JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

定量多路复用免疫沉淀 （QMI） 使用流式细胞测定技术，灵敏地检测两个样本之间靶向蛋白-蛋白质相互作用的丰度差异。QMI可以使用少量的生物材料进行，不需要基因工程标签，并可以适应任何先前定义的蛋白质相互作用网络。

摘要

动态蛋白-蛋白质相互作用控制细胞行为，从运动到DNA复制到信号转导。然而，监测蛋白质相互作用网络中多种蛋白质之间的动态相互作用在技术上是困难的。在这里，我们提出了定量多路复用免疫沉淀 （QMI） 的协议，它允许根据暴露检测到的共享复合物中蛋白质的相对荧光测量，定量评估蛋白质相互作用的褶皱变化表面表位（PiSCES）。在QMI中，来自细胞解物的蛋白质复合物被免疫沉淀到微球上，然后用标记的抗体探测不同的蛋白质，以量化PiSCES的丰度。免疫沉淀抗体与不同的 MagBead 光谱区域结合，使流式细胞仪能够区分多个平行免疫沉淀，同时量化与每个光谱抗体相关的量。与其他免疫沉淀方法相比，QMI不需要遗传标记，可以使用最少的生物材料进行。QMI可以适应任何定义的相互作用蛋白组，到目前为止已经用于描述T细胞和神经元谷氨酸突触中的信号网络。研究结果产生了新的假说，具有潜在的诊断和治疗应用。该协议包括执行 QMI 的指令，从初始抗体面板选择到运行检测和分析数据。QMI测定的初始组装涉及筛选抗体以生成面板，并实证确定适当的莱沙缓冲液。随后的试剂制备包括共价耦合免疫沉淀抗体与MagBeads，以及生物仿菌探针抗体，以便它们可以被链球菌-结合荧光剂标记。为了运行测定，裂解物与MagBeads在一夜之间混合，然后用不同的探针抗体分珠和孵育，然后贴上荧光度标签，然后通过流式细胞仪读取。执行两个统计测试，以识别在实验条件之间差异很大的 PiSCES，并使用热图或节点边缘图对结果进行可视化。

引言

动态蛋白质-蛋白质相互作用构成分子信号级联和移动结构，是大多数细胞生理学的功能基础。这些过程通常被描述为线性信号通路，在基于单个输入的稳定状态之间切换，但实验和建模数据清楚地显示它们作为集成网络2、3、 4.就G蛋白而言，不同的受体通常具有激活同一G蛋白的能力，而单个受体也可以激活多种类型的G蛋白5，6。为了使相对较少的G蛋白类专门调节大量的细胞功能，如突触传输，激素调节和细胞迁移，细胞必须集成和区分这些信号4,5.有证据表明，对于G蛋白和其他蛋白质来说，这种信号特异性主要是基于精细调整的蛋白质-蛋白质相互作用及其时间动力学1，3。4,5,6,7.由于信令网络由具有多个输入、输出和反馈回路的动态蛋白质复合物组成，因此单个扰动有机会改变细胞生理的整体静时平衡4 ，7.现在人们普遍认为，信号应从网络的角度来研究，以便更好地了解多个输入的集成如何控制健康和疾病7、8、离散细胞功能。 9，10，11，12，13.鉴于此，开发了定量多路免疫沉淀 （QMI）， 以收集有关动态蛋白质相互作用网络中折叠变化的中等通量定量数据。

QMI 是一种基于抗体的测定，其中细胞解结物与一组免疫沉淀抗体进行孵育，这些抗体与含有不同比例荧光染料的磁珠共价耦合。将特定的抗体耦合到不同的磁珠类别，可以同时从同一致莱沙中同时对多个靶蛋白进行共免疫沉淀。在免疫沉淀 （IP） 之后，用第二种荧光荧光结合探针抗体（或与荧光磷结合链球菌联合剂联合的亲化抗体）孵育磁珠。每个 IP 抗体-探针抗体对或 PiSCES（暴露表面表位检测到的共享复合物中的蛋白质）之间的共结，然后通过流式细胞测定检测，并可在不同之间定量比较样本条件14.图1中的插图显示了运行QMI测定的步骤，包括由荧光结合探针抗体标记的带有免疫沉淀蛋白复合物的磁珠图（图1C）。

QMI 的灵敏度取决于赖酸与用于免疫沉淀的磁珠数量的蛋白质浓度，与其他基质相比，要检测 10% 折叠变化的分辨率只需要少量的起始材料共同知识产权方法14，15 。例如，QMI 中使用的起始材料量与三明治酶链接免疫吸附测定 （ELISA） 所需的原料量类似，但在单个 QMI 检测中检测到多个相互作用。使用 20 个 IP 和 20 个探针靶点进行的 QMI 测定使用从 4 mm 皮肤活检中分离的 1-5 x 105初级 T 细胞、从小鼠前额皮质的 3 mm 日冕部分或 3 x 106培养小鼠原发性小鼠原发性中分离的 P2 突触体制剂皮质神经元14，16，17。这种敏感性使 QMI 可用于分析可用性有限的细胞或组织，如临床样本。

QMI 可以适用于任何先前定义的蛋白质相互作用网络（前提是有抗体可用），并且到目前为止已经开发用于分析 T 细胞抗原受体 （TCR） 信号体和神经元谷氨酸突触中的蛋白质子集17,18.在T细胞受体信号的研究中，QMI首先用于识别PiSCES中的刺激引起的变化，然后区分自体免疫患者与对照组，检测内源性自身免疫信号，最后产生假说涉及一个不平衡的疾病相关的相互作用的子网络14。最近，同一个QMI面板被用来确定胸腺细胞的选择是由定量而不是质量差异在TCR相关蛋白质信号19。在神经元中，QMI用于描述不同类型的输入信号的蛋白质相互作用网络的输入特定重新排列，以支持新出现的突触可塑性模型17。此外，这个突触QMI面板用于识别七个自闭症小鼠模型的差异，根据PiSCES生物特征将模型聚集到子组中，并准确假设以前未识别的共享分子缺陷在一个模型16。类似的方法可用于筛选可能对不同药物治疗作出反应的其他子组，或将药物分配给特定反应的子组。除了基础科学之外，QMI在诊断、患者分型和药物开发方面也有潜在的应用。

为了组装QMI抗体面板，下面第1节描述了初始抗体筛选和选择方案。一旦确定抗体面板，第 2 节将所选抗体与磁性磁珠的偶联方案与 IP 磁珠结合，以及所选探针抗体的生物仿当。第 3 节描述了在细胞或组织莱沙上运行 QMI 测定的协议。最后，由于单个实验可以生成 +5 x 105个单个数据点，因此第 4 节提供了有助于数据处理、分析和可视化的说明和计算机代码。第 2-4 节中描述的工作流概述如图1所示。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

1. 测试设计

  1. 候选抗体制备
    1. 对于每个感兴趣的蛋白质，选择3到5个抗体进行筛选。如果可能，使用识别不同表位的单克隆抗体。还包括一种非特异性控制抗体。
    2. 要去除Tris，请通过将抗体添加到30 kDa自旋过滤器中，向下旋转至最小体积，加入500μL的磷酸盐缓冲盐水（PBS），并重复3次，从而进行缓冲液交换。要去除载体蛋白，请根据制造商的协议执行抗体纯化（有关特定纯化建议，请参阅材料表）。
      注:这是因为携带蛋白和带游向胺群的缓冲液（如Tris）会与COOH组发生反应，并淬火随后的珠子耦合和生物异化反应。确保所有抗体均被纯化（无载体蛋白），并在无原胺的缓冲液中（即无Tris）。
    3. 像戴维斯和施鲁姆20所描述的，将每个抗体与Carboxylate改性乳胶（CML）珠子耦合。为了保存抗体，将珠耦合反应缩减至1/5（即3.6 x 106个珠子，10μL为0.2-1 mg/mL抗体）。
    4. 使用流量计（通常为 ±108/mL）估计珠数，并储存在 4°C。珠子已经储存了一年多，并在QMI检测中成功使用，但保质期或保质期尚未正式确定。B/S缓冲液中的NaN3可防止细菌生长。
    5. 对每种抗体的一部分进行生物浸酯（见下文第2.2节）。储存在4°C。
    6. 通过染色 1 x 105珠子，与产生抗体的物种进行 PE 结合抗体反应，并在流动细胞仪上读取，确认有效的 CML 珠耦合和准确计数。
    7. 使用链球菌-HRP通过点印菌确认抗体生物异化。
    8. 一旦实验室生成了已知有效的试剂，在步骤 1.1.5 和 1.1.6 中使用这些试剂作为确认反应的阳性对照。
  2. IP-FCM 抗体筛查（流式细胞测定检测的免疫沉淀）
    1. 决定适当的筛选莱沙。对于此和所有其他 QMI 预筛选步骤（本节 1: 检测设计中包含的任何内容），请勿使用可用性有限的生物样本。相反，选择一种可比的控制材料，如野生型小鼠组织、细胞系或非限制资源的正常人类供体组织。
      注: 为此测定选择一个莱沙缓冲液并非易事，在第 1.5 节:洗涤剂选择以及讨论部分的倒数第二段中进行了讨论。标准莱沙缓冲液具有150 mM NaCl、50 mM Tris（pH 7.4）、10 mM氟化钠、2mM正交酸钠以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒。与QMI兼容的洗涤剂包括1%NP-40、1%Digitonin、0.1-1%Triton X-100和0.5-1%脱氧胆碱14，16，17，18，19，21 。
    2. 计算每个 IP 使用的莱沙的总体积，对要筛选的每个 IP-probe 组合使用 10 μL。如果筛选 X 探针抗体并使用一个 IgG 控制，则每个 IP 将使用 （X+1） = （10 μL） = （移液误差为 1.1）;X+1 用于考虑所需的 IgG 探头控制。例如，在 3x3 抗体屏幕中，每个 IP 应使用 44 ul。请记住包括 IgG IP 控制（参见图 2中的示例筛选设置 ）。
    3. 计算要使用的 CML 珠号。如果要筛选 X 探针抗体，请使用 [（X+1） = 5 x 104个珠子]。理想情况下，每口井 5，000 个珠子将导致流量细胞仪读取每个井的 >2，000 个磁珠。例如，在 3 x 3 抗体屏幕中，每个 IP 应使用 20，000 颗珠子，大约是步骤 1.1.3 中制备的 CML 珠子的 0.66 μL（首先应使用流量计对珠子进行量化以确保准确性）。
    4. 从步骤 1.2.2 孵育出的解结量，从步骤 1.2.3 筛选每个 CML 珠的体积，在 4°C 过夜，旋转以防止珠子沉淀。通常，在 96 孔 PCR 板的第一列和带 PCR 管带盖的盖中执行孵育。
    5. 在 3，200 x g下旋转 CML 珠子 1 分钟，然后通过单次快速轻拂板在水槽上去除解结。在轻拂之前和之后，每口油井的底部都应该可以看到一个微小的白色颗粒。
    6. 将 CML 磁珠重新悬浮在 FlyP 缓冲液的体积中，以等于每个珠探针对的 20 μL;对于 X 探针抗体，使用 （X+1） = （20 μL） = （移液误差为 1.1），类似于步骤 1.2.2。对于 3 x 3 屏幕，在 88 μL 的 FlyP 缓冲器中重新挂起。FlyP 缓冲液是 100 mM NaCl， 50 mM Tris pH 7.4， 1% BSA， 0.01% NaN3.
    7. 使用 20 μL/孔将每个 IP 分布在 96 孔 PCR 板的 （X+1） 孔中，其中 X 是筛选的探针抗体数。图 2A显示了筛选设置示例。
    8. 使用每口井 200 μL 的 FlyP 缓冲液额外洗涤 2 次。如步骤 1.2.5 中的步骤旋转板，并在每次洗涤后轻拂板以去除洗涤缓冲液。小球会非常小，但每次洗涤后应可见。
    9. 对于要筛选的每个生物异化抗体，计算总体积为 （Y+1） = 1.1 = 50 μL，其中 Y 是被筛查的 IP 抗体的数量。将抗体稀释到此体积的 FlyP 缓冲液中的工作浓度，通常从 0.5 mg/mL 库存的 1:100 稀释开始。
    10. 将每个稀释的抗体向下分配96孔板的每一列，并确保CML磁珠被重新悬浮。
    11. 在 4°C 孵育 1 小时，以 15 分钟为间隔旋转或移液，以确保 CML 磁珠保持悬浮状态。
    12. 在 200 μL 的 FlyP 缓冲液中清洗 3 倍，用于每个清洗离心机，并如步骤 1.2.5 中那样去除莱沙。
    13. 在 FlyP 缓冲液中重新悬浮所有 CML 珠子，在 50 μL 的 1:200 链球菌-PE 中。
    14. 在黑暗中4°C孵育30分钟。
    15. 在 200 μL 的 FlyP 缓冲液中清洗 3 倍，用于每个清洗离心机，并如步骤 1.2.5 中那样去除莱沙。
    16. 在 200 μL 的 FlyP 缓冲液中重新悬浮，然后在流式细胞仪上运行。
  3. 选择要包含在测定中的抗体
    1. 使用 FSC-H vs SSC-H 对 SSC-H 的尺寸门，并使用 FSC-H vs FSC-A 消除双精度值。
    2. 生成 PE 荧光强度的直方图，并将两个 IgG 对照（IgG 珠测试探针、测试珠-IgG 探针）叠加到测试对上（图 2）。
    3. 寻找在噪声上发出清晰信号的珠探对（图2B）。此外，对珠子和探针使用相同的抗体并不理想。差异表位识别可最大化观察相互作用的机会，因为某些表位可能被某些蛋白质复合物遮挡。如果没有可接受的选项，则重复屏幕与额外的抗体。
  4. 抗体特异性确认
    1. 为确保预期目标的抗体特异性，请使用被击出目标的掉酶体样本;例如，挖空鼠标或 RNAi 单元格线。或者，使用目标阴性细胞系的酸联，其中靶蛋白被人工表达。
    2. 执行步骤 1.2 中所述的 IP-FCM，修改以适合实验。
  5. 洗涤剂选择
    1. 由于洗涤剂在共IP实验中至关重要，因此通过实证测试不同变异，以确保检测具有检测变化的最大可能性。首先，选择一个相对较小的交互板（4-8），已知在给定条件下发生变化和/或对您的研究特别感兴趣。
    2. 使用用于初始屏幕的非荧光、抗体结合的CML磁珠，使用各种交流缓冲洗涤剂条件执行IP-FCM，如1.2所述。洗涤剂滤网可以用洗涤剂作为唯一变量进行，或者每种洗涤剂的细胞条件不同。始终对珠子和探头使用 IgG 控制，因为洗涤剂偶尔会在某些 IP-Probe 组合中产生意外的背景。
    3. 根据屏幕上的 MM，选择可优化感兴趣 PiSCES 信号的洗涤剂。可能需要在22日作出一些妥协。

2. 多路复用试剂制备

  1. 磁珠耦合
    1. 使用磁珠区域图，选择要以最小化交叉检测风险的模式使用的珠子区域。磁珠通常涂抹在右侧，因此请避开对角相邻的磁珠区域。建议从 Luminex 网站上显示的珠图的其他每一列的珠子（https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/）。
    2. 在250μL的PBS中以0.1毫克/mL（如1.1.2）制备无载体抗体。保持冰上，供以后使用。
    3. 涡旋磁珠广泛，然后等分250μL到琥珀微离心管（保护珠子不光漂白）。
    4. 磁性分离磁珠60s，并去除上清液。
    5. 加入 250 μL 的 MES 缓冲液（50 mM MES pH 6.0，1 mM EDTA），涡旋，磁分离 60 s，并去除上清液。在 200 μL 的 MES 缓冲液中重复并重新悬浮磁珠。
    6. 将 40 μL 的 MES 添加到 2 mg 的 Sulfo-NHS 一次性管中，以制作 50 mg/mL 的库存。
    7. 在磁珠中加入25μL的新鲜苏福-NHS。涡。
    8. 在MES缓冲液中加入25μL的50mg/mL新溶解的EDAC[1-乙基-3-（-3-二甲基氨基）盐酸甲二酰胺，也称为EDC]。涡。
    9. 在室内温度为 1000 rpm 时，用管固定附件盖住并摇动涡旋器 20 分钟。
    10. 磁性分离60s，并去除上清液。
    11. 在 500 μL 的 PBS 中重新悬浮，涡旋，磁分离 60 s 并去除上清液。重复。
    12. 从步骤2.1.2重新悬浮在250μL抗体溶液中。涡。
    13. 在室温下孵育2小时，在涡旋器上以1000rpm摇动。
    14. 将 500 μL 的 PBS 添加到磁珠、涡流中，以磁性分离 60 s，并去除上清液。
    15. 添加 750 μL 的阻塞/存储 （B/S） 缓冲液 （PBS pH 7.4 中的 1% BSA，0.01% NaN3）。在室内温度下盖盖和孵育 30 分钟，1000 rpm。
    16. 磁性分离60s，并去除上清液。在 100 μL 的 B/S 缓冲液中重新悬浮。
    17. 储存在4°C。珠子已经储存了一年多，并在QMI检测中成功使用，但保质期或保质期尚未正式确定。B/S缓冲液中的NaN3应防止细菌生长。
    18. 通过染色 ±0.25 μL 的耦合磁珠（具有荧光抗宿主物种二次和流量细胞仪上的读数）验证磁珠耦合，步骤 1.1.5 中。
  2. 生物异化
    1. 确保抗体在PBS中没有载体蛋白。
    2. 计算要生物素素的抗体总μg（100-200μg推荐用于多路复用，25-50μg推荐用于筛选）。
    3. 准备新鲜的10 mM磺酸-NHS-生物素（可以通过添加224 μL的ddH2O到1毫克无重量管）。
    4. 每25μg抗体、涡流或移液器上下添加1μL的10 mM磺酸-NHS-生物素以混合。
    5. 在室内温度孵育1小时。
    6. 在4°C孵育1小时。
    7. 使用 30 kDa 旋转过滤器去除未结合的生物锡并停止反应。添加 500 μL 的 PBS 并旋转列，直到达到最小音量。添加 500 μL 的额外 PBS，并重复 3 个总缓冲液交换。
    8. 通过在分光光度计上测量1-2μL的吸收率来估计浓度，然后将抗体浓度达到0.5mg/mL。
    9. 储存在4°C。

3. 定量多路免疫沉淀

  1. 板布局
    注:使用 96 孔板和 2-4 个样品条件进行检测时，此检测效果最佳。
    1. 始终在同一板上运行适当的控制（即刺激 v. 未刺激的细胞），以检测条件之间的变化。将每个样品水平分布到板上，并将每列用于不同的探针抗体。第一组探测后应立即运行每个探测器的一组技术复制。有关示例，请参阅图3。
    2. 仔细记录板材布局，以便准确进行板材装载和分析。
  2. 样品制备和免疫沉淀（第1天）
    1. 使用蛋白酶和磷酸酶抑制剂在适当的洗涤剂中进行酶组织或细胞，并在冰上孵育15分钟。时刻注意保持乳沙冷。
      注:说明生物材料和酸化蛋白浓度的确切数量必须经过经验确定，在导言第三段中列出了以前使用的样品的一些示例。一般来说，在200μL范围内，每个样品的2mg/mL蛋白在过去已经成功20个IP和20个探针靶点，但每个抗体面板和细胞或组织类型的理想输入必须根据经验确定。
    2. 在 4°C 下在 16，000 x g下旋转 15 分钟，以去除膜和碎屑;保持上清液作为莱沙。
    3. 执行 BCA 测定或类似方法以确定蛋白质浓度，然后在样品之间使蛋白质浓度正常化。如果使用单元格，则从每个条件以相等数量的单元格开始，规范化是可选的。
    4. 在测定中，准备一个主磁珠混合物，每井每井含有+250个磁珠。在数据分析后调整珠数，以便将来每井平均读取每类 110 个珠子。
      注:示例计算:（新珠卷） = [（运行平均值） / 110] =（上一个珠卷）。珠子体积应按此方式调整每 8 次运行或根据需要调整。通常，每个磁珠的3-4μL（如上所述）用于2板实验。
    5. 用磁分离将 FlyP 缓冲液中的磁珠混合 2 倍洗涤，然后在 FlyP 缓冲液中重新悬浮。对于再悬浮，每个板使用每个样品 10 μL。FlyP 缓冲液是 100 mM NaCl， 50 mM Tris pH 7.4， 1% BSA， 0.01% NaN3.
    6. 彻底涡涡磁珠混合物后，将 10 μL 等分放入冰冷的微离心管中（每个样品一管）。在每个管中加入相等数量的莱沙（具有标准化浓度），用于免疫沉淀。
    7. 将流盐磁珠混合物附于一管中，用于每个正在运行的板;例如，对于2板实验，裂化液分成两个管。在4°C的旋转器上放置管子过夜进行免疫沉淀，覆盖以挡光。
  3. 运行测定（第 2 天）
    1. 从板#1的乳液磁珠管开始。使用磁珠机架从磁珠中取出掉酶，并保留莱沙，以便将来分析。在 500 μL 的冰冷 FlyP 缓冲液中清洗珠子 2 倍。将管管始终保持在冰上或4°C处。
    2. 计算重新悬浮体积为（探头数） = （2 技术复制） = （每井 25 μL） = （移液误差为 1.1）。在冰冷的 FlyP 缓冲器的计算量中重新挂起 IP。
    3. 通过温和移液彻底重新悬浮磁珠后，在平底的 96 孔板上将每口 25 μL 分在冰上。
    4. 在不同的96孔板中，在FlyP缓冲液中稀释生物素素探针抗体至2倍工作浓度（工作浓度通常为1:100或1:200，经验测定），使其顺序与板布局上的列匹配（见图3).工作浓度下探针抗体的最终体积为每口50μL，因此制备的每2倍抗体的体积应为（25μL）*（生物样本数量）*（2次技术复制）*（移液误差为1.1）。
    5. 使用多通道移液器将每个探针抗体稀释的 25 μL 分配到含磁珠的测定板中。
    6. 在水平板摇杆上摇动以混合并重新悬浮磁珠，然后在 4°C 孵育 1 小时，在黑暗中以 450 rpm 的速度摇动。
    7. 在 4°C 的磁性板清洗器上用 FlyP 缓冲液清洗 3 倍。
    8. 在 50 μL 的 1:200 链球菌-PE 中重新悬浮磁珠。
    9. 摇动以混合并重新悬浮珠子，然后在 4°C 孵育 30 分钟，在黑暗中以 450 rpm 的速度摇动。
    10. 在 4°C 的磁性板清洗器上用 FlyP 缓冲液清洗 3 倍。
    11. 在 FlyP 缓冲液的 125 μL 中重新悬浮。
    12. 在 900 rpm 转速下摇动 1 分钟，彻底重新悬浮珠子。
    13. 运行在冷藏流式仪上（参见图 S1中的图表）。在流量细胞仪软件中使用"高 RP1 目标"设置，每个区域的停止条件为 1，000 个珠子（大大超过任何单个井中应达到的数字，以防止机器过早停止）和 80 μL 的样品体积。
    14. 中途暂停运行，然后重新悬挂珠子以防止沉降。
    15. 以 .xml 格式导出数据文件。
    16. 从步骤 3.3.1 开始，对其余板重复此过程。

4. 数据分析

注: ANC 代码旨在比较 N = 4 实验中的两个条件，每个实验每个条件有 2 个技术复制。例如，细胞被刺激四次独立时间，QMI在四个不同的控制（未刺激）和刺激细胞上运行，技术复制如上所示，数据分析如下所述。

  1. 自适应非参数，可调节 Alpha 截止 （ANC）
    1. 打开 MATLAB 并将活动目录设置为包含 ANC 程序组件和从流细胞仪导出的 .xml 文件的文件夹。
    2. 填写"ANC输入"文件，以反映实验设计的细节。补充文件中包括的示例文件已预先填充以运行示例数据，也提供了。
    3. 运行程序，它将将 .csv 文件写入活动目录。该文件报告在所有 4 个实验复制中，在控制条件和实验条件之间，在误报 （alpha） 级别为 0.05 的 PiSCES，或至少 3/4 次复制。
    4. 注意"ANC 命中"，它被定义为 PiSCES，在至少 3 个实验复制中存在显著差异，在文件中表示为 3/4_4⁄4，用于步骤 4.3.1。
  2. 加权关联网络分析23 （CNA）
    1. 由 Matlab 以"_MFI"结尾粘贴数据文件输出的列标题。CSV"进入新 Excel 工作表的第一行。添加实验编号的列"实验"和"治疗"，用于实验治疗或任何其他要分析的变量。将此文件另存为"traits.csv"。
    2. 打开 R 工作室，并将工作目录设置为包含"_MFI"的文件夹。CSV"和"TRAITS。CSV"文件。
    3. 运行 R 命令，如注释的命令文件中所示，以及文件附带的说明中的详细信息。WCNA 模块与每个实验特性显著相关，作为图形文件输出，每个交互 IPi_ProbeJ与每个模块的关联作为 .csv 文件输出。
    4. 注意"CNA 命中"，它定义为与模块成员身份 （MM） > 0.7 和 p < 0.05 的交互，用于模块中标识与感兴趣的实验变量显著相关的成员身份，用于步骤 4.3.1 中。
  3. 积极的"点击"和可视化
    1. 对于 ANC 输出文件中的"3/4= 4/4 命中"列表中的每个交互（从步骤 4.1.4 开始），通过检查 CNA 输出文件（请参阅步骤 4.2.6）确定该交互是否也是"CNA 命中"。创建一个新列，指示每个 ANC 命中是否也是 CNA 命中。
    2. 通过计算步骤 4.1.3 中 ANC 输出电子表格"_Hits.csv"中给出的值，计算每个 ANC = CNA 的平均日志2倍更改值。将值转换为在平均之前记录2倍更改。对于仅在 3/4 次复制中显著的交互，请删除异常值。
    3. 制作一个电子表格，每个 ANC @ CNA 命中都列为一列中的 IP、第二列中的探测和第三列中的折叠更改值。使用此电子表格通过将文件导入为网络，在 Cytoscape 中创建节点边缘关系图。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

抗体筛查
图 2B显示蛋白质 Connexin36 的屏幕结果。大多数 IP-probe 组合在 IgG 控制装置上不产生信号。与 IgG 对照组相比，具有单克隆抗体 1E5 和 1E5 或多克隆抗体 6200 的探针的 IP 在珠子分布中产生右移。在这里，选择 IP 1E5 和探针 6200poly 是为了避免使用与 IP 和探针相同的抗体，同时降低非特异性蛋白质被两个独立抗体识别的可能性，并增加使用不同...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

QMI 测定需要在抗体面板开发、设备和试剂方面投入大量资金，但一旦建立了检测，就可以收集高维数据来观察蛋白质相互作用网络，因为它们对实验控制的反应刺激。从技术上讲，QMI 需要仔细移液和跟踪样品和抗体井位置。仔细标记化片是有用的，就像在纸上制作井位的详细模板一样，然后保存该模板进行数据分析。在任何时候保持珠子和流源性冷的重要性，包括在流式细胞仪微孔板载体中（?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

披露声明

提交人没有利益冲突可披露。

致谢

作者希望感谢 Tessa Davis 对 QMI 测定开发做出的重要贡献，以及史密斯和施鲁姆实验室的现任和前任成员的技术指导和智力投入。这项工作由NIMH赠款R01 MH113545和R00 MH 102244资助。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well flat bottomed platesBio Rad171025001
96-well PCR platesVWR82006-704
Bioplex 200 System with HTFBio Rad171000205modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash StationBio Rad30034376
BSASigma
CML beadsInvitrogenC37481
EDTASigmaE6758
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo ScientificA39256
MagPlex MicrospheresLuminexMC12xxx-01xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification KitThermo Scientific45206used for antibody purification
MESSigmaM3671
Microplate film, non-sterileUSA Scientific2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2SigmaP5726
Protease inhibitor cocktailSigmaP8340
Sandwich Prep RefrigeratorNorlakeSMP 36 15for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluorideSigma201154
Sodium orthovanadateSigma450243
Streptavidin-PEBioLegend405204
Sulfo NHSThermo ScientificA39269
TrisFisher ScientificBP152

参考文献

  1. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  2. Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
  3. Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
  4. Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
  5. Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
  6. Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
  7. Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
  8. Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
  9. Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23(2005).
  10. Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
  11. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807(2010).
  12. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
  13. Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
  14. Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7(2016).
  15. Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science's STKE. 2007 (389), (2007).
  16. Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48(2018).
  17. Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
  18. Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
  19. Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
  20. Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
  21. Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722(2012).
  22. Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
  23. Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559(2008).
  24. Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

150 IP FCM QMI

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。