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요약

정량적 멀티플렉스 면역침전(QMI)은 두 샘플 간의 표적 단백질-단백질 상호 작용의 풍부성에 대한 민감한 검출을 위해 유세포분석기를 사용합니다. QMI는 소량의 생체 물질을 사용하여 수행될 수 있고, 유전자 조작 태그를 필요로 하지 않으며, 이전에 정의된 단백질 상호작용 네트워크에 적응될 수 있다.

초록

동적 단백질-단백질 상호 작용 제어 세포 행동, 운동성에서 DNA 복제 신호 변환에. 그러나, 단백질 상호 작용 네트워크에서 여러 단백질 간의 동적 상호 작용을 모니터링하는 것은 기술적으로 어렵습니다. 여기에서, 우리는 노출에 의해 검출된 공유 복합체에 있는 단백질의 상대적인 형광 측정에 근거를 둔 단백질 상호 작용에 있는 배 변경의 정량적인 평가를 허용하는 정량적 멀티플렉스 면역 침전 (QMI)를 위한 프로토콜을 제시합니다 표면 에피토프 (PiSCES). QMI에서, 세포 용해물에서 단백질 복합체는 PiSCES의 풍부를 정량화하기 위하여 다른 단백질을 위한 표지된 항체로 그 때 마이크로스피어로 면역 침전되고, 그 때 조사됩니다. 면역 침전 항체는 다른 MagBead 스펙트럼 지구에 공액화되어 유동 세포계가 다중 병렬 면역 침전을 분화하고 동시에 각각과 관련된 프로브 항체의 양을 정량화할 수 있습니다. QMI는 유전 적 태깅을 필요로하지 않으며 다른 면역 침전 방법에 비해 최소한의 생체 재료를 사용하여 수행 할 수 있습니다. QMI는 상호 작용하는 단백질의 임의의 정의된 단에 적응될 수 있고, 지금까지 T 세포 및 신경 글루타메이트 시냅스에서 신호 네트워크를 특성화하는 데 사용되어 왔다. 결과는 잠재적인 진단 및 치료 응용을 가진 새로운 가설 생성으로 이끌어 냈습니다. 이 프로토콜에는 초기 항체 패널 선택부터 실행 분석 및 데이터 분석에 이르기까지 QMI를 수행하는 지침이 포함되어 있습니다. QMI 분석법의 초기 조립은 패널을 생성하는 스크리닝 항체를 포함하고, 경험적으로 적절한 라시스 완충액을 결정한다. 후속 시약 제제는 MagBeads에 면역 침전 항체를 공유결합하고, 생물항제 프로브 항체를 포함하므로 스트렙타비딘-컨쥬게이트 형광에 의해 표지될 수 있다. 분석기를 실행하기 위해, 매사염은 하룻밤 동안 MagBeads와 혼합된 다음, 구슬을 다른 프로브 항체로 분할 및 배양한 다음, 불소 라벨을, 및 유세포 분석으로 읽습니다. 두 가지 통계 테스트가 수행되어 실험 조건간에 크게 다른 PiSCES를 식별하며, 히트맵 또는 노드 에지 다이어그램을 사용하여 결과를 시각화합니다.

서문

동적 단백질-단백질 상호 작용은 대부분의 세포 생리학1의 기능적 기초인 분자신호 캐스케이드 및 운동성 구조를 구성한다. 이러한 프로세스는 종종 단일 입력을 기반으로 정상 상태 사이를 전환하는 선형 신호 경로로 묘사되지만 실험 및 모델링 데이터는 통합 네트워크 2,3 . 4.G 단백질의 경우, 다른 수용체는 종종 동일한 G 단백질을 활성화할 수 있으며, 단일 수용체는또한 G 단백질 5,6의한 가지 유형 이상을 활성화시킬 수 있다. 상대적으로 적은 수의 G 단백질 클래스가 시냅스 전송, 호르몬 조절 및 세포 이동과 같은 광범위한 세포 기능을 구체적으로 조절하기 위해서는 세포가 이러한 신호를 통합하고 분화해야 합니다4 , 5. 증거는 이 신호 특이성이 G 단백질뿐만 아니라 다른 사람에 대해, 주로 미세 조정 된 단백질 - 단백질 상호 작용 및 시간 역학 1,3에기초하여 파생된다는 것을 보여주었습니다. 4개 , 5개 , 6개 , 7. 시그널링 네트워크는 여러 입력, 출력 및 피드백 루프가있는 동적 단백질 복합체로 구성되기 때문에 단일 섭동은 세포의 생리학4의 전반적인 적시 성 균형을 변경할 수있는 기회를 가합니다. ,7. 이제 여러 입력의 통합이 건강과 질병7,8에서개별 세포 기능을 제어하는 방법을 더 잘 이해하기 위해 네트워크 관점에서 신호를 검사해야한다는 것이 널리 동의됩니다. 9,10,11,12,13. 이에 비추어, 정량적 멀티플렉스 면역침전(QMI)은 동적 단백질 상호작용 네트워크의 배 변화에 대한 중간 처리량, 정량적 데이터를 수집하기 위해 개발되었다.

QMI는 세포 용해가 형광 염료의 뚜렷한 비율을 포함하는 자기 구슬에 공유결합되는 면역 침전 항체의 패널로 배양되는 항체 기지를 둔 분석입니다. 뚜렷한 자기 비드 클래스에 결합된 특정 항체를 갖는 것은 동일한 용해물로부터 다중 표적 단백질의 동시 동시 동시 면역 침전을 허용한다. 면역 침전 (IP)에 이어, 자기 비드는 두 번째, 형광 공형 프로브 항체 (또는 플루오로포폴화 된 스트렙타비딘과 함께 생체 면역 항체)로 배양됩니다. 각 IP 항체 프로브 항체 쌍또는 PiSCES (노출된 표면 에피토프에 의해 검출된 공유 복합체의 단백질)에 의해 인식된 단백질 간의 공동 연결은 유세포 측정에 의해 검출되고 서로 다른 사이에서 정량적으로 비교될 수 있습니다. 샘플 조건14. 도 1의 그림은 형광공응접체 프로브 항체에 의해 표지된 면역침전성 단백질 복합체를 가진 자기 비드의 다이어그램을 포함하여 QMI 분석을 실행하는 데 관여하는 단계를 보여 준다(도1C).

QMI의 감도는 면역 침전에 사용되는 자기 비드의 수에 비해 용해물의 단백질 농도에 따라 달라지며, 10% 배 변화를 검출하는 분해능을 달성하는 것은 다른 것에 비해 소량의 시작 물질만필요로 한다. 공동 IP 방법14,15. 예를 들어, QMI에 사용되는 시작 물질의 양은 샌드위치 효소 연계 면역흡착 분석(ELISA)에 필요한 것과 유사하지만, 단일 QMI 분석에서 여러 상호작용이 검출된다. 20개의 IP 및 20개의 프로브 표적을 사용하여 QMI 표적은 4 mm 피부 생검으로부터 분리된 1-5 x 10 5차 T 세포를 사용하여 수행되었으며, P2 시냅소탈 제제는 마우스 전두엽 피질의 3 mm 관상 동맥 부편에서, 또는 3 x 106 배양 마우스 프라이머리를 사용하여 수행되었다. 피질 뉴런14,16,17. 이 감도는 임상 견본과 같은 제한된 가용성을 가진 세포 또는 조직의 분석을 위해 QMI를 유용하게 합니다.

QMI는 이전에 정의된 단백질 상호작용 네트워크(항체가 사용 가능)에 대해 적응할 수 있으며, 현재까지 뉴런의 글루타마테르지시냅스에서 T 세포 항원 수용체(TCR) 신호체 및 단백질의 서브세트를 분석하기 위해 개발되었습니다. 17세 , 18.T 세포 수용체 신호의 연구에서, QMI는 먼저 PiSCES에서 자극 유발 변화를 식별하기 위해 사용되었다, 다음 대조군에서 자가 면역 환자를 구별하기 위해, 내인성 자가 면역 신호를 감지하고, 마지막으로 생성하는 상호 작용의 불균형 질병 관련 하위 네트워크와 관련된 가설14. 보다 최근에는 동일한 QMI 패널이 TCR 관련 단백질 신호(19)의 질적 차이보다는 정량적차이에 의해 결정되는 흉선 선택이 결정되는 것을 결정하는데 사용되었다. 뉴런에서, QMI는 시냅스 가소성17의새롭게 떠오르는 모델을 지원하는 방식으로 뚜렷한 유형의 입력 신호에 대한 단백질 상호작용 네트워크의 입력 특이적 재배열을 설명하는 데 사용되었다. 또한, 이 시냅스 QMI 패널은 자폐증의 7개의 마우스 모델에서 차이를 식별하고, PiSCES 생체 서명을 기반으로 모델을 하위 그룹으로 클러스터화하고, 이전에는 인식되지 않았던 공유 분자 적자를 정확하게 가설하는 데 사용되었습니다. 모델 16중 하나에서 . 유사한 접근은 다른 약 처리에 반응할 수 있는 그밖 소집단을 위해 가리기 위하여 이용될 수 있었습니다, 또는 특정 반응하는 하위 단에 약을 할당하. QMI는 기초 과학 이외에 진단, 환자 서브 타이핑 및 약물 개발에 잠재적인 응용 프로그램을 가지고 있습니다.

QMI 항체 패널을 조립하기 위해, 초기 항체 스크리닝 및 선택 프로토콜은 아래 섹션 1에 기재되어 있다. 항체 패널이 확인되면, IP를 위한 자기 비드에 선택된 항체의 컨쥬게이션을 위한 프로토콜, 그리고 선택된 프로브 항체의 생체 측질화를 위한, 섹션 2에서 기술된다. 세포 또는 조직 용해에 대한 QMI 분석을 실행하기 위한 프로토콜은 섹션 3에 기재되어 있다. 마지막으로 단일 실험에서는 ~5 x105개의 개별 데이터 포인트를 생성할 수 있기 때문에 데이터 처리, 분석 및 시각화를 지원하는 지침과 컴퓨터 코드가 섹션 4에 제공됩니다. 2-4절에 설명된 워크플로의 개요는 그림1에 나와 있습니다.

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프로토콜

1. 분석 디자인

  1. 후보 항체 제제
    1. 관심 있는 각 단백질에 대해 3-5개의 항체를 선택하여 선별합니다. 가능하면 다른 에피토프를 인식하는 단일 클론 항체를 사용하십시오. 또한 하나의 비특이적 조절 항체를 포함한다.
    2. Tris를 제거하려면 항체를 30 kDa 스핀 필터에 추가하고 최소 부피로 회전하고 인산완충 식염수 (PBS)의 500 μL을 추가하고 3 번 반복하여 버퍼 교환을 수행하십시오. 담체 단백질을 제거하려면 제조업체의 프로토콜에 따라 항체 정제를 수행하십시오 (특정 정제 권장 사항에 대한 재료 표 참조).
      참고 : 이것은 무료 아민 그룹 (예 : Tris)이있는 담체 단백질 및 완충제가 COOH 그룹과 반응하고 후속 비드 커플링 및 생물 항성 반응을 담금질하기 때문에 수행됩니다. 모든 항체가 정제되어 있는지 확인 (캐리어 단백질 없음) 및 원발성 아민이없는 완충제 (즉, Tris 없음).
    3. 데이비스와 슈럼(20)에 의해 기재된 바와 같이 각 항체를카복실레이트 변형 라텍스(CML) 비드에 결합한다. 항체를 보존하기 위해 비드 커플링 반응을 최대 1/5까지 축소합니다(즉, 3.6 x 106 구슬, 0.2-1 mg/mL 항체의 10 μL).
    4. 혈세포계(일반적으로 ~10 8/mL)를사용하여 비드 숫자를 추정하고 4°C에 보관합니다. 구슬은 1 년 이상 저장되고 QMI 계산서에서 성공적으로 사용되었지만 유통 기한 또는 만료 날짜는 공식적으로 확립되지 않았습니다. B/S 완충제의 NaN3는 세균 성장을 방지합니다.
    5. 각 항체의 일부를 바이오티니레이트합니다(아래 섹션 2.2 참조). 4 °C에서 보관하십시오.
    6. 항체가 제기된 종에 반응성이 있는 PE-컨쥬게이트 항체로 1 x 105 구슬을 염색하여 효과적인 CML 비드 커플링 및 정확한 계수를 확인하고 유동 세포계에서 판독한다.
    7. 스트렙타비딘-HRP를 사용하여 도트 블롯에 의한 항체 생체 이식을 확인합니다.
    8. 실험실이 효과적인 것으로 알려진 시약을 생성한 후에는 1.1.5 및 1.1.6 단계의 확인 반응에서 이러한 시약을 긍정적 인 대조군으로 사용합니다.
  2. IP-FCM에 의한 항체 스크리닝(유세포측정에 의해 검출된 면역침전)
    1. 적절한 선별 을 결정하십시오. 이 단계와 다른 모든 사전 QMI 스크리닝 단계(이 섹션 1: 분석 설계에 포함된 모든 것)의 경우 가용성이 제한된 바이오 샘플을 사용하지 마십시오. 대신, 야생형 마우스 조직, 세포주, 또는 제한자원이 아닌 정상 인간 공여자 조직과 같은 비교 가능한 대조물질을 선택한다.
      참고: 이 분석에 대한 용해 버퍼를 선택하는 것은 사소한 것이 아니며 섹션 1.5: 세제 선택 및 토론 섹션의 끝에서 두 번째 단락에서 설명합니다. 표준 용해 완충제는 150 mM NaCl, 50 mM Tris (pH 7.4), 10 mM 불소 나트륨, 2 mM 나트륨 orthovanadate, 및 프로테아제 및 인산효소 억제제 칵테일의 염기체를 가지고 있다. QMI와 호환되는 세제는 1% NP-40, 1% 디지토닌, 0.1-1% 트리톤 X-100, 0.5-1% 디옥시콜레이트14,16,17,18,19,21을포함한다.
    2. 각 IP 프로브 조합에 대해 10 μL을 사용하여 각 IP에 사용할 용해물의 총 부피를 계산합니다. X 프로브 항체를 스크리닝하고 하나의 IgG 제어를 사용하는 경우, 각 IP는 (X+1) * (10 μL) * (파이펫팅 오류의 경우 1.1)를 사용합니다. X+1은 필요한 IgG 프로브 제어를 고려하는 것입니다. 예를 들어, 3x3 항체 화면에서, 각 IP는 44 ul을 사용해야 한다. IgG IP 컨트롤을 포함해야 합니다(그림 2의예제 스크리닝 설정 참조).
    3. 사용할 CML 비드 번호를 계산합니다. X 프로브 항체를 스크리닝하는 경우 [(X+1) * 5 x 104 구슬]을 사용하십시오. 이상적으로는 유동 세포계에 의해 웰당 5,000개의 구슬이 발생합니다. 예를 들어, 3 x 3 항체 화면에서 각 IP는 1.1.3 단계에서 준비된 CML 비드 스톡의 약 0.66 μL인 20,000개의 비드를 사용해야 합니다(비드는 먼저 정확도를 보장하기 위해 혈세포계를 사용하여 정량화되어야 합니다).
    4. 1.2.2 단계에서 용해물의 부피를 각 CML 비드의 부피로부터 스크리브화하여 1.2.3단계에서, 4°C에서 밤새 회전하여 비드가 침전되는 것을 방지한다. 전형적으로, 96웰 PCR 플레이트의 첫 번째 컬럼에서 인큐베이션을 수행하고, PCR 튜브 스트립 캡을 캡한다.
    5. CML 구슬을 3,200 x g에서 1분 동안 스핀다운하고 싱크대 위로 플레이트를 빠르게 쓸어넘기면 용해물을 제거합니다. 작은 흰색 펠릿은 각 우물의 바닥에 모두 깜박임 전후에 볼 수 있어야합니다.
    6. 각 비드 프로브 쌍에 대해 20 μL과 동일한 FlyP 버퍼의 부피에 CML 비드를 다시 일시 중단; X 프로브 항체의 경우 1.2.2단계와 유사하게 사용(X+1) * (20 μL) * (파이펫팅 오류의 경우 1.1). 3 x 3 화면의 경우 88 μL의 FlyP 버퍼에서 다시 일시 중단합니다. 플라이P 버퍼는 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.4, 1 %BSA, 0.01 % NaN 3입니다.
    7. 각 IP를 96웰 PCR 플레이트의 웰(X+1)에 분산하고, 여기서 X는 20 μL/well을 사용하여 스크리핑되는 프로브 항체의 수입니다. 그림 2 A는 예제 스크리닝 설정을 보여줍니다.
    8. 웰당 200 μL의 FlyP 버퍼를 사용하여 2회 더 씻으시고 세탁하십시오. 1.2.5 단계에서와 같이 플레이트를 회전시키고 각 세척 후 세척 버퍼를 제거하기 위해 플레이트를 쓸어 넘깁니다. 펠릿은 매우 작지만 씻을 때마다 볼 수 있어야합니다.
    9. 스크리핑될 각 생체측 항체에 대해 총 부피를 (Y+1) * 1.1 * 50 μL로 계산하고, 여기서 Y는 스크리핑되는 IP 항체의 수이다. 일반적으로 0.5 mg/mL 스톡의 1:100 희석으로 시작하는 플라이P 완충제의 이 부피에서 작동 농도로 항체를 희석한다.
    10. 희석된 각 항체를 96웰 플레이트의 각 컬럼아래로 분배하고, CML 비드가 다시 중단되도록 한다.
    11. CML 비드가 현탁액에 남아 있도록 15분 간격으로 회전 또는 파이펫팅을 통해 1시간 동안 4°C에서 배양합니다.
    12. 각 세척 원심분리기에 대해 FlyP 버퍼의 200 μL에서 3x를 세척하고 1.2.5 단계에서와 같이 용해를 제거하십시오.
    13. FlyP 버퍼에서 1:200 스트렙타비딘-PE의 50 μL에서 모든 CML 비드를 다시 일시 중단합니다.
    14. 30 분 동안 어둠 속에서 4 °C에서 배양.
    15. 각 세척 원심분리기에 대해 FlyP 버퍼의 200 μL에서 3x를 세척하고 1.2.5 단계에서와 같이 용해를 제거하십시오.
    16. FlyP 버퍼의 200 μL에서 다시 일시 중단한 다음 유동 세포계에서 실행합니다.
  3. 분석에 포함 할 항체 선택
    1. FSC-H 대 SSC-H를 사용하여 크기에 게이트를 하고 FSC-H 대 FSC-A를 사용하여 더블릿을 제거합니다.
    2. PE 형광 강도의 히스토그램을 생성하고 IgG 컨트롤 (IgG 비드 테스트 프로브, 테스트 비드 - IgG 프로브)을 테스트 된 쌍에 오버레이(그림2).
    3. 노이즈에 대한 명확한 신호를 제공하는 비드 프로브 쌍을 찾습니다(그림2B). 또한, 비드 및 프로브 모두에 동일한 항체를 사용하는 것은 이상적이지 않다. 차등 에피토프 인식은 몇몇 에피토프가 특정 단백질 복합체에서 폐색될 수 있기 때문에 상호 작용을 관찰의 기회를 최대화합니다. 허용 가능한 옵션이 없는 경우 추가 항체로 화면을 반복하십시오.
  4. 항체 특이성의 확인
    1. 의도된 표적에 대한 항체 특이성을 보장하기 위해, 타겟이 녹아웃된 용해 샘플을 사용; 예를 들어, 녹아웃 마우스 또는 RNAi 세포주. 대안적으로, 표적 단백질이 인위적으로 발현된 표적 음성 세포주에서 용해염을 사용한다.
    2. 1.2단계에서 설명한 대로 IP-FCM을 수행하고 실험에 맞게 수정한다.
  5. 세제 선택
    1. 공동 IP 실험에서 세제는 매우 중요하기 때문에 실험이 변화를 감지할 가능성이 극대화되도록 다양한 변형을 경험적으로 테스트합니다. 시작하려면 주어진 조건에서 변경되거나 연구에 특히 관심이 있는 비교적 작은 상호 작용 패널(4-8)을 선택합니다.
    2. 초기 스크린을 위해 만들어진 비형광, 항체 접합CML 비드를 사용하여, 다양한 용해 완충세제 조건을 사용하여 1.2에 기재된 바와 같이 IP-FCM을 수행한다. 세제 스크린은 유일한 변수로 세제로 수행하거나 각 세제에 대해 다른 세포 조건으로 수행 할 수 있습니다. 세제는 때때로 일부 IP-프로브 조합에서 예기치 않은 배경을 생성하기 때문에 항상 구슬과 프로브 모두에 IgG 컨트롤을 사용합니다.
    3. 화면의 MPI를 기반으로 PiSCES에 대한 신호를 최적화하는 세제를 선택합니다. 일부 타협은22를만들어야 할 가능성이 높습니다.

2. 멀티플렉스 시약 준비

  1. 마그네틱 비드 커플링
    1. 자기 비드 영역 맵을 사용하여 비드 영역을 선택하여 교차 감지 위험을 최소화하는 패턴으로 사용합니다. 마그네틱 비드는 일반적으로 위와 오른쪽으로 번지므로 대각선으로 인접한 비드 영역을 피하십시오. Luminex 웹 사이트에 표시된 비드 다이어그램의 다른 모든 열의 비드는 권장됩니다 (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/).
    2. 250 μL에서 PBS에서 0.1 mg/mL에서 캐리어가 없는 항체를 준비하십시오.
    3. 소용돌이 자기 구슬 광범위하게, 다음 aliquot 250 μL 호박 미세 원심 분리 튜브로 (광 표백으로부터 구슬을 보호하기 위해).
    4. 60s에 대한 자기 분리 자기 구슬과 상급을 제거합니다.
    5. MES 버퍼 250 μL(50 mM MES pH 6.0, 1 mM EDTA),와류, 60초 동안 자기적으로 분리된 후퍼내퍼를 제거합니다. MES 버퍼의 200 μL에서 자기 비드를 반복하고 다시 중단합니다.
    6. Sulfo-NHS의 일회용 튜브 2 mg에 MES 40 μL을 추가하여 50 mg/mL 스톡을 만듭니다.
    7. 자석 구슬에 갓 만든 Sulfo-NHS 25 μL을 추가하십시오. 소용돌이.
    8. MES 버퍼에 25 μL의 50 mg/mL을 새로 용해된 EDAC [1-에틸-3-(-3-디메틸아미노프로필) 카르보디미드 염산염을 MES 버퍼에 추가합니다. 소용돌이.
    9. 방 온도, 1000 rpm에서 20 분 동안 튜브 홀딩 부착물로 소용돌이를 덮고 흔들어줍니다.
    10. 60s를 위해 자석으로 분리하고 상한체를 제거하십시오.
    11. PBS, 소용돌이, 60 s에 대해 자기적으로 분리된 500 μL로 재중단하고 상한체를 제거합니다. 반복.
    12. 단계 2.1.2에서 항체 용액의 250 μL에서 재중단. 소용돌이.
    13. 1000 rpm에서 소용돌이에 흔들어 방 온도에서 2 시간 배양.
    14. 500 μL의 PBS를 자기 구슬, 소용돌이에 넣고 60초 동안 자석으로 분리하고 상한을 제거합니다.
    15. 블로킹/저장(B/S) 버퍼 750 μL을 추가합니다(PBS pH 7.4에서 BSA1% 0.01% NaN 3). 커버 와 방 온도에서 30 분 배양, 1000 rpm.
    16. 60s를 위해 자석으로 분리하고 상한체를 제거하십시오. B/S 버퍼의 100 μL에서 다시 일시 중단합니다.
    17. 4 °C에서 보관하십시오. 구슬은 1 년 이상 저장되고 QMI 계산서에서 성공적으로 사용되었지만 유통 기한 또는 만료 날짜는 공식적으로 확립되지 않았습니다. B/S 완충제의 NaN3는 세균 성장을 방지해야 한다.
    18. 1.1.5단계에서와 같이 형광 항숙성 종 보조 및 유동 세포계에서 판독된 결합된 자기 비드의 ~0.25 μL을 염색하여 자기 비드 커플링을 검증합니다.
  2. 생생
    1. 항체가 담체 단백질이 없는 PBS에 있는지 확인합니다.
    2. 생체연화될 항체의 총 μg를 계산합니다(멀티플렉스에 사용하기 위해 권장되는 100-200 μg, 스크리닝에 권장되는 25-50 μg).
    3. 신선한 10 mM 설포-NHS-비오틴을 준비합니다(ddH2O 의 224 μL을 1 mg 무계량 튜브에 첨가하여 수행할 수 있음).
    4. 항체, 소용돌이 또는 파이펫의 25 μg 당 10 mMM sulfo-NHS-비오틴 1 μL을 위아래로 섞어 넣습니다.
    5. 1 시간 동안 실내 온도에서 배양하십시오.
    6. 1 시간 동안 4 °C에서 배양하십시오.
    7. 30 kDa 스핀 필터를 사용하여 언바운드 비오틴을 제거하고 반응을 중지하십시오. PBS 500 μL을 추가하고 최소 볼륨에 도달할 때까지 열을 회전시면 됩니다. 500 μL의 추가 PBS를 추가하고 총 3개의 버퍼 교환을 반복합니다.
    8. 분광광도계에서 1-2 μL의 흡광도를 측정하여 농도를 추정한 다음 항체 농도를 0.5 mg/mL로 가져옵니다.
    9. 4 °C에서 보관하십시오.

3. 정량 적 다중 면역 침전

  1. 플레이트 레이아웃
    참고: 이 분석은 96웰 플레이트와 2-4개의 시료 조건을 사용하여 수행할 때 가장 효과적입니다.
    1. 조건 간의 변화를 감지하기 위해 항상 동일한 플레이트에서 적절한 컨트롤(즉, 자극된 v. 자극되지 않은 세포)을 실행합니다. 각 샘플을 플레이트 전체에 수평으로 분배하고, 각 컬럼을 다른 프로브 항체에 사용한다. 각 프로브에 대한 기술 복제 집합은 첫 번째 집합 직후에 실행되어야 합니다. 예제는 그림 3을 참조하십시오.
    2. 정확한 플레이트 로딩 및 해석을 용이하게 하기 위해 플레이트 레이아웃을 신중하게 문서화합니다.
  2. 시료 제제 및 면역 강수량 (1일째)
    1. 프로테아제 및 인산염 억제제와 함께 적절한 세제에서 조직 또는 세포를 용해시키고 15 분 동안 얼음에 배양하십시오. 항상 차가운 물기를 유지하기 위해주의하십시오.
      참고: 생체 재료 및 용해 단백질 농도를 정확하게 나타내는 양은 경험적으로 결정되어야 하며, 이전에 사용된 샘플의 몇 가지 예는 소개의 세 번째 단락에 나열되어 있습니다. 일반적으로, 시료당 2 mg/mL 단백질의 200 μL의 범위에서 과거에는 20개의 IP 및 20개의 프로브 표적에 대해 성공적이었지만, 각 항체 패널 및 세포 또는 조직 유형에 대한 이상적인 입력은 경험적으로 결정되어야 한다.
    2. 멤브레인과 이물질을 제거하기 위해 16,000 x g에서 15 분 동안 4 °C에서 스핀 다운하십시오. 상급 을 유지 하십시오.
    3. BCA 분석 또는 이와 유사한 단백질 농도를 결정한 다음 샘플 간에 단백질 농도를 정상화합니다. 셀을 사용하는 경우 조건당 동일한 수의 셀로 시작하고 정규화는 선택 사항입니다.
    4. 분석에서 각 클래스의 ~ 250 자기 비드를 포함하는 마스터 마그네틱 비드 믹스를 준비합니다. 데이터 분석 후 비드 숫자를 조정하여 향후 분석에서 각 클래스의 평균 110개의 비드를 웰당 읽을 수 있도록 합니다.
      참고: 예제 계산: (새 비드 체적) = [(실행 평균) / 110] * (이전 비드 체적). 비드 볼륨은 필요에 따라 8회 실행될 때마다 이러한 방식으로 조정해야 합니다. 전형적으로, 각 자기 비드의 3-4 μL(위와 같이 제조)은 2플레이트 실험에 사용된다.
    5. 자기 분리로 FlyP 버퍼에서 자기 비드 믹스 2x를 세척한 다음 FlyP 버퍼에서 다시 일시 중단합니다. 재서스펜션의 경우 플레이트당 샘플당 10 μL을 사용하십시오. 플라이P 버퍼는 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.4, 1 %BSA, 0.01 % NaN 3입니다.
    6. 마그네틱 비드 혼합물을 철저히 소용돌이치면, 10 μL을 얼음 차가운 미세원원지 튜브(샘플당 1개의 튜브)로 넣습니다. 면역 침전을 위해 각 튜브에 동일한 양의 용해액 (정규화 된 농도)을 추가하십시오.
    7. 용해-자기 비드 혼합물을 각 플레이트가 실행되도록 하나의 튜브로 Aliquot; 예를 들어 2 플레이트 실험의 경우 용해구를 두 개의 튜브로 분할합니다. 빛을 유지하기 위해 덮여 면역 침전을 위해 하룻밤 4 °C에서 회전자에 튜브를 놓습니다.
  3. 분석 을 실행 (2 일)
    1. 플레이트 #1 용 용해 자석 비드 튜브로 시작합니다. 마그네틱 비드 랙을 사용하여 자기 비드에서 용해를 제거하고 향후 분석을 위해 용해를 예약합니다. 얼음 차가운 FlyP 버퍼의 500 μL에 구슬 2 x를 씻으소서. 튜브튜브를 항상 얼음이나 4°C로 유지하십시오.
    2. 재서스펜션 볼륨을 (프로브 수) * (2 개의 기술 복제) * (웰 당 25 μL) * (파이펫팅 오류의 경우 1.1)로 재서스펜션 볼륨을 계산합니다. 얼음 차가운 FlyP 버퍼의 계산된 볼륨에서 IP를 다시 일시 중단합니다.
    3. 부드러운 파이펫팅으로 자기 구슬을 철저히 재중단한 후, 평평한 바닥의 96웰 플레이트에 우물당 25 μL을 얼음 위에 분배합니다.
    4. 다른 96웰 플레이트에서, 플라이P 버퍼에서 생체 물질화된 프로브 항체를 2배 작업 농도(일반적으로 1:100 또는 1:200, 경험적으로 결정함)로 희석하여 순서가 플레이트 레이아웃의 컬럼과 일치하도록 합니다(그림 3 참조) ). 작업 농도에서 프로브 항체의 최종 부피는 웰 당 50 μL이 될 것이므로 제조 된 각 2x 항체의 부피는 (25 μL) * *(생물학적 샘플 의 수) * (2 기술적 복제) * *(파이펫팅 오차에 대한 1.1).
    5. 다중 채널 파이펫을 사용하여 각 프로브 항체 희석의 25 μL을 자기 비드 함유 분석 판에 분배합니다.
    6. 수평 플레이트 셰이커를 흔들어 자기 구슬을 혼합하고 다시 일시 중단한 다음 4 °C에서 1 시간 동안 배양하고 어둠 속에서 450 rpm에서 흔들어줍니다.
    7. 4 °C에서 자기 플레이트 와셔에 FlyP 버퍼로 3x를 세척하십시오.
    8. 1:200 스트렙타비딘-PE의 50 μL에서 자기 구슬을 다시 중단하십시오.
    9. 흔들어서 구슬을 섞고 다시 일시 중단한 다음 4°C에서 30분 동안 배양하고 어둠 속에서 450rpm으로 흔들어 줍니다.
    10. 4 °C에서 자기 플레이트 와셔에 FlyP 버퍼로 3x를 세척하십시오.
    11. FlyP 버퍼의 125 μL에서 다시 일시 중단합니다.
    12. 900 rpm에서 1 분 동안 흔들어서 구슬을 완전히 다시 떨어 뜨리십시오.
    13. 냉장 유량 세포계에서 실행합니다(그림 S1의다이어그램 참조). 유세포계 소프트웨어에서 "높은 RP1 표적" 설정을 사용하고 지역당 1,000개의 비드의 정지 조건(기계가 조기에 정지하는 것을 막기 위해 개별적인 우물에 있어야 하는 수를 크게 초과)과 80 μL의 샘플 볼륨을 사용합니다.
    14. 중간 쯤에 달리기를 일시 중지하고 구슬을 다시 일시 중단하여 침전을 방지합니다.
    15. .xml 형식으로 데이터 파일을 내보냅니다.
    16. 3.3.1 단계에서 시작하여 나머지 플레이트에 대한 과정을 반복합니다.

4. 데이터 분석

참고: ANC 코드는 N = 4개의 실험에서 두 가지 조건을 비교하도록 설계되었으며 각 조건에 대해 2개의 기술 복제본이 있습니다. 예를 들어, 세포는 4개의 독립적인 시간을 자극하고, QMI는 상기와 같이 기술적 복제와 함께 제어(un자극되지 않은) 및 자극된 세포에 대해 4개의 상이한 날에 실행되고, 데이터 분석은 아래에 설명된 바와 같이 진행된다.

  1. 조정 가능한 알파 컷오프(ANC)가 있는 적응형 비파라메트릭
    1. MATLAB을 열고 활성 디렉터리를 ANC 프로그램 구성 요소와 유동 세포계에서 내보낸 .xml 파일이 포함된 폴더로 설정합니다.
    2. 실험 설계의 세부 사항을 반영하기 위해 "ANC 입력" 파일을 입력합니다. 추가 파일에 포함된 예제 파일은 예제 데이터를 실행하기 위해 미리 채워졌으며 또한 제공되었습니다.
    3. 활성 디렉터리에 .csv 파일을 작성하는 프로그램을 실행합니다. 이 파일은 제어 조건과 실험 조건 간에 0.05의 거짓 양성(알파) 수준에서, 4개의 실험 복제또는 적어도 3/4 복제에서 현저하게 다른 PiSCES를 보고합니다.
    4. 참고 'ANC 조회수'는 PiSCES로 정의되며, 4.3.1 단계에서 사용하기 위해 파일에서 3/4 °C 4/4로 표시되는 최소 3개의 실험 복제에 상당한 차이가 있습니다.
  2. 가중 상관 관계 네트워크 분석23 (CNA)
    1. "_MFI"로 끝나는 Matlab의 데이터 파일 출력의 열 제목을 붙여넣습니다. CSV"를 새 엑셀 시트의 첫 번째 행에 넣습니다. 실험 번호에 대한 열 "실험", 및 "치료", 실험 치료, 또는 분석 할 다른 변수를 추가합니다. 이 파일을 "traits.csv"로 저장합니다.
    2. R 스튜디오를 열고 작업 디렉토리를 "_MFI"가 포함된 폴더로 설정합니다. CSV"와 "특성. CSV" 파일.
    3. 주석 처리된 명령 파일및 파일에 포함된 지침에 자세히 설명된 대로 R 명령을 실행합니다. WCNA 모듈은 각 실험 적 특성과 크게 상관관계가 있는 그래픽 파일로 출력되며, 각 모듈과 각 상호 작용 IPi_ProbeJ의 상관관계는 .csv 파일로 출력됩니다.
    4. 모듈 멤버 자격(MM)과의 상호 작용으로 정의되는 'CNA 조회수'는 4.3.1단계에서 사용하기 위해 관심 있는 실험 변수와 유의한 상관관계로 확인된 모듈의 멤버십에 대해 0.7 및 p<0.05로 정의됩니다.
  3. 긍정적인 '조회수' 및 시각화
    1. ANC 출력 파일의 "3/4 °C 4/4 조회" 목록의 각 상호 작용에 대해(4.1.4 단계에서) CNA 출력 파일을 확인하여 해당 상호 작용이 "CNA 히트"인지 확인합니다(단계 4.2.6 참조). 각 ANC 적중이 CNA 적중인지 를 나타내는 새 열을 만듭니다.
    2. 4.1.3단계에서 ANC 출력 스프레드시트 "_Hits.csv"에 제공된 값을 평균화하여 각 ANC 에 대한 평균 로그2배 변경 값을 계산합니다. 값을 평균화하기 전에2배 변경값으로 변환합니다. 3/4 복제에서만 중요한 상호 작용의 경우 이상값 값을 삭제합니다.
    3. 각 ANC °C 를 한 열에 IP로 나열하고 두 번째 열의 프로브와 세 번째 열의 배 변경 값을 표시하여 스프레드시트를 만듭니다. 이 스프레드시트를 사용하여 파일을 네트워크로 가져와 Cytoscape에서 노드 에지 다이어그램을 만듭니다.

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결과

항체 스크리닝
그림 2 B는 코넥신36 단백질에 대한 스크린의 결과를 나타낸다. 대부분의 IP_probe 조합은 IgG 컨트롤에 대한 신호를 생성하지 않습니다. 단일클론 항체 1E5 및 1E5 또는 폴리클로날 항체(6200)를 가진 프로브를 가진 IP는 IgG 대조군과 비교하여 비드 분포에서 우회적인 변화를 일으킨다. 여기서, IP 1E5 및 프로브 6200poly는 IP 및 프로브와 동일?...

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토론

QMI 분석법은 항체 패널 개발, 장비 및 시약에 상당한 투자가 필요하지만, 일단 분석이 확립되면 실험적으로 제어되는 단백질 상호 작용 네트워크를 관찰하는 고차원 데이터를 수집할 수 있습니다. 자극. 기술적으로 QMI는 시료 및 항체 유정 위치의 신중한 파이펫팅 및 추적이 필요합니다. 분석 판에 신중하게 라벨을 붙이는 것은 종이에 우물 위치의 상세한 템플릿을 만드는 것과 같이 유용하며, 이?...

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공개

저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

감사의 말

저자는 QMI 분석 개발에 중요한 기여에 대한 테사 데이비스를 인정하고 자합니다, 기술 지도 및 지적 입력스미스와 슈럼 연구소의 현재와 전 회원. 이 작품은 NIMH 보조금 R01 MH113545 및 R00 MH 102244에 의해 지원되었다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well flat bottomed platesBio Rad171025001
96-well PCR platesVWR82006-704
Bioplex 200 System with HTFBio Rad171000205modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash StationBio Rad30034376
BSASigma
CML beadsInvitrogenC37481
EDTASigmaE6758
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo ScientificA39256
MagPlex MicrospheresLuminexMC12xxx-01xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification KitThermo Scientific45206used for antibody purification
MESSigmaM3671
Microplate film, non-sterileUSA Scientific2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2SigmaP5726
Protease inhibitor cocktailSigmaP8340
Sandwich Prep RefrigeratorNorlakeSMP 36 15for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluorideSigma201154
Sodium orthovanadateSigma450243
Streptavidin-PEBioLegend405204
Sulfo NHSThermo ScientificA39269
TrisFisher ScientificBP152

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