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Resumen

La inmunoprecipitación por multiplex (QMI) cuantitativa utiliza citometría de flujo para la detección sensible de diferencias en la abundancia de interacciones proteínas y proteínas dirigidas entre dos muestras. QMI se puede realizar utilizando una pequeña cantidad de biomaterial, no requiere etiquetas genéticamente diseñadas y se puede adaptar para cualquier red de interacción de proteínas previamente definida.

Resumen

Las interacciones dinámicas proteínas y proteínas controlan el comportamiento celular, desde la motilidad hasta la replicación del ADN y la transducción de la señal. Sin embargo, monitorear las interacciones dinámicas entre múltiples proteínas en una red de interacción proteica es técnicamente difícil. Aquí, presentamos un protocolo para la Inmunoprecipitación Cuantitativa múltiple (QMI), que permite la evaluación cuantitativa de los cambios de pliegue en las interacciones proteicas basadas en mediciones relativas de fluorescencia de Proteínas en Complejos Compartidos detectadas por Exposed Epítopos superficiales (PiSCES). En el QMI, los complejos proteicos de los lysaatos celulares se inmunoprecipitan en las microesferas y luego sondean con un anticuerpo etiquetado para una proteína diferente con el fin de cuantificar la abundancia de PiSCES. Los anticuerpos de inmunoprecipitación se conjugan en diferentes regiones espectrales de MagBead, lo que permite que un citómetro de flujo diferencie múltiples inmunoprecipitaciones paralelas y cuantifique simultáneamente la cantidad de anticuerpo de sonda asociado con cada una. QMI no requiere etiquetado genético y se puede realizar utilizando biomaterial mínimo en comparación con otros métodos de inmunoprecipitación. QMI se puede adaptar para cualquier grupo definido de proteínas que interactúan, y hasta ahora se ha utilizado para caracterizar las redes de señalización en las células T y las sinapsis de glutamato neuronal. Los resultados han dado lugar a una nueva generación de hipótesis con posibles aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Este protocolo incluye instrucciones para realizar QMI, desde la selección inicial del panel de anticuerpos hasta la ejecución de ensayos y el análisis de datos. El montaje inicial de un ensayo QMI implica la detección de anticuerpos para generar un panel y determinar empíricamente un búfer de lisis adecuado. La preparación posterior de reactivos incluye el acoplamiento covalente de anticuerpos de inmunoprecipitación a MagBeads, y anticuerpos de sonda biotinylantes para que puedan ser etiquetados por un fluoróforo conjugado con estreptavidina. Para ejecutar el ensayo, el islato se mezcla con MagBeads durante la noche, y luego las cuentas se dividen e incuban con diferentes anticuerpos de sonda, y luego una etiqueta de fluoróforo, y se lee por citometría de flujo. Se realizan dos pruebas estadísticas para identificar PiSCES que difieren significativamente entre las condiciones experimentales, y los resultados se visualizan mediante mapas de calor o diagramas de borde de nodo.

Introducción

Las interacciones dinámicas proteína-proteína constituyen las cascadas de señalización molecular y las estructuras móviles que son la base funcional de la mayoría de la fisiología celular1. Estos procesos a menudo se representan como vías de señalización lineal que cambian entre estados estables basados en entradas individuales, pero los datos experimentales y de modelado muestran claramente que funcionan como redes integradas2,3, 4. En el caso de las proteínas G, diferentes receptores a menudo tienen la capacidad de activar la misma proteína G, y un solo receptor también puede activar más de un tipo de proteína G5,6. Para que el número relativamente pequeño de clases de proteínas G modula específicamente una amplia gama de funciones celulares como la transmisión sináptica, la regulación hormonal y la migración celular, las células deben integrar y diferenciar estas señales4 , 5. La evidencia ha demostrado que esta especificidad de la señal, tanto para las proteínas G como para otras, se deriva principalmente sobre la base de interacciones proteína-proteína finamente afinadas y su dinámica temporal1,3, 4 , 5 , 6 , 7. Debido a que las redes de señalización se componen de complejos proteicos dinámicos con múltiples entradas, salidas y bucles de retroalimentación, una sola perturbación tiene la oportunidad de alterar el equilibrio homeostático general de la fisiología4 de una célula ,7. Ahora se acuerda ampliamente que la señalización debe ser examinada desde una perspectiva de red con el fin de comprender mejor cómo la integración de múltiples entradas controla las funciones celulares discretas en la salud y la enfermedad7,8, 9,10,11,12,13. A la luz de esto, se desarrolló la Inmunoprecipitación Múltiple Cuantitativa (QMI) para recopilar datos cuantitativos de rendimiento medio sobre los cambios de pliegue en las redes dinámicas de interacción de proteínas.

QMI es un ensayo basado en anticuerpos en el que el lisato celular se incuba con un panel de anticuerpos de inmunoprecipitación que se acoplan covalentemente a cuentas magnéticas que contienen proporciones distintas de colorantes fluorescentes. Tener anticuerpos específicos acoplados a distintas clases de cuentas magnéticas permite la co-inmunoprecipitación simultánea de múltiples proteínas diana del mismo lisato. Después de la inmunoprecipitación (IP), las perlas magnéticas se incuban con un segundo anticuerpo de sonda conjugada con fluoróforo (o anticuerpo biotinilado junto con estreptavidina conjugada con fluoróforo). Las coasociaciones entre las proteínas reconocidas por cada par de anticuerpos de anticuerpos IP- sondeo, o PiSCES (proteínas en complejos compartidos detectados por epítopos de superficie expuestos), se detectan por citometría de flujo y se pueden comparar cuantitativamente entre diferentes condiciones de la muestra14. Las ilustraciones de la Figura 1 muestran los pasos necesarios para ejecutar un ensayo QMI, incluido un diagrama de cuentas magnéticas con complejos proteicos inmunoprecipitados etiquetados por anticuerpos de sonda conjugados fluorescentes (Figura1C).

La sensibilidad de QMI depende de la concentración proteica del lisado en relación con el número de perlas magnéticas utilizadas para la inmunoprecipitación, y lograr una resolución para detectar cambios de pliegue del 10% requiere sólo una pequeña cantidad de material de partida en comparación con otros métodos co-IP14,15. Por ejemplo, la cantidad de material de partida utilizado en QMI es similar a la necesaria para un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas sándwich (ELISA), pero se detectan múltiples interacciones en un solo ensayo QMI. Los ensayos QMI con 20 IP y 20 dianas de sonda se han realizado utilizando células T primarias de 1-5 x 105 aisladas de una biopsia de piel de 4 mm, preparaciones sinapscontraómicas P2 a partir de una sección coronal de 3 mm de corteza prefrontal del ratón, o 3 x 106 neuronas corticales14,16,17. Esta sensibilidad hace que QMI sea útil para el análisis de células o tejidos con disponibilidad limitada, como muestras clínicas.

QMI se puede adaptar para cualquier red de interacción proteica previamente definida (siempre que los anticuerpos estén disponibles), y hasta la fecha se ha desarrollado para analizar el señalosoma del receptor de antígeno de células T (TCR) y un subconjunto de proteínas en las sinapsis glutamatérgicas en las neuronas 17 , 18. En estudios de señalización de receptores de células T, QMI se utilizó primero para identificar los cambios inducidos por la estimulación en PiSCES, y luego para distinguir a los pacientes autoinmunes de un grupo de control, detectar la señalización autoinmune endógena, y finalmente para generar una hipótesis que implica una subred de interacciones asociada a la enfermedad desequilibrada14. Más recientemente, se utilizó el mismo panel QMI para determinar que la selección de timocitos está determinada por diferencias cuantitativas en lugar de cualitativas en la señalización proteica asociada a la TCR19. En las neuronas, QMI se utilizó para describir la reorganización específica de la entrada de una red de interacción proteica para distintos tipos de señales de entrada de una manera que apoya los nuevos modelos de plasticidad sináptica17. Además, este panel QMI sináptico se utilizó para identificar diferencias en siete modelos de ratón de autismo, agrupar los modelos en subgrupos basados en sus biofirmas PiSCES, e hipotetizar con precisión un déficit molecular compartido que antes no era reconocido en uno de los modelos16. Un enfoque similar podría utilizarse para detectar otros subgrupos que podrían responder a diferentes tratamientos farmacológicos, o asignar medicamentos a subgrupos específicos con capacidad de respuesta. QMI tiene aplicaciones potenciales en diagnóstico, sub-tipado de pacientes y desarrollo de medicamentos, además de ciencia básica.

Para ensamblar un panel de anticuerpos QMI, los protocolos iniciales de selección y cribado de anticuerpos se describen en la Sección 1, a continuación. Una vez identificados los paneles de anticuerpos, los protocolos para la conjugación de los anticuerpos seleccionados con las perlas magnéticas para IP y para la biotinylación de los anticuerpos de sonda seleccionados, se describen en la Sección 2. El protocolo para ejecutar el ensayo QMI en los líticos celulares o tisulares se describe en la Sección 3. Por último, dado que un solo experimento puede generar puntos de datos individuales de 5 x 10 5, las instrucciones y los códigos informáticos para ayudar en el procesamiento, análisis y visualización de datos se proporcionan en la Sección 4. En la Figura 1se muestra una descripción general del flujo de trabajo descrito en las secciones 2-4.

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Protocolo

1. Diseño de ensayos

  1. Preparación de anticuerpos candidatos
    1. Para cada proteína de interés, elija de 3 a 5 anticuerpos para examinar. Cuando sea posible, utilice anticuerpos monoclonales que reconozcan diferentes epítopos. También incluya un anticuerpo de control no específico.
    2. Para eliminar Tris, realice el intercambio de búferes agregando el anticuerpo a un filtro de giro de 30 kDa, girando hacia abajo a su volumen mínimo, agregando 500 salinas con búfer de fosfato (PBS) y repitiendo 3 veces. Para eliminar las proteínas portadoras, realice la purificación de anticuerpos de acuerdo con el protocolo del fabricante (ver Tabla de Materiales para una recomendación de purificación específica).
      NOTA: Esto se hace porque las proteínas portadoras y los tampones con grupos de aminas libres (como Tris) reaccionarán con los grupos de COOH y apagarán las posteriores reacciones de acoplamiento de cuentas y biotinylación. Asegúrese de que todos los anticuerpos estén purificados (sin proteínas portadoras) y en un tampón libre de aminas primarias (es decir, no Tris).
    3. Acople cada anticuerpo a las perlas de látex modificado (CML) como describeDavis y Schrum20. Para conservar el anticuerpo, reduzca las reacciones de acoplamiento de perlas hasta en 1/5 (es decir, 3,6 x 106 perlas con 10 oL de anticuerpo de 0,2-1 mg/ml).
    4. Calcule los números de perlas utilizando un hemocitómetro (normalmente 108euros/ ml) y guárdelos a 4 oC. Las cuentas se han almacenado durante más de un año y se han utilizado con éxito en ensayos de QMI, pero no se han establecido formalmente fechas de vida útil o fechas de caducidad. NaN3 en el tampón B/S previene el crecimiento bacteriano.
    5. Biotinylar una porción de cada anticuerpo (ver sección 2.2 infra). Conservar a 4oC.
    6. Confirme el acoplamiento eficaz de perlas DeC y el recuento preciso mediante la tinción de 1 x 105 perlas con un anticuerpo conjugado en PE reactivo a la especie en la que se elevó el anticuerpo y la lectura en un citómetro de flujo.
    7. Confirme la biotinylación de anticuerpos por mancha de puntos utilizando estreptavidina-HRP.
    8. Una vez que el laboratorio haya generado reactivos que se sabe que son eficaces, utilice esos reactivos como controles positivos en las reacciones de confirmación en los pasos 1.1.5 y 1.1.6.
  2. Examen de anticuerpos por IP-FCM (inmunoprecipitación detectada por citometría de flujo)
    1. Decida un caso de cribado apropiado. Para este y todos los demás pasos de cribado previos a QMI (cualquier cosa incluida en esta sección 1: Diseño de ensayos), no utilice biomuestras con disponibilidad limitada. En su lugar, elija un material de control comparable, como tejido de ratón de tipo salvaje, líneas celulares o tejido de donante humano normal que no sea un recurso limitante.
      NOTA: La elección de un búfer de lisis para este ensayo no es trivial, y se describe en la sección 1.5: Selección de detergente, así como en el penúltimo párrafo de la sección Discusión. Los amortiguadores de lisis estándar tienen una base de 150 mM de NaCl, 50 mM Tris (pH 7.4), fluoruro de sodio de 10 mM, ortovanato de sodio de 2 mM y cócteles inhibidores de proteasa e fosfatasa. Los detergentes compatibles con QMI incluyen 1% NP-40, 1% Digitonin, 0.1-1% Triton X-100, y 0.5-1% desoxicolato14,16,17,18,19,21.
    2. Calcule el volumen total de lisado que se utilizará para cada IP, utilizando 10 l para cada combinación de IP-sonda que se va a examinar. Si los anticuerpos de la sonda X de cribado y el uso de un control IgG, cada IP utilizará (X+1) * (10 l) * (1.1 para el error de pipeteo); X+1 es tener en cuenta el control de sonda IgG requerido. Por ejemplo, en una pantalla de anticuerpos 3x3, cada IP debe utilizar 44 ul. Recuerde incluir un control IP IgG (véase la configuración de detección de ejemplo en el cuadro2).
    3. Calcule el número de perlas CML que se utilizará. Si está examinando anticuerpos de sonda X, utilice [(X+1) * 5 x 104 perlas]. Idealmente, 5.000 perlas por pozo darán como resultado >2.000 perlas por pozo leído por el catómetro de flujo. Por ejemplo, en una pantalla de anticuerpos de 3 x 3, cada IP debe utilizar 20.000 perlas, que es aproximadamente 0,66 l de material de perlas CML preparado según el paso 1.1.3 (las perlas deben cuantificarse primero con un hemocitómetro para garantizar la precisión).
    4. Incubar el volumen de lisado del paso 1.2.2 con el volumen de cada cordón CML que se va a examinar desde el paso 1.2.3, durante la noche a 4oC con rotación para evitar que las perlas se asienten. Típicamente, realizar incubaciones en la primera columna de una placa pcR de 96 pocillos, y tapa con tapas de tiras de tubo PCR.
    5. Gire las perlas CML a 3.200 x g durante 1 min y retire el lysate con un solo movimiento rápido de la placa sobre el fregadero. Un pequeño pellet blanco debe ser visible en la parte inferior de cada pozo antes y después de parpadear.
    6. Resuspenda las perlas CML en un volumen de búfer FlyP a igual a 20 l para cada par de sondas de cordón; para anticuerpos de sonda X, utilice (X+1) * (20 l) * (1,1 para el error de pipeteo), similar al paso 1.2.2. Para una pantalla de 3 x 3, resuspende en 88 s de búfer FlyP. El búfer FlyP es 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.4, 1% BSA, 0.01% NaN3.
    7. Distribuya cada IP entre los pozos (X+1) de una placa PCR de 96 pocillos, donde X es el número de anticuerpos de sonda que se están examinando, utilizando 20 l/bien. Figura 2 A muestra un ejemplo de configuración de detección.
    8. Lave 2 veces más usando 200 s l de tampón FlyP por poca. Gire la placa como en el paso 1.2.5 y deslice la placa para quitar el tampón de lavado después de cada lavado. Los pellets serán extremadamente pequeños, pero deben ser visibles después de cada lavado.
    9. Para que cada anticuerpo biotinylato sea examinado, calcule el volumen total como (Y+1) * 1.1 * 50 l, donde Y es el número de anticuerpos IP que se están examinando. Diluir el anticuerpo a una concentración de trabajo en este volumen de búfer FlyP, normalmente a partir de 1:100 dilución de un stock de 0,5 mg/ml.
    10. Distribuya cada anticuerpo diluido por cada columna de la placa de 96 pocillos y asegúrese de que las perlas de LMC se resuspenden.
    11. Incubar a 4oC durante 1 h, ya sea con rotación o pipeteo a intervalos de 15 minutos para garantizar que las perlas CML permanezcan en suspensión.
    12. Lavar 3 x en 200 l de tampón FlyP, para cada centrífuga de lavado y retirar el lisato como en el paso 1.2.5.
    13. Resuspenda todas las perlas de LMC en 50 l de 1:200 Streptavidin-PE en el búfer FlyP.
    14. Incubar a 4oC en la oscuridad durante 30 min.
    15. Lavar 3 x en 200 l de tampón FlyP, para cada centrífuga de lavado y retirar el lisato como en el paso 1.2.5.
    16. Resuspenda en 200 l de búfer FlyP y, a continuación, ejecute en un citómetro de flujo.
  3. Elegir anticuerpos para incluir en el ensayo
    1. Obstrucción en tamaño usando FSC-H vs SSC-H, y elimine los dobletes usando FSC-H vs FSC-A.
    2. Genere histogramas de intensidad de fluorescencia PE y superponga ambos controles IgG (sonda de prueba de perlas IgG, sonda de prueba de cuentas-IgG) en pares probados (Figura2).
    3. Busque un par de sondas de cuentas que dé una señal clara sobre el ruido (Figura2B). Además, no es ideal utilizar el mismo anticuerpo tanto para el cordón como para la sonda. El reconocimiento diferencial de epítopos maximiza las posibilidades de observar interacciones porque algunos epítopos pueden estar ocluidos en ciertos complejos proteicos. Si no hay opciones aceptables, repita la pantalla con anticuerpos adicionales.
  4. Confirmación de la especificidad de los anticuerpos
    1. Para garantizar la especificidad de los anticuerpos para los objetivos previstos, utilice una muestra de isote en la que el objetivo haya sido eliminado; por ejemplo, un ratón knockout o una línea celular RNAi. Alternativamente, utilice el lisado de una línea celular diana-negativa en la que la proteína diana se ha expresado artificialmente.
    2. Realice el IP-FCM como se describe en el paso 1.2, modificando para ajustar el experimento.
  5. Selección de detergente
    1. Como los detergentes son críticos en los experimentos de co-IP, pruebe empíricamente diferentes variaciones para asegurarse de que el ensayo tiene la máxima probabilidad de detectar cambios. Para empezar, elija un panel relativamente pequeño de interacciones (4-8) que se sabe que cambian en una condición dada y / o son de particular interés para su estudio.
    2. Usando los perlas CML no fluorescentes y conjugadas con anticuerpos hechas para pantallas iniciales, realice IP-FCM como se describe en 1.2 utilizando condiciones variadas de detergente tampón de lisis. Las pantallas de detergente se pueden realizar con detergente como única variable, o con diferentes condiciones celulares para cada detergente. Utilice siempre controles IgG tanto para perlas como para sondas, ya que los detergentes ocasionalmente producen un fondo inesperado en algunas combinaciones de IP-Probe.
    3. Basándose en las IMF de la pantalla, elija un detergente que optimice la señal para el PiSCES de interés. Es probable que algunos compromisos deberán hacerse22.

2. Preparación de reactivos multiplex

  1. Acoplamiento magnético de perlas
    1. Con el mapa de región de cordón magnético, seleccione las regiones de cordón que desea utilizar en un patrón que minimice el riesgo de detección cruzada. El cordón magnético normalmente se une hacia arriba y hacia la derecha, así que evita las regiones de cuentas que son diagonalmente adyacentes. Se recomiendan las cuentas de todas las demás columnas del diagrama de cuentas que se muestran en el sitio web de Luminex (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/).
    2. Preparar el anticuerpo sin portador a 0,1 mg/ml en PBS (como en 1.1.2) en 250 l. Mantener en hielo para su uso posterior.
    3. Cuentas magnéticas de vórtice extensamente, y luego alícuota 250 l en un tubo de microcentrífuga de ámbar (para proteger las perlas del fotoblanqueo).
    4. Separe magnéticamente las perlas magnéticas durante 60 s y retire el sobrenadante.
    5. Añadir 250 l de tampón MES (50 mM MES pH 6.0, 1 mM EDTA), vórtice, magnéticamente separado durante 60 s, y quitar el sobrenadante. Repita y resuspenda las perlas magnéticas en 200 ml de tampón MES.
    6. Añadir 40 ml de ETM a un tubo de un solo uso de Sulfo-NHS de 2 mg para hacer un stock de 50 mg/ml.
    7. Añadir 25 l de Sulfo-NHS recién hecho a las cuentas magnéticas. Vórtice.
    8. Añadir 25 l de 50 mg/ml de EDAC recién disuelto [1-etil-3-(-3-dimetilaminopropyl) clorhidrato de carbodiimida, también llamado EDC] en tampón MES. Vórtice.
    9. Cubra y agite en un vórtice con un accesorio de sujeción del tubo durante 20 minutos a temperatura ambiente, 1000 rpm.
    10. Separe magnéticamente durante 60 s y retire el sobrenadante.
    11. Resuspender en 500 l de PBS, vórtice, magnéticamente separado durante 60 s y quitar el sobrenadante. Repetir.
    12. Resuspender en 250 l de solución de anticuerpos a partir del paso 2.1.2. Vórtice.
    13. Incubar 2 h a temperatura ambiente con temblor en un vórtice a 1000 rpm.
    14. Añadir 500 l de PBS a las perlas magnéticas, vórtice, magnéticamente separados durante 60 s, y quitar el sobrenadante.
    15. Añadir 750 l de búfer de bloqueo/almacenamiento (B/S) (1% BSA en PBS pH 7.4, 0.01% NaN3). Cubrir e incubar 30 min a temperatura ambiente, 1000 rpm.
    16. Separe magnéticamente durante 60 s y retire el sobrenadante. Resuspender en 100 l de búfer B/S.
    17. Conservar a 4oC. Las cuentas se han almacenado durante más de un año y se han utilizado con éxito en ensayos de QMI, pero no se han establecido formalmente fechas de vida útil o fechas de caducidad. NaN3 en el tampón B/S debe prevenir el crecimiento bacteriano.
    18. Validar el acoplamiento de perlas magnéticas mediante la tinción de 0,25 l de perlas magnéticas acopladas con una especie fluorescente antihuésped secundaria y la lectura en un citómetro de flujo, como en el paso 1.1.5.
  2. Biotinylación
    1. Asegúrese de que los anticuerpos estén en PBS sin proteína portadora.
    2. Calcular el total de anticuerpos que se va a biotinylar (100-200 g se recomienda para su uso en múltiples xel, 25-50 g recomendados para el cribado).
    3. Preparar sulfo-NHS-biotina fresco de 10 mM (se puede hacer añadiendo 224 sL de ddH2O a un tubo sin pesaje de 1 mg).
    4. Añadir 1 l de 10 mM de sulfo-NHS-biotina por cada 25 g de anticuerpo, vórtice o pipeta hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
    5. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
    6. Incubar a 4oC durante 1 h.
    7. Utilice un filtro de giro de 30 kDa para eliminar la biotina no unida y detener la reacción. Agregue 500 sL de PBS y gire la columna hasta que se alcance el volumen mínimo. Agregue 500 l de PBS adicional y repita para 3 intercambios de búfer totales.
    8. Estimar la concentración midiendo la absorbancia de 1-2 l en un espectrofotómetro, y luego llevar la concentración de anticuerpos a 0,5 mg/ml.
    9. Conservar a 4oC.

3. Inmunoprecipitación múltiple cuantitativa

  1. Diseño de placas
    NOTA: Este ensayo funciona mejor cuando se realiza con placas de 96 pocillos y 2-4 condiciones de muestra.
    1. Realice siempre los controles adecuados (es decir, células estimuladas v. no estimuladas) en la misma placa para detectar cambios entre condiciones. Distribuya cada muestra horizontalmente a través de la placa y utilice cada columna para un anticuerpo de sonda diferente. Se debe ejecutar un conjunto de réplicas técnicas para cada sondeo inmediatamente después del primer conjunto. Vea la figura 3 para un ejemplo.
    2. Documente cuidadosamente el diseño de la placa para facilitar la carga y el análisis precisos de la placa.
  2. Preparación de muestras e inmunoprecipitación (Día 1)
    1. Tejido o células de Lise en detergente adecuado con inhibidores de la proteasa y la fosfatasa e incubar en hielo durante 15 min. Tenga cuidado de mantener el lisado frío en todo momento.
      NOTA: La cantidad exacta de concentración de biomateriales y proteínas de lisado indicada debe determinarse empíricamente, y algunos ejemplos de muestras utilizadas anteriormente se enumeran en el tercer párrafo de la introducción. En general, en el rango de 200 l de proteína de 2 mg/ml por muestra ha tenido éxito en el pasado para 20 ip y 20 dianas de sonda, pero las entradas ideales para cada panel de anticuerpos y tipo de célula o tejido deben determinarse empíricamente.
    2. Girar a 4 oC durante 15 minutos a 16.000 x g para eliminar membranas y escombros; mantener sobrenadante como lisado.
    3. Realizar un ensayo BCA o similar para determinar las concentraciones de proteínas, y luego normalizar la concentración de proteínas entre las muestras. Si utiliza celdas, comience con un número igual de celdas por condición y la normalización es opcional.
    4. Preparar una mezcla de perlas magnéticas maestras que contenga 250 perlas magnéticas de cada clase por pozo en el ensayo. Ajuste los números de perlas después del análisis de datos para que en ensayos futuros se lea un promedio de 110 perlas de cada clase por pozo.
      NOTA: Ejemplo de cálculo: (Nuevo volumen de cordón) - [(Ejecutar promedio) / 110] * (volumen de cordón anterior). Los volúmenes de cuentas deben ajustarse de esta manera aproximadamente cada 8 corridas o según sea necesario. Típicamente, 3-4 l de cada cordón magnético (preparado como arriba) se utilizan para un experimento de 2 placas.
    5. Lave la mezcla de perlas magnéticas 2x en el búfer FlyP con separación magnética, y luego resuspenda en el búfer FlyP. Para la resuspensión, utilice 10 ml por muestra por placa. El búfer FlyP es 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.4, 1% BSA, 0.01% NaN3.
    6. Después de vórtice completamente la mezcla magnética de perlas, alícuota de 10 ml en tubos de microcentrífuga helada (un tubo por muestra). Añadir volúmenes iguales de lisato (con concentraciones normalizadas) a cada tubo para la inmunoprecipitación.
    7. Alícuota la mezcla de perlas de lisado-magnética en un tubo para cada placa que se está ejecutando; por ejemplo, para un experimento de 2 placas, dividir el lisado en dos tubos. Colocar los tubos en un rotador a 4oC durante la noche para la inmunoprecipitación, cubiertos para mantener fuera de la luz.
  3. Ejecución del ensayo (Día 2)
    1. Comience con los tubos de cordón magnético de lisado para la placa #1. Utilice un estante de cuentas magnéticas para eliminar el lysate de las cuentas magnéticas y reserve el lisado para su análisis futuro. Lave las perlas 2 veces en 500 ml de tampón FlyP helado. Mantenga los tubos siempre sobre hielo o a 4 oC.
    2. Calcule el volumen de resuspensión como (número de sondas) * (2 réplicas técnicas) * (25 l por pozo) * (1,1 para el error de pipeteo). Resuspenda las direcciones IP en el volumen calculado del búfer FlyP helado.
    3. Después de recuperar completamente las perlas magnéticas mediante pipeteo suave, distribuya 25 ml por pozo a través de una placa de 96 pozos de fondo plano, en hielo.
    4. En una placa de 96 pocillos diferente, diluir anticuerpos de sonda biotinilados a una concentración de trabajo 2x (la concentración de trabajo es típicamente 1:100 o 1:200, empíricamente determinada) en el búfer FlyP para que su orden coincida con las columnas en el diseño de la placa (ver Figura 3 ). El volumen final de anticuerpos de sonda a la concentración de trabajo será de 50 ml por pozo, por lo que el volumen de cada anticuerpo 2x preparado debe ser (25 l) * (número de muestras biológicas) * (2 réplicas técnicas) * (1,1 para el error de pipeteo).
    5. Utilice una pipeta multicanal para distribuir 25 ml de cada dilución de anticuerpos de sonda en la placa de ensayo que contiene perlas magnéticas.
    6. Agitar en un agitador de placa horizontal para mezclar y resuspender las cuentas magnéticas, y luego incubar a 4 oC durante 1 h, agitando a 450 rpm en la oscuridad.
    7. Lavar 3x con tampón FlyP en una arandela de placa magnética a 4 oC.
    8. Resuspenda las perlas magnéticas en 50 s de 1:200 Streptavidin-PE.
    9. Agitar para mezclar y resuspender perlas, y luego incubar a 4 oC durante 30 minutos, agitando a 450 rpm en la oscuridad.
    10. Lavar 3x con tampón FlyP en una arandela de placa magnética a 4 oC.
    11. Resuspender en 125 l de búfer FlyP.
    12. Agitar durante 1 min a 900 rpm para resuspender completamente las perlas.
    13. Ejecutar en el cytómetro de flujo refrigerado (véase el diagrama en la figura S1). Utilice el ajuste "objetivo de alto RP1" en el software del citómetro de flujo, y una condición de parada de 1.000 perlas por región (sobretodondo en gran medida el número que debe estar en cualquier pozo individual para evitar que la máquina se detenga prematuramente) y un volumen de muestra de 80 l.
    14. Detenga la carrera a mitad de camino y vuelva a suspender las cuentas para evitar que se asenten.
    15. Exporte archivos de datos en el formato .xml.
    16. Repita el proceso para las placas restantes, comenzando en el paso 3.3.1.

4. Análisis de datos

NOTA: El código ANC se diseñó para comparar dos condiciones de los experimentos N a 4, cada uno con 2 réplicas técnicas para cada condición. Por ejemplo, las células se estimulan cuatro veces independientes, QMI se ejecuta en cuatro días diferentes en el control (sin estimular) y las células estimuladas, con réplicas técnicas como arriba, y el análisis de datos continúa como se describe a continuación.

  1. Adaptativo no paramétrico con límite alfa ajustable (ANC)
    1. Abra MATLAB y establezca el directorio activo en una carpeta que contenga los componentes del programa ANC y los archivos .xml exportados desde el citometro de flujo.
    2. Rellene el archivo "Entrada ANC" para reflejar los detalles del diseño experimental. El archivo de ejemplo incluido en Archivo complementario se ha rellenado previamente para ejecutar los datos de ejemplo, también proporcionados.
    3. Ejecute el programa, que escribirá un archivo .csv en el directorio activo. El archivo informa de PISCES que son significativamente diferentes, en un nivel de falso positivo (alfa) de 0,05, entre condiciones de control y experimentales, en las 4 réplicas experimentales, o al menos 3/4 réplicas.
    4. Nota: 'aciertos ANC', que se definen como PiSCES con diferencias significativas en al menos 3 réplicas experimentales, representadas como 3x4 x 4/4 en el archivo, para su uso en el paso 4.3.1.
  2. Análisis de red de correlación ponderada23 (CNA)
    1. Pegar-transponer los títulos de columna de la salida del archivo de datos por Matlab terminando en "_MFI. CSV" en la primera fila de una nueva hoja de Excel. Agregue las columnas "experimento" para el número de experimento, y "tratamiento", para el tratamiento experimental, o cualquier otra variable a analizar. Guarde este archivo como "traits.csv".
    2. Abra R studio y establezca el directorio de trabajo en una carpeta que contenga "_MFI. CSV" y "TRAITS. CSV".
    3. Ejecute los comandos R como se indica en el archivo de comandos comentado y en las instrucciones incluidas con los archivos. Los módulos WCNA significativamente correlacionados con cada rasgo experimental se generan como un archivo gráfico, y la correlación de cada interacción IPi_ProbeJ con cada módulo se genera como un archivo .csv.
    4. Nota: 'cna hits', que se definen como interacciones con la pertenencia al módulo (MM) > 0.7 y p < 0.05 para la pertenencia a un módulo que se identificó como significativamente correlacionado con la variable experimental de interés, para su uso en el paso 4.3.1.
  3. 'hits' y visualización positivos
    1. Para cada interacción en la lista "3/4 x 4/4 hits" en el archivo de salida ANC (del paso 4.1.4), identifique si esa interacción es también un "golpe CNA" comprobando el archivo de salida CNA (véase el paso 4.2.6). Cree una nueva columna que indique si cada golpe ANC es también un golpe CNA.
    2. Calcule el valor promedio del cambio de plegado del registro2 para cada hit de CNA ANC, promediando los valores dados en la hoja de cálculo de salida ANC "_Hits.csv" del paso 4.1.3. Convierta los valores en el registro2 de cambio de pliegue antes de promediar. Para las interacciones que solo fueron significativas en 3/4 réplicas, elimine el valor atípico.
    3. Haga una hoja de cálculo con cada hit ANC-CNA listado como IP en una columna, un sondeo en la segunda columna y el valor de cambio de plegado en la tercera columna. Utilice esta hoja de cálculo para crear un diagrama de borde de nodo en Cytoscape importando el archivo como una red.

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Resultados

Detección de anticuerpos
Figura 2 B muestra los resultados de una pantalla para la proteína Connexin36. La mayoría de las combinaciones IP_probe no producen ninguna señal sobre los controles IgG. La IP con el anticuerpo monoclonal 1E5 y la sonda con 1E5 o el anticuerpo policlonal 6200 produce un cambio hacia la derecha en la distribución del cordón en comparación con los controles IgG. Aquí, IP 1E5 y la sonda 6200poly fueron seleccionados para evi...

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Discusión

El ensayo QMI requiere una inversión sustancial en el desarrollo de paneles de anticuerpos, equipos y reactivos, pero una vez establecido el ensayo, se pueden recopilar datos de alta dimensión observando redes de interacción de proteínas a medida que responden a las Estímulos. Técnicamente, QMI requiere un cuidadoso pipeteo y seguimiento de las ubicaciones de pozos de muestras y anticuerpos. Etiquetar cuidadosamente las placas de ensayo es útil, al igual que hacer una plantilla detallada de las ubicaciones de pozo...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean reconocer a Tessa Davis por sus importantes contribuciones al desarrollo del ensayo QMI, y a los miembros actuales y anteriores de los laboratorios Smith y Schrum por su orientación técnica y aportación intelectual. Este trabajo fue financiado por las subvenciones NIMH R01 MH113545 y R00 MH 102244.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well flat bottomed platesBio Rad171025001
96-well PCR platesVWR82006-704
Bioplex 200 System with HTFBio Rad171000205modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash StationBio Rad30034376
BSASigma
CML beadsInvitrogenC37481
EDTASigmaE6758
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo ScientificA39256
MagPlex MicrospheresLuminexMC12xxx-01xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification KitThermo Scientific45206used for antibody purification
MESSigmaM3671
Microplate film, non-sterileUSA Scientific2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2SigmaP5726
Protease inhibitor cocktailSigmaP8340
Sandwich Prep RefrigeratorNorlakeSMP 36 15for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluorideSigma201154
Sodium orthovanadateSigma450243
Streptavidin-PEBioLegend405204
Sulfo NHSThermo ScientificA39269
TrisFisher ScientificBP152

Referencias

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