגדן 2x מוכן צריך להיות (25 μL) * (מספר דגימות ביולוגיות) * (2 משכפל טכני) * (1.1 עבור שגיאת ליטוף).
    5. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי לפזר 25 μL של כל נוגדן בדיקה לתוך לוחית מגנטית המכילה את הצלחת.
    6. לנער על שייקר צלחת אופקית כדי לערבב ולהשעות את החרוזים מגנטי, ולאחר מכן הדגירה ב 4 ° צ' עבור 1 h, רועד ב 450 סל ד בחושך.
    7. לשטוף את 3x עם מאגר FlyP על מנקה לוחית מגנטית ב 4 ° c.
    8. השהה מחדש את החרוזים המגנטיים ב-50 μL של 1:200 Streptavidin-PE.
    9. לנער כדי לערבב ולהשעות חרוזים מחדש, ולאחר מכן דגירה ב 4 ° צ' עבור 30 דקות, רועד ב 450 סל ד בחושך.
    10. לשטוף את 3x עם מאגר FlyP על מנקה לוחית מגנטית ב 4 ° c.
    11. השהה מחדש ב-125 μL של מאגר FlyP.
    12. טלטל עבור 1 דקות ב 900 סל ד כדי להשהות מחדש ביסודיות חרוזים.
    13. לרוץ על הזרם בקירור cytometer (ראה דיאגרמה באיור S1). השתמש "high RP1 target" ההגדרה בתוכנה cytometer ותנאי עצירה של 1,000 חרוזים לאזור (מאוד חטיאים ירי את המספר שצריך להיות כל הטוב בודדים כדי למנוע את המחשב להפסיק בטרם עת) ו לדוגמה נפח של 80 μl.
    14. להשהות את הריצה במחצית הדרך ולהשעות מחדש את החרוזים כדי למנוע התיישבו.
    15. יצא קבצי נתונים בתבנית. xml.
    16. חזור על התהליך עבור הצלחות הנותרות, החל משלב 3.3.1.

4. ניתוח נתונים

הערה: קוד אנק נועד להשוות בין שני תנאים מ N = 4 ניסויים, כל אחד עם 2 משכפל טכני עבור כל תנאי. לדוגמה, התאים ממריצים ארבע פעמים עצמאיות, QMI מופעל בארבעה ימים שונים על השליטה (לא מגורה) ותאים ממריצים, עם משכפל טכני כמתואר לעיל, וניתוח נתונים מתקדם כמפורט להלן.

  1. מסתגלת לא פרמטרית עם חיתוך אלפא מתכוונן (אנק)
    1. פתח את MATLAB והגדר את הספריה הפעילה לתיקיה המכילה את רכיבי התוכנית של אנק ואת קבצי ה-. xml המיוצאים מהציטומטר הזורם.
    2. מלאו את הקובץ "אנק קלט" כדי לשקף את פרטי העיצוב הניסיוני. הקובץ לדוגמה שנכלל בקובץ המשלים התמלא מראש כדי להפעיל את הנתונים לדוגמה, שסופקו גם כן.
    3. הפעל את התוכנית, שתכתוב קובץ. csv בספריה הפעילה. הקובץ מדווח על הדגים שונים באופן משמעותי, ברמה חיובית (אלפא) שקרית של 0.05, בין התנאים הניסיוניים והניסיוני, בכל 4 המשכפלת הניסויית, או לפחות 3/4 משכפל.
    4. הערה "כניסות", אשר מוגדרות כדגים עם הבדלים משמעותיים לפחות 3 משכפל ניסיוני, מיוצג 3/4 ∩ 4/4 בקובץ, לשימוש בשלב 4.3.1.
  2. ניתוח רשת מיתאם משוקלל23 (cna)
    1. הדבק-בצע חילוף של כותרות העמודות של פלט קובץ הנתונים על-ידי Matlab מסתיימת ב-"_ MFI. CSV "לשורה הראשונה של גיליון חדש של excel. הוסף את העמודות "ניסוי" עבור מספר הניסוי, "טיפול", לטיפול ניסיוני או כל משתנה אחר שיש לנתח. שמור קובץ זה כ-"תכונות. csv".
    2. פתח את סטודיו R והגדר את ספריית העבודה לתיקיה המכילה את המילה "_ MFI". CSV "ו" תכונות. CSV "קבצים.
    3. הפעל את פקודות R כפי שמצוין בקובץ הפקודה ' הערות ' ואת הפרטים המפורטים בהוראות הכלולות בקבצים. מודולי WCNA מתואמים באופן משמעותי עם כל תכונה ניסיונית הם פלט כקובץ גרפי, ואת הקורלציה של כל אינטראקציה IPאני_ בדיקהJ עם כל מודול הוא פלט כמו קובץ csv.
    4. הערה ' כניסות CNA ', המוגדרות כאינטראקציות עם חברות מודול (MM) > 0.7 ו-p < 0.05 עבור חברות במודול שזוהה בקורלציה משמעותית עם המשתנה ניסיוני של ריבית, לשימוש בשלב 4.3.1.
  3. הדמיה & חיובית של ' להיטים '
    1. עבור כל אינטראקציה ברשימה "3/4 ∩ 4/4 צפיות" בקובץ הפלט של אנק (משלב 4.1.4), לזהות אם האינטראקציה היא גם "CNA hit" על ידי בדיקת קובץ הפלט CNA (ראה שלב 4.2.6). צור עמודה חדשה המציינת אם כל להיט של האנק הוא גם להיט CNA.
    2. חשב את ערך השינוי הממוצעשל יומן הרישום עבור כל להיט ∩ cna על ידי ממוצע הערכים שניתנו בגיליון האלקטרוני של הפלט של אנק "_ כניסות. csv" משלב 4.1.3. המרת ערכים ליומן רישום של2 שינויים בקיפול לפני חישוב ממוצע. לאינטראקציות שהיו משמעותיות רק ב-3/4 משכפל, מחק את הערך החיצוני.
    3. לעשות גיליון אלקטרוני עם כל להיט ∩ CNA הרשומה כתובת IP בעמודה אחת, לווין בעמודה השנייה, ואת ערך שינוי הקיפול בעמודה השלישית. השתמש בגיליון אלקטרוני זה כדי ליצור דיאגרמה מקצה הצומת ב-ציטוסקייפ על-ידי ייבוא הקובץ כרשת.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הקרנת נוגדנים
איור 2 B מציג את תוצאות המסך עבור חלבון Connexin36. רוב השילובים IP_probe מייצרים לא אות מעל פקדי IgG. IP עם הנוגדן המונשבטיים 1E5 ולבדוק עם או 1E5 או נוגדנים פוליבטיים 6200 מייצרת משמרת ימניים בהתפלגות חרוז לעומת שולטת IgG. כאן, IP 1E5 ו לחקור 6200poly נבחרו כדי להימ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

השקאת QMI דורש השקעה ניכרת בפיתוח פאנל הנוגדן, ציוד ריאגנטים, אבל ברגע שהנתון נקבע, ניתן לאסוף נתונים בעלי ממדים גבוהים התבוננות ברשתות אינטראקציה חלבון כפי שהם מגיבים ניסויים בשליטת גירויים. מבחינה טכנית, QMI דורש ליטוף זהיר ומעקב של דגימת ומיקומים היטב נוגדן. תיוג בזהירות של לוחיות הנתונים...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

Acknowledgements

המחברים רוצים להכיר את טסה דיוויס לתרומות חשובות לפיתוח שיטת QMI, וחברים נוכחיים ולשעבר של מעבדות סמית ' ו-Schrum להדרכה טכנית ולקלט אינטלקטואלי. עבודה זו ממומנת על ידי NIMH מענקים R01 MH113545 ו R00 MH 102244.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well flat bottomed platesBio Rad171025001
96-well PCR platesVWR82006-704
Bioplex 200 System with HTFBio Rad171000205modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash StationBio Rad30034376
BSASigma
CML beadsInvitrogenC37481
EDTASigmaE6758
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo ScientificA39256
MagPlex MicrospheresLuminexMC12xxx-01xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification KitThermo Scientific45206used for antibody purification
MESSigmaM3671
Microplate film, non-sterileUSA Scientific2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2SigmaP5726
Protease inhibitor cocktailSigmaP8340
Sandwich Prep RefrigeratorNorlakeSMP 36 15for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluorideSigma201154
Sodium orthovanadateSigma450243
Streptavidin-PEBioLegend405204
Sulfo NHSThermo ScientificA39269
TrisFisher ScientificBP152

References

  1. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  2. Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
  3. Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
  4. Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
  5. Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
  6. Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
  7. Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
  8. Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
  9. Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23(2005).
  10. Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
  11. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807(2010).
  12. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
  13. Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
  14. Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7(2016).
  15. Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science's STKE. 2007 (389), (2007).
  16. Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48(2018).
  17. Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
  18. Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
  19. Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
  20. Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
  21. Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722(2012).
  22. Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
  23. Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559(2008).
  24. Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

150IP FCMimmunoprecipitationQMI

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved