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Resumo

A imunoprecipitação quantitativa Multiplex (QMI) utiliza citometria de fluxo para detecção sensível de diferenças na abundância de interações proteína-proteína direcionadas entre duas amostras. O QMI pode ser realizado usando uma pequena quantidade de biomaterial, não requer Tags geneticamente projetadas e pode ser adaptado para qualquer rede de interação protéica previamente definida.

Resumo

Interações proteína-proteína dinâmicas controlam o comportamento celular, da motilidade à replicação do DNA para a transdução do sinal. No entanto, o monitoramento de interações dinâmicas entre múltiplas proteínas em uma rede de interação protéica é tecnicamente difícil. Aqui, apresentamos um protocolo para imunoprecipitação multiplex quantitativa (QMI), que permite a avaliação quantitativa de alterações de dobra em interações protéicas com base em medições de fluorescência relativa de proteínas em complexos compartilhados detectados por expostos Epítopos de superfície (PiSCES). Em QMI, os complexos proteicos de lysates da pilha são Immunoprecipitated em microspheres, e então sondado com um anticorpo etiquetado para uma proteína diferente a fim quantificar a abundância de PiSCES. Os anticorpos da imunoprecipitação são conjugados às regiões espectrais diferentes de magbead, que permite que um citômetro do fluxo diferencie ligações paralelos múltiplos e quantifique simultaneamente a quantidade de anticorpo da ponta de prova associado com cada um. O QMI não necessita de marcação genética e pode ser realizado utilizando um biomaterial mínimo em comparação com outros métodos de imunoprecipitação. O QMI pode ser adaptado para qualquer grupo definido de proteínas interagindo, e até agora tem sido usado para caracterizar redes de sinalização em células T e sinapses neuronais de glutamato. Os resultados conduziram à geração nova da hipótese com aplicações diagnósticas e terapêuticas potenciais. Este protocolo inclui instruções para executar o QMI, desde a seleção inicial do painel de anticorpos até a execução de ensaios e análise de dados. A montagem inicial de um ensaio QMI envolve a triagem de anticorpos para gerar um painel, e empiricamente determinando um tampão de Lise apropriado. A preparação subsequente do reagente inclui anticorpos covalentemente do immunoprecipitação do acoplamento aos magbeads, e anticorpos biotinylating da ponta de prova assim que podem ser etiquetados por um fluorophore streptavidin-conjugado. Para executar o ensaio, o lisado é misturado com magbeads durante a noite, e então os grânulos são divididos e incubados com anticorpos diferentes da ponta de prova, e então uma etiqueta do fluoróforo, e lidos pelo fluxo cytometry. Dois testes estatísticos são realizados para identificar peixes que diferem significativamente entre as condições experimentais, e os resultados são visualizados usando Heatmaps ou diagramas de borda de nó.

Introdução

As interações proteína-proteína dinâmicas constituem as cascatas de sinalização molecular e as estruturas motile que são a base funcional da maioria de fisiologia celular1. Esses processos são frequentemente representados como vias de sinalização lineares que alternam entre Estados estáveis com base em entradas simples, mas os dados experimentais e de modelagem mostram claramente que funcionam como redes integradas2,3, 4. no caso das proteínas g, diferentes receptores geralmente têm a capacidade de ativar a mesma proteína g, e um único receptor também pode ativar mais de um tipo de proteína g5,6. Para que o número relativamente pequeno de classes de proteína G Module especificamente uma vasta gama de funções celulares, como transmissão sináptica, regulação hormonal e migração celular, as células devem integrar e diferenciar esses sinais4 , 5. evidências mostraram que esta especificidade do sinal, para as proteínas G, bem como outras, é derivada principalmente com base em interações proteína-proteína finamente ajustadas e sua dinâmica temporal1,3, 4. º , 5. º , 6 anos de , 7. porque as redes de sinalização são compostas de complexos proteicos dinâmicos com múltiplas entradas, saídas e loops de feedback, uma única perturbação tem a oportunidade de alterar o equilíbrio homeostático geral da fisiologia de uma célula4 ,7. É agora amplamente acordado que a sinalização deve ser examinada a partir de uma perspectiva de rede, a fim de entender melhor como a integração de múltiplas entradas controla funções celulares discretas na saúde e na doença7,8, 9,10,11,12,13. À luz disto, a imunoprecipitação multiplex quantitativa (QMI) foi desenvolvida para reunir dados quantitativos de média taxa de transferência de mudanças em redes dinâmicas de interação protéica.

QMI é um ensaio anticorpo-baseado em que o lisado da pilha é incubado com um painel de anticorpos da imunoprecipitação que são acoplados covalentemente aos grânulos magnéticos que contêm relações distintas de tinturas fluorescentes. Ter anticorpos específicos acoplados às classes magnéticas distintas do grânulo permite a coimunoprecipitação simultânea de proteínas alvo múltiplas do mesmo lysate. Depois da imunoprecipitação (IP), os grânulos magnéticos são incubados com um segundo, anticorpo da ponta de prova conjugado fluorophore (ou anticorpo biotinylated conjuntamente com o streptavidin conjugado fluorophore). As coassociações entre as proteínas reconhecidas por cada par de anticorpos de anticorpo-sonda IP, ou peixes (proteínas em complexos compartilhados detectados por epítopos de superfície expostos), são então detectadas por citometria de fluxo e podem ser comparadas quantitativamente entre diferentes condições da amostra14. As ilustrações na Figura 1 mostram as etapas envolvidas na execução de um ensaio QMI, incluindo um diagrama de grânulos magnéticos com complexos proteicos imunoprecipitados marcados por anticorpos fluorescentamente conjugados da sonda (Figura 1C).

A sensibilidade do QMI depende da concentração proteica do lisado em relação ao número de grânulos magnéticos utilizados para a imunoprecipitação, e alcançar uma resolução para detectar 10% de alterações de dobra requer apenas uma pequena quantidade de material de partida em comparação com outros métodos de co-IP14,15. Por exemplo, a quantidade de material de partida usada em QMI é similar àquela exigida para um ensaio enzima-lig ImmunoSorbent do sanduíche (ELISA), mas as interações múltiplas são detectadas em um único ensaio de QMI. Os ensaios de QMI que usam 20 IPs e 20 alvos da ponta de prova foram executados usando 1-5 x 105 pilhas de T preliminares isoladas de uma biópsia da pele de 4 milímetros, de preparações synaptosomal P2 de uma seção coronal de 3 milímetros do córtice pré-frontal do rato, ou 3 x 106 cultivaram o rato preliminar neurônios corticais14,16,17. Esta sensibilidade faz QMI útil para a análise das pilhas ou do tecido com disponibilidade limitada, tal como amostras clínicas.

QMI pode ser adaptado para toda a rede previamente definida da interação da proteína (contanto que os anticorpos estão disponíveis), e até agora foi desenvolvido para analisar o signalosome do receptor do antígeno da pilha de T (TCR) e um subconjunto das proteínas em sinapses glutamatérgico nos neurônios 17 anos de , 18. em estudos de sinalização de receptores de células T, o QMI foi usado pela primeira vez para identificar alterações induzidas por estimulação em peixes e, em seguida, para distinguir pacientes autoimunes de um grupo controle, detectar sinalização autoimune endógena e, finalmente, gerar uma hipótese envolvendo uma subrede associada à doença desequilibrada das interações14. Mais recentemente, o mesmo painel de QMI foi usado para determinar que a seleção do anti-thymocyte está determinada por diferenças quantitativas um pouco do que qualitativas na sinalização TCR-associada19da proteína. Nos neurônios, o QMI foi usado para descrever o rearranjo de entrada específica de uma rede de interação protéica para tipos distintos de sinais de entrada de uma forma que suporta modelos recém-emergentes de plasticidade sináptica17. Adicionalmente, este painel de QMI sináptica foi usado para identificar diferenças em sete modelos do rato do autismo, aglomerar os modelos em subgrupos baseados em suas bioassinaturas de PiSCES, e supor exatamente um deficit molecular compartilhado que fosse previamente não reconhecido em um dos modelos16. Uma abordagem semelhante pode ser usada para a tela de outros subgrupos que possam responder a diferentes tratamentos medicamentoso, ou atribuir medicamentos a subgrupos responsivos específicos. O QMI tem potenciais aplicações em diagnósticos, subtipagem de pacientes e desenvolvimento de fármacos, além da ciência básica.

Para montar um painel de anticorpos QMI, os protocolos iniciais de triagem e seleção de anticorpos estão descritos na seção 1, abaixo. Uma vez identificados os painéis de anticorpos, os protocolos de conjugação dos anticorpos selecionados para os grânulos magnéticos para IP e para a biotinilação dos anticorpos de sonda selecionados estão descritos na seção 2. O protocolo para a execução do ensaio QMI em lisados celulares ou teciduais é descrito na seção 3. Finalmente, uma vez que um único experimento pode gerar ~ 5 x 105 DataPoints individuais, instruções e códigos de computador para auxiliar no processamento de dados, análise e visualização são fornecidos na seção 4. Uma visão geral do fluxo de trabalho descrito nas seções 2-4 é mostrada na Figura 1.

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Protocolo

1. projeto do ensaio

  1. Preparação do anticorpo do candidato
    1. Para cada proteína de interesse, escolha 3 a 5 anticorpos para a tela. Quando possível, use anticorpos monoclonais que reconhecem epítopos diferentes. Inclua também um anticorpo de controle não específico.
    2. Para remover Tris, realize a troca do amortecedor adicionando o anticorpo a um filtro da rotação de 30 kDa, girando para baixo a seu volume mínimo, adicionando 500 μL de soro-tampão fosfato (PBS), e repetindo 3 vezes. Para remover proteínas do portador, realize a purificação do anticorpo de acordo com o protocolo do fabricante (veja a tabela de materiais para a recomendação específica da purificação).
      Nota: isto é feito porque as proteínas do portador e os bufferes com grupos livres da amina (tais como Tris) reagirão com grupos de COOH e saciar as reações subseqüentes do acoplamento e do biotinilação do grânulo. Assegure-se de que todos os anticorpos sejam purificados (sem proteínas transportadoras) e em um tampão livre de aminas primárias (ou seja, sem Tris).
    3. Acople cada anticorpo aos grânulos modificados carboxilato do látex (CML) como descrito por Davis e por Schrum20. Para conservar o anticorpo, escale para baixo as reações do acoplamento do grânulo por até 1/5 (isto é, 3,6 x 106 grânulos com 10 μl do anticorpo 0.2-1 mg/ml).
    4. Estimar números de talão usando um hemocitômetro (tipicamente ~ 108/ml) e armazenar a 4 ° c. Os grânulos foram armazenados por mais de um ano e usados com sucesso em ensaios de QMI, mas a vida de prateleira ou datas de expiração não foram formalmente estabelecidas. NaN3 no buffer B/S impede o crescimento bacteriano.
    5. Biotinilato uma porção de cada anticorpo (ver secção 2,2 abaixo). Conservar a 4 ° c.
    6. Confirme o acoplamento eficaz do grânulo de CML e a contagem exata manchando 1 x 105 grânulos com um anticorpo PE-conjugado reactivo às espécies em que o anticorpo foi levantado e lendo em um cytometer do fluxo.
    7. Confirme a biotinilação do anticorpo pelo Borrão do ponto usando streptavidin-HRP.
    8. Uma vez que o laboratório gerou reagentes que são conhecidos por ser eficaz, use esses reagentes como controles positivos em reações de confirmação nas etapas 1.1.5 e 1.1.6.
  2. Triagem de anticorpos por IP-FCM (imunoprecipitação detectada por citometria de fluxo)
    1. Decida em um lisado apropriado da seleção. Para isso e todas as outras etapas de triagem pré-QMI (qualquer coisa incluída nesta seção 1: projeto de ensaio), não use biosamples com disponibilidade limitada. Em vez disso, escolha um material de controle comparável, como o tecido do mouse tipo selvagem, as linhas celulares ou o tecido de doador humano normal que não é um recurso limitante.
      Nota: a escolha de um tampão de Lise para este ensaio não é trivial, e é discutida na seção 1,5: seleção de detergente, bem como no penúltimo parágrafo da seção discussão. Os tampões padrão do lysis têm uma base de 150 milímetros de NaCl, de 50 milímetros tris (pH 7,4), de 10 milímetros de fluoreto do sódio, de 2 milímetros de orthovanadate do sódio, e de cocktail do inibidor da protease e da fosfatase. Os detergentes compatíveis com QMI incluem 1% NP-40, 1% digitonin, 0.1-1% Triton X-100, e 0.5-1% desoxicolato14,16,17,18,19,21.
    2. Calcule o volume total de lisado a ser usado para cada IP, usando 10 μL para cada combinação de sonda IP a ser rastreada. Se a triagem de anticorpos X sonda e usando um controle de IgG, cada IP usará (X + 1) * (10 μL) * (1,1 para o erro de pipetagem); X + 1 é a consideração para o controle exigido da ponta de prova de IgG. Por exemplo, em uma tela de anticorpo 3x3, cada IP deve usar 44 UL. Lembre-se de incluir um controle IP de IgG (Veja exemplo de configuração de triagem na Figura 2).
    3. Calcule o número de cordão CML a ser usado. Se você estiver selecionando anticorpos de sonda X, use [(X + 1) * 5 x 104 Beads]. Idealmente, 5.000 grânulos por poço resultará em > 2000 grânulos por bem sendo lido pelo cytometer do fluxo. Por exemplo, em uma tela do anticorpo 3 x 3, cada IP deve usar 20.000 grânulos, que é aproximadamente 0,66 μl do estoque preparado do grânulo de CML da etapa 1.1.3 (os grânulos devem primeiramente ser quantificados usando um hemocitômetro para assegurar a exatidão).
    4. Incubar o volume de lisado da etapa 1.2.2 com o volume de cada grânulo de CML a ser selecionado da etapa 1.2.3, durante a noite em 4 ° c com rotação para impedir que os grânulos se fixem. Tipicamente, realize incubações na primeira coluna de uma placa do PCR 96-well, e tampão com tampões de tira do tubo do PCR.
    5. Gire para baixo grânulos de CML em 3.200 x g por 1 minuto e remova o lisado por um único, flicking rápido da placa sobre o dissipador. Uma pelota branca minúscula deve ser visível na parte inferior de cada poço antes e depois de flicking.
    6. Ressuspender os grânulos de CML em um volume de buffer FlyP para igual a 20 μL para cada par de sonda de talão; para anticorpos X Probe, use (X + 1) * (20 μL) * (1,1 para erro de pipetagem), semelhante ao passo 1.2.2. Para uma tela de 3 x 3, Ressuspender em 88 μL de buffer FlyP. FlyP buffer é 100 mM NaCl, 50 mM TRIS pH 7,4, 1% BSA, 0, 1% NaN3.
    7. Distribua cada IP através de (X + 1) poços de uma placa do PCR 96-well, onde X seja o número de anticorpos da ponta de prova que estão sendo selecionados, usando 20 μL/poço. Figura 2 A mostra um exemplo de configuração de triagem.
    8. Lave 2 vezes adicionais usando 200 μL de tampão FlyP por poço. Gire a placa como no passo 1.2.5 e mexa a placa para remover o tampão de lavagem após cada lavagem. As pelotas serão extremamente pequenas, mas devem ser visíveis após cada lavagem.
    9. Para cada anticorpo biotinylated a ser selecionado, calcule o volume total como (Y + 1) * 1,1 * 50 μL, onde Y é o número de anticorpos do IP que estão sendo selecionados. Diluir o anticorpo a uma concentração de trabalho neste volume de amortecedor de FlyP, começando tipicamente com 1:100 diluição de um estoque de 0,5 mg/mL.
    10. Distribua cada anticorpo diluído para baixo cada coluna da placa do poço 96, e assegure-se de que os grânulos de CML estejam ressuscipended.
    11. Incubar a 4 ° c durante 1 h, com rotação ou pipetagem a intervalos de 15 min para garantir que as esferas de CML permaneçam em suspensão.
    12. Lave 3x em 200 μL de tampão FlyP, para cada centrifugador de lavagem e remova o lisado como no passo 1.2.5.
    13. Ressuscita todos os grânulos de CML em 50 μL de 1:200 streptavidin-PE no tampão de FlyP.
    14. Incubar a 4 ° c no escuro durante 30 min.
    15. Lave 3x em 200 μL de tampão FlyP, para cada centrifugador de lavagem e remova o lisado como no passo 1.2.5.
    16. Ressuspender em 200 μL de tampão FlyP e, em seguida, executar em um citometro de fluxo.
  3. Escolhendo anticorpos para incluir no ensaio
    1. Portão em tamanho usando FSC-H vs SSC-H, e eliminar doublets usando FSC-H vs FSC-A.
    2. Gerar histogramas de intensidade de fluorescência de PE e sobrepor ambos os controles de IgG (sonda de teste do grânulo de IgG, teste de sonda de bead-IgG) para pares testados (Figura 2).
    3. Procure um par de sonda de talão que dê sinal claro sobre o ruído (Figura 2B). Adicionalmente, não é ideal usar o mesmo anticorpo para o grânulo e a ponta de prova. O reconhecimento diferencial do epítopo maximiza as chances de observar interações, pois alguns resumos podem ser oclusados em determinados complexos proteicos. Se não existirem opções aceitáveis, repita a tela com anticorpos adicionais.
  4. Confirmação da especificidade do anticorpo
    1. Para garantir a especificidade dos anticorpos para os alvos pretendidos, utilize uma amostra de lisado em que o alvo tenha sido eliminado; por exemplo, um mouse Knockout ou uma linha de célula RNAi. Alternativamente, use lisado de uma linha celular alvo-negativa na qual a proteína alvo foi expressa artificialmente.
    2. Execute IP-FCM conforme descrito na etapa 1,2, modificando para ajustar o experimento.
  5. Seleção de detergente
    1. Como os detergentes são críticos em experimentos de co-IP, teste empiricamente diferentes variações para garantir que o ensaio tem a máxima probabilidade de detectar alterações. Para começar, escolha um painel relativamente pequeno de interações (4-8) que são conhecidos por mudar em uma determinada condição e/ou são de particular interesse para o seu estudo.
    2. Usando os grânulos de CML não-fluorescentes, anticorpo-conjugados feitos para telas iniciais, executam o IP-FCM como descrito em 1,2 usando condições variadas do detergente do amortecedor do lysis. As telas detergentes podem ser executadas com detergente como a única variável, ou com as condições diferentes da pilha para cada detergente. Use sempre controles de IgG para grânulos e pontas de prova, desde que os detergentes produzem ocasionalmente o fundo inesperado em algumas combinações do IP-Probe.
    3. Com base nas IFM da tela, escolha um detergente que otimiza o sinal para os peixes de interesse. É provável que alguns compromissos terão de ser feitos22.

2. preparação do reagente multiplex

  1. Acoplamento magnético do grânulo
    1. Usando o mapa da região do cordão magnético, selecione as regiões do cordão para usar em um padrão que minimize o risco de detecção cruzada. O grânulo magnético mancha tipicamente acima e à direita, assim que evite as regiões do grânulo que são diagonalmente adjacentes. Os grânulos de todas as outras colunas do diagrama do talão mostrados no site da Luminex são recomendados (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/).
    2. Prepare o anticorpo portador-livre em 0,1 mg/mL em PBS (como em 1.1.2) em 250 μL. Mantenha no gelo para o uso mais atrasado.
    3. Grânulos magnéticos do Vortex extensivamente, e então alíquota 250 μL em um tubo ambarino do microcentrifugador (para proteger grânulos do photobranqueamento).
    4. Magneticamente separar contas magnéticas para 60 s e remover o sobrenadante.
    5. Adicionar 250 μL de tampão MES (50 mM MES pH 6,0, 1 mM EDTA), vortex, magneticamente separado para 60 s, e remover o sobrenadante. Repita e ressuspender grânulos magnéticos em 200 μL de tampão de MES.
    6. Adicionar 40 μL de MES a 2 mg de tubo de uso único de sulfo-NHS para fazer um estoque de 50 mg/mL.
    7. Adicione 25 μL de sulfo-NHS recém-feito aos grânulos magnéticos. Vórtice.
    8. Adicionar 25 μL de 50 mg/mL de EDAC recentemente dissolvido [1-etil-3-( -3-dimethylaminopropyl) cloridrato de carbodiimida, também chamado de EDC] no tampão MES. Vórtice.
    9. Cubra e agite em um vortexer com um acessório do tubo-terra arrendada por 20 minutos na Temp do quarto, 1000 rpm.
    10. Magneticamente separado para 60 s e remover o sobrenadante.
    11. Resuspend em 500 μL de PBS, vortex, magneticamente separado para 60 s e retire o sobrenadante. Repetir.
    12. Ressuscitem em 250 μL de solução de anticorpos do passo 2.1.2. Vórtice.
    13. Incubar 2 h no temp do quarto com agitação em um vortexer em 1000 rpm.
    14. Adicione 500 μL de PBS aos grânulos magnéticos, vortex, magneticamente separados por 60 s, e retire o sobrenadante.
    15. Adicionar 750 μL de tampão de bloqueio/armazenamento (B/S) (1% BSA em PBS pH 7,4, 0, 1% NaN3). Cubra e incubar 30 min na temperatura ambiente, 1000 rpm.
    16. Magneticamente separado para 60 s e remover o sobrenadante. Resuspend em 100 μL de tampão B/S.
    17. Conservar a 4 ° c. Os grânulos foram armazenados por mais de um ano e usados com sucesso em ensaios de QMI, mas a vida de prateleira ou datas de expiração não foram formalmente estabelecidas. NaN3 no tampão B/S deve impedir o crescimento bacteriano.
    18. Valide o acoplamento magnético do grânulo manchando ~ 0,25 μL de grânulos magnéticos acoplados com uma espécie antihospedeiro fluorescente secundária e lendo em um cytometer do fluxo, como na etapa 1.1.5.
  2. Biotinilação
    1. Assegure-se de que os anticorpos estejam em PBS sem proteína transportadora.
    2. Calcule o μg total do anticorpo a ser biotinylated (100-200 μg recomendado para o uso no multiplex, 25-50 μg recomendado para a seleção).
    3. Prepare fresco 10 mM sulfo-NHS-biotina (pode ser feito adicionando 224 μL de ddH2o a um tubo de 1 mg sem pesar).
    4. Adicionar 1 μL de sulfo-NHS-biotina de 10 mM por 25 μg de anticorpo, vortex ou pipeta para cima e para baixo para misturar.
    5. Incubar na temperatura ambiente por 1 h.
    6. Incubar a 4 ° c durante 1 h.
    7. Use um filtro de rotação de 30 kDa para remover a biotina não acoplada e parar a reação. Adicione 500 μL de PBS e gire a coluna até que o volume mínimo seja atingido. Adicionar 500 μL de PBS adicional e repetir para 3 trocas de memória intermédia total.
    8. Calcule a concentração medindo a absorvência de 1-2 μL em um espectrofotômetro, e traga Então a concentração do anticorpo a 0,5 mg/mL.
    9. Conservar a 4 ° c.

3. imunoprecipitação multiplex quantitativa

  1. Layout da placa
    Nota: Este ensaio funciona melhor quando realizado utilizando placas 96-well e 2-4 condições da amostra.
    1. Sempre executar controles apropriados (ou seja, estimulado v. células não estimuladas) na mesma placa, a fim de detectar mudanças entre as condições. Distribua cada amostra horizontalmente em toda a placa e use cada coluna para um anticorpo de sonda diferente. Um conjunto de réplicas técnicas para cada sonda deve ser executado imediatamente após o primeiro conjunto. Consulte a Figura 3 para obter um exemplo.
    2. Documente com cuidado a disposição da placa para facilitar a carga e a análise exatas da placa.
  2. Preparação da amostra & imunoprecipitação (dia 1)
    1. Tecido de lyse ou células em detergente apropriado com inibidores da protease e fosfatase e incubar no gelo por 15 min. Tome cuidado para manter o lisado frio em todos os momentos.
      Nota: a quantidade exata de indicar a concentração da proteína do biomaterial e do lisado deve empiricamente ser determinada, e alguns exemplos de amostras previamente usadas são alistados no terceiro parágrafo da introdução. Em geral, na faixa de 200 μL de proteína de 2 mg/mL por amostra tem sido bem-sucedida no passado para 20 IP e 20 alvos de sonda, mas as entradas ideais para cada painel de anticorpos e tipo de célula ou tecido devem ser determinadas empiricamente.
    2. Gire para baixo em 4 ° c por 15 minutos em 16.000 x g para remover as membranas e os restos; manter sobrenadante como lisado.
    3. Realize um ensaio de BCA ou similar para determinar concentrações da proteína, e então normalizar a concentração da proteína entre amostras. Se estiver usando células, comece com um número igual de células por condição e a normalização é opcional.
    4. Prepare uma mistura mestra do grânulo magnético que contenha ~ 250 grânulos magnéticos de cada classe por o poço no ensaio. Ajuste os números do talão após a análise dos dados de modo que em ensaios futuros uma média de 110 contas de cada classe seja lida por bem.
      Nota: exemplo de cálculo: (novo volume do cordão) = [(média de execução)/110] * (volume anterior do talão). Os volumes do grânulo devem ser ajustados desta maneira sobre cada 8 funcionamentos ou como necessário. Tipicamente, 3-4 μL de cada grânulo magnético (preparado como acima) são usados para um experimento de 2 placas.
    5. Lave a mistura magnética do grânulo 2x no amortecedor de FlyP com separação magnética, e reressuscitem então no amortecedor do FlyP. Para a ressuscitpensão, use 10 μL por a amostra por a placa. FlyP buffer é 100 mM NaCl, 50 mM TRIS pH 7,4, 1% BSA, 0, 1% NaN3.
    6. Após completamente vortexing a mistura magnética do grânulo, alíquota 10 μL em tubos frios do microcentrifugador do gelo (um tubo por a amostra). Adicione volumes iguais de lisado (com concentrações normalizadas) a cada tubo para a imunoprecipitação.
    7. Aliquot a mistura do grânulo do lysate-magnético em um tubo para cada placa que está sendo funcionado; por exemplo, para um experimento de 2 placas, divida o lisado em dois tubos. Coloc os tubos em um rotator em 4 ° c durante a noite para a imunoprecipitação, coberto para manter para fora a luz.
  3. Execução do ensaio (dia 2)
    1. Comece com os tubos do grânulo do lysate-magnético para o #1 da placa. Use uma cremalheira magnética do grânulo para remover o lisado dos grânulos magnéticos, e para reservar o lisado para a análise futura. Lave os grânulos 2x em 500 μL de tampão FlyP gelado. Mantenha os tubos de tubos sempre no gelo ou a 4 ° c.
    2. Calcule o volume de ressuspensão como (número de sondas) * (2 repetições técnicas) * (25 μL por poço) * (1,1 para erro de pipetagem). Ressuspender IPs em volume calculado de buffer FlyP gelado.
    3. Depois de Ressuspender completamente os grânulos magnéticos por pipetagem suave, distribuir 25 μL por poço através de uma placa de poço de fundo plano 96, no gelo.
    4. Em uma placa 96-well diferente, diluir anticorpos biotinylated da ponta de prova à concentração de funcionamento 2x (a concentração de funcionamento é tipicamente 1:100 ou 1:200, determinada empiricamente) no amortecedor de FLYP de modo que sua ordem Combine as colunas no layout da placa (veja Figura 3 ). O volume final de anticorpos da sonda na concentração de trabalho será de 50 μL por poço, de modo que o volume de cada anticorpo 2x preparado deve ser (25 μL) * (número de amostras biológicas) * (2 repetições técnicas) * (1,1 para o erro de pipetagem).
    5. Use uma pipeta multicanal para distribuir 25 μL de cada diluição de anticorpo de sonda na placa de ensaio contendo talão magnético.
    6. Agitar em um agitador de placa horizontal para misturar e ressuspender os grânulos magnéticos e, em seguida, incubar a 4 ° c por 1 h, agitando a 450 rpm no escuro.
    7. Lave 3x com amortecedor FlyP em uma arruela de placa magnética em 4 ° c.
    8. Ressuscita os grânulos magnéticos em 50 μL de 1:200 streptavidin-PE.
    9. Agitar para misturar e ressuspender os grânulos e, em seguida, incubar a 4 ° c durante 30 min, agitando a 450 rpm no escuro.
    10. Lave 3x com amortecedor FlyP em uma arruela de placa magnética em 4 ° c.
    11. Resuspend em 125 μL de tampão FlyP.
    12. Agitar por 1 min a 900 rpm para Ressuspender completamente os grânulos.
    13. Executar no citometro de fluxo refrigerado (ver diagrama na Figura S1). Use a configuração "High RP1 Target" no software de citometro de fluxo e uma condição de parada de 1.000 contas por região (sobrepondo grandemente o número que deve estar em qualquer poço individual para impedir que a máquina pare prematuramente) e volume amostral de 80 μL.
    14. Pause a corrida meio caminho e ressuscitando as contas para evitar a liquidação.
    15. Exporte arquivos de dados no formato. xml.
    16. Repita o processo para as placas restantes, começando na etapa 3.3.1.

4. análise de dados

Nota: o código ANC foi projetado para comparar duas condições de N = 4 experimentos, cada um com 2 repetições técnicas para cada condição. Por exemplo, as células são estimuladas quatro vezes independentes, o QMI é executado em quatro dias diferentes no controle (não estimulado) e células estimuladas, com réplicas técnicas como acima, e a análise de dados prossegue conforme descrito abaixo.

  1. Não-paramétrico adaptável com corte alfa ajustável (ANC)
    1. Abra o MATLAB e defina o diretório ativo para uma pasta que contenha os componentes do programa ANC e os arquivos. xml exportados do citometro de fluxo.
    2. Preencha o arquivo "ANC Input" para refletir os detalhes do experimento. O arquivo de exemplo incluído no arquivo suplementar foi pré-preenchido para executar os dados de exemplo, também fornecidos.
    3. Execute o programa, que irá escrever um ficheiro. csv para o Active Directory. O arquivo relata peixes que são significativamente diferentes, em um nível falso positivo (alfa) de 0, 5, entre as condições de controle e experimentais, em todas as 4 repetições experimentais, ou pelo menos 3/4 repetições.
    4. Nota ' ANC hits ', que são definidos como peixes com diferenças significativas em pelo menos 3 repetições experimentais, representado como 3/4 ∩ 4/4 no arquivo, para uso na etapa 4.3.1.
  2. Análise da rede de correlação ponderada23 (CNA)
    1. Colar-transpor os títulos de coluna da saída do arquivo de dados pelo MATLAB terminando em "_ MFI. CSV "na primeira linha de uma nova folha de Excel. Adicionar as colunas "experimento" para o número do experimento, e "tratamento", para o tratamento experimental, ou quaisquer outras variáveis a serem analisadas. Guarde este ficheiro como "traits. csv".
    2. Abra o R Studio e defina o diretório de trabalho para uma pasta que contenha o "_ MFI. CSV "e" traços. CSV "arquivos.
    3. Execute os comandos R conforme indicado no arquivo de comando comentado e o detalhado nas instruções incluídas com os arquivos. Os módulos WCNA significativamente correlacionados com cada traço experimental são a saída como um arquivo gráfico, ea correlação de cada interação IPi_ ProbeJ com cada módulo é a saída como um arquivo. csv.
    4. Nota ' hits CNA ', que são definidos como interações com a associação do módulo (MM) > 0,7 e p < 0, 5 para a associação em um módulo que foi identificado como significativamente correlacionado com a variável experimental de interesse, para uso na etapa 4.3.1.
  3. Positivo ' hits ' & visualização
    1. Para cada interação na lista "3/4 ∩ 4/4 hits" no arquivo de saída ANC (da etapa 4.1.4), identifique se essa interação também é um "hit CNA" verificando o arquivo de saída CNA (consulte a etapa 4.2.6). Crie uma nova coluna que indique se cada hit do ANC também é um hit do CNA.
    2. Calcule o valor médio da mudança do log2 da dobra para cada batida do CNA do ANC ∩ pela média dos valores dados na folha de cálculo da saída ANC "_ hits. csv" da etapa 4.1.3. Converta valores para registrar2 vezes a alteração antes da média. Para interações que foram significativas em apenas 3/4 repetições, exclua o valor de outlier.
    3. Faça uma planilha com cada hit ANC ∩ CNA listado como um IP em uma coluna, uma sonda na segunda coluna e o valor de alteração de dobra na terceira coluna. Use esta planilha para criar um diagrama de aresta de nó no Cytoscape importando o arquivo como uma rede.

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Resultados

Triagem de anticorpos
Figura 2 B mostra os resultados de uma tela para a proteína Connexin36. A maioria de combinações IP_probe não produzem nenhum sinal sobre controles de IgG. O IP com o anticorpo monoclonal 1E5 e a ponta de prova com o 1E5 ou o anticorpo Polyclonal 6200 produzem uma mudança rightward na distribuição do grânulo comparado aos controles de IgG. Aqui, IP 1E5 e sonda 6200poly foram selecionados para evitar o uso do mesmo anticorpo c...

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Discussão

O ensaio QMI requer investimento substancial no desenvolvimento do painel de anticorpos, equipamentos e reagentes, mas uma vez que o ensaio é estabelecido, pode-se coletar dados de alta dimensão observando as redes de interação protéica à medida que respondem a Estímulos. Tecnicamente, o QMI requer pipetagem cuidadosa e rastreamento de locais de amostra e de poços de anticorpos. Etiquetar com cuidado as placas do ensaio é útil, como está fazendo um molde detalhado de posições do poço no papel, que é conser...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

Os autores desejam reconhecer Tessa Davis para contribuições importantes para o desenvolvimento do ensaio QMI, e membros atuais e antigos dos laboratórios Smith e Schrum para orientação técnica e entrada intelectual. Este trabalho foi financiado por subsídios de NIMH R01 MH113545 e r00 MH 102244.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well flat bottomed platesBio Rad171025001
96-well PCR platesVWR82006-704
Bioplex 200 System with HTFBio Rad171000205modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash StationBio Rad30034376
BSASigma
CML beadsInvitrogenC37481
EDTASigmaE6758
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo ScientificA39256
MagPlex MicrospheresLuminexMC12xxx-01xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification KitThermo Scientific45206used for antibody purification
MESSigmaM3671
Microplate film, non-sterileUSA Scientific2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2SigmaP5726
Protease inhibitor cocktailSigmaP8340
Sandwich Prep RefrigeratorNorlakeSMP 36 15for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluorideSigma201154
Sodium orthovanadateSigma450243
Streptavidin-PEBioLegend405204
Sulfo NHSThermo ScientificA39269
TrisFisher ScientificBP152

Referências

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