JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'immunoprecipitazioni quantitativa multiplex (QMI) utilizza la citometria di flusso per rilevare sensitivemente le differenze nell'abbondanza di interazioni mirate proteina-proteina tra due campioni. QMI può essere eseguita utilizzando una piccola quantità di biomateriale, non richiede tag geneticamente ingegnerizzati e può essere adattato per qualsiasi rete di interazione proteica definita in precedenza.

Abstract

Le interazioni dinamiche proteina-proteina controllano il comportamento cellulare, dalla motilità alla replicazione del DNA alla trasduzione del segnale. Tuttavia, il monitoraggio delle interazioni dinamiche tra più proteine in una rete di interazione proteica è tecnicamente difficile. Qui presentiamo un protocollo per l'immunoprecipitazioni Quantitative Multiplex (QMI), che consente la valutazione quantitativa dei cambiamenti di piegatura nelle interazioni proteiche sulla base delle misurazioni relative a fluorescenza delle proteine nei complessi condivisi rilevate da Exposed Epitopi di superficie (PiSCES). Nel QMI, i complessi proteici da lismi cellulari sono immunoprecipitati sulle microsfere, e quindi sondati con un anticorpo etichettato per una proteina diversa al fine di quantificare l'abbondanza di PiSCES. Gli anticorpi dell'immunoprecipitazioni sono coniugati a diverse regioni spettrali MagBead, il che consente a un citometro di flusso di differenziare più immunoprecipitazioni parallele e quantificare simultaneamente la quantità di anticorpi sonda associati a ciascuna di esse. QMI non richiede l'etichettatura genetica e può essere eseguita utilizzando un biomateriale minimo rispetto ad altri metodi di immunoprecipitazioni. QMI può essere adattato per qualsiasi gruppo definito di proteine interagenti, ed è stato finora utilizzato per caratterizzare le reti di segnalazione nelle cellule T e sinapsi glutammato neuronale. I risultati hanno portato alla generazione di nuove ipotesi con potenziali applicazioni diagnostiche e terapeutiche. Questo protocollo include istruzioni per eseguire QMI, dalla selezione iniziale del pannello anticorpale fino all'esecuzione di saggi e all'analisi dei dati. L'assemblaggio iniziale di un saggio QMI prevede lo screening di anticorpi per generare un pannello e la determinazione empirica di un buffer di lisi appropriato. La successiva preparazione del reagente comprende anticorpi di immunoprecipitazioni covalentmente di accoppiamento a MagBeads, e anticorpi della sonda biotinylante in modo che possano essere etichettati da un fluoroforo coniugato di streptavidin. Per eseguire il saggio, il lisato viene mescolato con MagBeads durante la notte, e poi le perle sono divise e incubate con diversi anticorpi della sonda, quindi un'etichetta di fluoroforo, e lette per citometria di flusso. Vengono eseguiti due test statistici per identificare i PiSCES che differiscono in modo significativo tra le condizioni sperimentali e i risultati vengono visualizzati utilizzando mappe di calore o diagrammi node-edge.

Introduzione

Le interazioni dinamiche proteina-proteina costituiscono le cascate di segnalazione molecolare e le strutture motili che sono la base funzionale della maggior parte della fisiologia cellulare1. Questi processi sono spesso raffigurati come percorsi di segnalazione lineare che passano tra stati costanti basati su singoli input, ma i dati sperimentali e di modellazione mostrano chiaramente che funzionano come reti integrate2,3, 4.Nel caso delle proteine G, recettori diversi hanno spesso la capacità di attivare la stessa proteina G, e un singolo recettore può anche attivare più di un tipo di proteina G5,6. Affinché il numero relativamente ridotto di classi di proteine G modifichi specificamente una vasta gamma di funzioni cellulari come la trasmissione sinaptica, la regolazione ormonale e la migrazione cellulare, le cellule devono integrare e differenziare questi segnali4 , 5. Le prove hanno dimostrato che questa specificità del segnale, sia per le proteine G che per altre, è derivata principalmente sulla base di interazioni proteina-proteina finemente sintonizzate e della loro dinamica temporale1,3, 4 DEL psu' , 5 Del numero 3( , 6 È possibile: , 7. Poiché le reti di segnalazione sono costituite da complessi proteici dinamici con più ingressi, uscite e cicli di feedback, una singola perturbazione ha l'opportunità di modificare l'equilibrio omeostatico complessivo della fisiologia di una cellula4 ,7. È ormai ampiamente convenuto che la segnalazione dovrebbe essere esaminata da una prospettiva di rete al fine di comprendere meglio come l'integrazione di più ingressi controlla le funzioni cellulari discrete in salute e malattia7,8, 9,10,11,12,13. Alla luce di ciò, Quantitative Multiplex Immunoprecipitazionation (QMI) è stato sviluppato per raccogliere dati quantitativi di media velocità media sulle dimensioni sui cambiamenti di piegatura nelle reti di interazione dinamica delle proteine.

QMI è un saggio basato su anticorpi in cui il lisa cellulare è incubato con un pannello di anticorpi di immunoprecipitazioni che sono covalentmente accoppiati a perline magnetiche contenenti rapporti distinti di coloranti fluorescenti. Avere anticorpi specifici accoppiati a classi di perline magnetiche distinte consente la co-immunoprecipitazioni simultanea di più proteine bersaglio dallo stesso lisato. Dopo l'immunoprecipitazioni (IP), le perle magnetiche vengono incubate con un secondo anticorpo sonda coniugato a fluoroforo (o anticorpo biotinyato in combinazione con streptavidina coniugata a fluoroforo). Le co-associazioni tra le proteine riconosciute da ogni coppia di anticorpi anticorpi IP, o PiSCES (proteine in complessi condivisi rilevati da epitopes di superficie esposta), vengono poi rilevate dalla citometria di flusso e possono essere confrontate quantitativamente tra diversi condizioni del campione14. Le illustrazioni nella Figura 1 mostrano i passaggi coinvolti nell'esecuzione di un test QMI, incluso un diagramma di perline magnetiche con complessi proteici immunoprecipitati etichettati da anticorpi della sonda coniugati fluorescentmente (Figura 1C).

La sensibilità del QMI dipende dalla concentrazione proteica del lisato rispetto al numero di perline magnetiche utilizzate per l'immunoprecipitazioni e il raggiungimento di una risoluzione per rilevare i cambiamenti del 10% richiede solo una piccola quantità di materiale iniziale rispetto ad altri metodi di co-IP14,15. Ad esempio, la quantità di materiale di partenza utilizzato in QMI è simile a quella richiesta per un sandwich Enzima-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA), ma vengono rilevate più interazioni in un singolo test QMI. I saggi QMI utilizzando 20 IP e 20 obiettivi di sonda sono stati eseguiti utilizzando 1-5 x 105 cellule T primarie isolate da una biopsia cutanea di 4 mm, preparazioni sinaptosomiche P2 da una sezione coronale da 3 mm della corteccia prefrontale del topo, o 3 x 106 cellule primarie di topo coltivate neuroni corticali14,16,17. Questa sensibilità rende QMI utile per l'analisi di cellule o tessuti con disponibilità limitata, come campioni clinici.

QMI può essere adattato per qualsiasi rete di interazione proteica definita in precedenza (a condizione che siano disponibili anticorpi), e ad oggi è stato sviluppato per analizzare il signaloso del recettore dell'antigene della cellula T (TCR) e un sottoinsieme di proteine nelle sinapsi glutamatergiche nei neuroni 17 mi lato , 18.Negli studi sulla segnalazione del recettore delle cellule T, QMI è stato utilizzato per identificare i cambiamenti indotti dalla stimolazione in PiSCES, e poi per distinguere i pazienti autoimmuni da un gruppo di controllo, rilevare la segnalazione autoimmune endogena e infine per generare un l'ipotesi che coinvolga una sottorete di interazioni associata alla malattia sbilanciata14. Più recentemente, lo stesso pannello QMI è stato utilizzato per determinare che la selezione dei timociti è determinata da differenze quantitative piuttosto che qualitative nella segnalazione proteica associata al TCR19. Nei neuroni, QMI è stato utilizzato per descrivere il riarrangiamento specifico dell'input di una rete di interazione proteica per tipi distinti di segnali di ingresso in un modo che supporta i nuovi modelli emergenti di plasticità sinaptica17. Inoltre, questo pannello sinaptico QMI è stato utilizzato per identificare le differenze in sette modelli murini di autismo, raggruppare i modelli in sottogruppi in base alle loro biofirme PiSCES e ipotizzare con precisione un deficit molecolare condiviso che in precedenza non era riconosciuto in uno dei modelli16. Un approccio simile potrebbe essere utilizzato per controllare altri sottogruppi che potrebbero rispondere a diversi trattamenti farmacologici o assegnare farmaci a specifici sottogruppi reattivi. QMI ha potenziali applicazioni nella diagnostica, sotto-tipizzazione dei pazienti e sviluppo di farmaci, oltre alla scienza di base.

Per assemblare un pannello anticorpo QMI, lo screening iniziale degli anticorpi e i protocolli di selezione sono descritti nella Sezione 1, di seguito. Una volta identificati i pannelli anticorpi, i protocolli per la coniugazione degli anticorpi selezionati alle perline magnetiche per ip e per la biotinylazione degli anticorpi della sonda selezionati sono descritti nella sezione 2. Il protocollo per l'esecuzione del saggio QMI sulle lisature di cellule o tessuti è descritto nella Sezione 3. Infine, poiché un singolo esperimento può generare 5 x 105 punti dati individuali, istruzioni e codici informatici per facilitare l'elaborazione, l'analisi e la visualizzazione dei dati sono forniti nella Sezione 4. Una panoramica del flusso di lavoro descritto nelle sezioni 2-4 è illustrata nella Figura 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

1. Progettazione del saggio

  1. Preparazione anticorpale candidato
    1. Per ogni proteina di interesse, scegliere da 3 a 5 anticorpi da vagliare. Quando possibile, utilizzare anticorpi monoclonali che riconoscono epitopi diversi. Includere anche un anticorpo di controllo non specifico.
    2. Per rimuovere Tris, eseguire lo scambio di buffer aggiungendo l'anticorpo a un filtro di spin da 30 kDa, girando fino al suo volume minimo, aggiungendo 500 L di salina con buffer fosfato (PBS) e ripetendo 3 volte. Per rimuovere le proteine portatrici, eseguire la purificazione degli anticorpi in base al protocollo del produttore (vedere Tabella dei materiali per una raccomandazione di purificazione specifica).
      NOTA: Questo viene fatto perché le proteine portanti e le riserve con gruppi di ammine liberi (come Tris) reagiranno con i gruppi COOH e placheranno le successive reazioni di accoppiamento e biotinylazione. Assicurarsi che tutti gli anticorpi siano purificati (senza proteine portanti) e in un tampone privo di ammine primarie (cioè, senza Tris).
    3. Coppia ogni anticorpo al carboxylate modificato lattice (CML) perline come descritto da Davis e Schrum20. Per conservare l'anticorpo, ridurre le reazioni di accoppiamento del tallone fino a 1/5 (cioè 3,6 x 106 perline con 10 anticorpi di 0,2-1 mg/mL).
    4. Stimare il numero di perline utilizzando un emocitometro (in genere 108/ mL) e conservare a 4 gradi centigradi. Perline sono state conservate per oltre un anno e utilizzate con successo nei saggi QMI, ma la durata a scaffale o le date di scadenza non sono state formalmente stabilite. NaN3 nel buffer B/S previene la crescita batterica.
    5. Biotinyilo una parte di ogni anticorpo (vedi sezione 2.2 sotto). Conservare a 4 gradi centigradi.
    6. Confermare l'accoppiamento efficace del tallone CML e il conteggio accurato macchiando 1 x 105 perline con un anticorpo coniugato PE reattivo alla specie in cui l'anticorpo è stato sollevato e la lettura su un citometro di flusso.
    7. Confermare la biotinylazione dell'anticorpo mediante la ciadella del punto utilizzando streptavidin-HRP.
    8. Una volta che il lab ha generato reagenti noti per essere efficaci, utilizzare tali reagenti come controlli positivi nelle reazioni di conferma nei passaggi 1.1.5 e 1.1.6.
  2. Screening degli anticorpi da IP-FCM (immunoprecipitazioni rilevate dalla citometria di flusso)
    1. Decidere un lisato di screening appropriato. Per questo e tutte le altre fasi di screening pre-QMI (qualsiasi cosa inclusa in questa sezione 1: Assay Design), non utilizzare biocampioni con disponibilità limitata. Invece, scegliere un materiale di controllo comparabile come il tessuto di topo wildtype, linee cellulari, o tessuto donatore umano normale che non è una risorsa limitante.
      NOTA: la scelta di un buffer di lisi per questo analisi non è banale e viene discussa nella sezione 1.5: Selezione del detersivo, nonché nel penultimo paragrafo della sezione Discussione. I buffer di lisi standard hanno una base di 150 mM NaCl, 50 mM Tris (pH 7.4), 10 mM di fluoruro di sodio, 2 mM di ortovana, e cocktail inibitori di proteasi e fosfori. Detergents compatibile con QMI includono 1% NP-40, 1% Digitonin, 0.1-1% Triton X-100, e 0.5-1% deoxycholate14,16,17,18,19,21.
    2. Calcolare il volume totale di lisadi da utilizzare per ogni IP, utilizzando 10 gradi L per ogni combinazione IP-probe da vagliare. Se lo screening X sonda anticorpi e l'utilizzo di un controllo IgG, ogni IP userà (X -1) - (10 L) - (1.1 per l'errore di pipettaggio); L'X1 è quello di tenere conto del controllo della sonda IgG richiesto. Ad esempio, in una schermata dell'anticorpo 3x3, ogni IP deve utilizzare 44 ul. Ricordarsi di includere un controllo IP IgG (vedere esempio di configurazione dello screening nella Figura 2).
    3. Calcolare il numero di tallone CML da utilizzare. Se state proiettando gli anticorpi della sonda X, usate [(X-1) - 5 x 104 perline]. Idealmente, 5.000 perline per pozzo si tradurrà in >2,000 perline per ben letto dal citometro di flusso. Ad esempio, in uno schermo di anticorpo 3 x 3, ogni IP dovrebbe utilizzare 20.000 perline, che è di circa 0,66 l di stock di perline cmL preparate dal passo 1.1.3 (le perline devono prima essere quantificate utilizzando un emocitometro per garantire la precisione).
    4. Incubare il volume di lisa dal punto 1.2.2 con il volume di ogni tallone CML da vagliare dal passo 1.2.3, durante la notte a 4 gradi centigradi con rotazione per evitare che le perline si assestano. In genere, eseguire incubazioni nella prima colonna di una piastra PCR 96-well, e tappo con tappi a strisce tubo PCR.
    5. Girare verso il basso perline CML a 3.200 x g per 1 min e rimuovere il lisato da un singolo, rapido sfarfallio della piastra sopra il lavandino. Un piccolo pellet bianco dovrebbe essere visibile nella parte inferiore di ogni bene sia prima che dopo lo sfarfallio.
    6. Risospendere le perline CML in un volume di buffer FlyP a 20 gradi l per ogni coppia perline-sonda; per gli anticorpi della sonda X, l'uso (X-1) ( (20 )L) - (1.1 per l'errore di pipettaggio), simile al passaggio 1.2.2. Per uno schermo 3 x 3, risospendere in 88 : L del buffer FlyP. Buffer FlyP è 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.4, 1% BSA, 0.01% NaN3.
    7. Distribuire ogni IP su (X-1) pozzi di una piastra PCR 96-pozzi, dove X è il numero di anticorpi sonda sottoposti a screening, utilizzando 20 l/po' di acqua. Figura 2 A mostra un esempio di configurazione di screening.
    8. Lavare altre 2 volte utilizzando 200 l di tampone FlyP per pozzo. Girare la piastra come al punto 1.2.5 e far scorrere la piastra per rimuovere il tampone dopo ogni lavaggio. Pellets sarà estremamente piccolo, ma dovrebbe essere visibile dopo ogni lavaggio.
    9. Per ogni anticorpo biotinylato da vagliare, calcolare il volume totale come (Y -1) - 1,1 x 50 L, dove Y è il numero di anticorpi IP sottoposti a screening. Diluire l'anticorpo a una concentrazione di lavoro in questo volume di tampone FlyP, in genere a partire dalla diluizione 1:100 di uno stock di 0,5 mg/mL.
    10. Distribuire ogni anticorpo diluito lungo ogni colonna della piastra 96 pozzo, e assicurarsi che le perline CML sono sospesi.
    11. Incubare a 4 gradi centigradi per 1 h, sia con rotazione che con pipettaggio a intervalli di 15 min per garantire che le perline CML rimangano in sospensione.
    12. Lavare 3x in 200 gradi l di tampone FlyP, per ogni centrifuga di lavaggio e rimuovere il lisato come al punto 1.2.5.
    13. Risospendere tutte le perline CML in 50: L di 1:200 Streptavidin-PE nel buffer FlyP.
    14. Incubare a 4 gradi centigradi al buio per 30 min.
    15. Lavare 3x in 200 gradi l di tampone FlyP, per ogni centrifuga di lavaggio e rimuovere il lisato come al punto 1.2.5.
    16. Risospendere in 200 l di buffer FlyP, quindi eseguire su un citometro di flusso.
  3. Scelta degli anticorpi da includere nel saggio
    1. Gate on size utilizzando FSC-H vs SSC-H ed eliminare i doppietti utilizzando FSC-H vs FSC-A.
    2. Generare istogrammi di intensità di fluorescenza PE e sovrapporre entrambi i controlli IgG (sonda di prova perline IgG, sonda di prova perline-IgG) su coppie testate (Figura 2).
    3. Cercare una coppia perline-probe che dà segnale chiaro sul rumore (Figura 2B). Inoltre, non è ideale usare lo stesso anticorpo sia per tallone che per la sonda. Il riconoscimento differenziale dell'epitopo massimizza le possibilità di osservare le interazioni perché alcuni epitopi possono essere occlusi in alcuni complessi proteici. Se non sono disponibili opzioni accettabili, ripetere lo schermo con anticorpi aggiuntivi.
  4. Conferma della specificità dell'anticorpo
    1. Per garantire la specificità dell'anticorpo per i bersagli previsti, utilizzare un campione di lisa in cui il bersaglio è stato eliminato; ad esempio, un topo knockout o una linea di cellule RNAi. In alternativa, utilizzare il lisato da una linea cellulare bersaglio-negativo in cui la proteina bersaglio è stata espressa artificialmente.
    2. Eseguire IP-FCM come descritto nel passaggio 1.2, modificando per adattarsi all'esperimento.
  5. Selezione Detergent
    1. Poiché i detergenti sono critici negli esperimenti di co-IP, testare empiricamente diverse variazioni per garantire che il saggio abbia la massima probabilità di rilevare i cambiamenti. Per iniziare, scegli un pannello relativamente piccolo di interazioni (4-8) che sono noti per cambiare in una determinata condizione e / o sono di particolare interesse per il tuo studio.
    2. Utilizzando le perle CML non fluorescenti e coniugate con anticorpi realizzati per gli schermi iniziali, eseguire IP-FCM come descritto nel 1.2 utilizzando condizioni di detersivo tampone di lisi varie. Gli schermi detergenti possono essere eseguiti con detersivo come unica variabile o con condizioni cellulari diverse per ogni detergente. Utilizzare sempre i controlli IgG sia per perline che per sonde, poiché i detergenti producono occasionalmente un background inaspettato in alcune combinazioni IP-Probe.
    3. Sulla base delle MFI dello schermo, scegliere un detersivo che ottimizza il segnale per il PiSCES di interesse. È probabile che alcuni compromessi dovranno essere fatti22.

2. Preparazione del reagente Multiplex

  1. Accoppiamento magnetico del tallone
    1. Utilizzando la mappa magnetica della regione del tallone, selezionare le regioni di perline da utilizzare in un modello che riduce al minimo il rischio di rilevamento incrociato. Perline magnetiche in genere spalmare verso l'alto e verso destra, in modo da evitare regioni di perline che sono diagonalmente adiacenti. Perline da ogni altra colonna del diagramma di perline mostrato sul sito Luminex sono raccomandati (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/).
    2. Preparare l'anticorpo senza supporto a 0,1 mg/mL in PBS (come in 1.1.2) in 250 .L. Mantenere il ghiaccio per un uso successivo.
    3. Le perle magnetiche vortiche si estensivamente, e poi 250 -L in un tubo di microcentrifuga d'ambra (per proteggere le aliquote delle perline dal fotosbiancamento).
    4. Separare magneticamente perline magnetiche per 60 s e rimuovere il supernatante.
    5. Aggiungere 250 l di buffer MES (50 mM MES pH 6,0, 1 mM EDTA), vortice, separare magneticamente per 60 s e rimuovere il supernatante. Ripetere e risospendere le perline magnetiche in 200 gradi di buffer MES.
    6. Aggiungere 40 -L di MES a un tubo monouso da 2 mg di Sulfo-NHS per fare uno stock di 50 mg/mL.
    7. Aggiungere 25 l di Sulfo-NHS appena fatto alle perline magnetiche . Vortice.
    8. Aggiungere 25 ll di 50 mg/mL di edagito [1-ethyl-3-(-3-dimethylaminopropyl) idrocloruro di carbodiimide, chiamato anche EDC] nel buffer MES. Vortice.
    9. Coprire e agitare su un vortice con un attacco tubo-holding per 20 min a temperatura ambiente, 1000 rpm.
    10. Separare magneticamente per 60 s e rimuovere il super-natante.
    11. Risospendere in 500 - L di PBS, vortice, separare magneticamente per 60 s e rimuovere il supernatante. ripetere.
    12. Risospendere in 250 - L di soluzione anticorpale dal punto 2.1.2. Vortice.
    13. Incubare 2 h a temperatura ambiente con agitazione su un vortice a 1000 rpm.
    14. Aggiungete 500 l di PBS alle perline magnetiche, vortice, separate magneticamente per 60 s, e rimuovete il supernatante.
    15. Aggiungere 750 buffer di blocco/archiviazione (B/S) (1% BSA in PBS pH 7.4, 0,01% NaN3). Coprire e incubare 30 min in camera temp, 1000 rpm.
    16. Separare magneticamente per 60 s e rimuovere il super-natante. Risospendere in 100 l di buffer B/S.
    17. Conservare a 4 gradi centigradi. Perline sono state conservate per oltre un anno e utilizzate con successo nei saggi QMI, ma la durata a scaffale o le date di scadenza non sono state formalmente stabilite. NaN3 nel buffer B/S dovrebbe prevenire la crescita batterica.
    18. Convalidare l'accoppiamento magnetico delle perline macchiando 0,25 dollari di perline magnetiche accoppiate con una specie anti-ospite fluorescente secondaria e la lettura su un citometro a flusso, come nel passaggio 1.1.5.
  2. Biotinylazione
    1. Assicurarsi che gli anticorpi siano in PBS senza proteine portanti.
    2. Calcolare il totale dell'anticorpo da biotinylated (100-200 g consigliato per l'uso in multiplex, 25-50 g consigliato per lo screening).
    3. Preparare fresco 10 mM sulfo-NHS-biotina (può essere fatto con l'aggiunta di 224 - L di ddH2O a un tubo di peso 1 mg).
    4. Aggiungete 1 ll di 10 m di sulfo-NHS-biotina per 25 g di anticorpi, vortice o pipetta su e giù per mescolare.
    5. Incubare in camera temp per 1 h.
    6. Incubare a 4 gradi centigradi per 1 ora.
    7. Utilizzare un filtro di rotazione 30 kDa per rimuovere la biotina non associata e fermare la reazione. Aggiungere 500 l di PBS e ruotare la colonna fino a raggiungere il volume minimo. Aggiungere 500 l di PBS aggiuntivo e ripetere l'operazione per 3 scambi di buffer totali.
    8. Stimare la concentrazione misurando l'assorbimento di 1-2 -L su uno spettrofotometro, quindi portare la concentrazione di anticorpi a 0,5 mg/mL.
    9. Conservare a 4 gradi centigradi.

3. Immunoprecipitazioni multiplex quantitative

  1. Layout piastra
    NOTA: Questo test funziona meglio se eseguito utilizzando piastre di 96 pozzi e 2-4 condizioni di campionamento.
    1. Eseguire sempre controlli appropriati (cioè cellule stimolate v. cellule non stimolate) sulla stessa piastra al fine di rilevare i cambiamenti tra le condizioni. Distribuire ogni campione orizzontalmente sulla piastra e utilizzare ogni colonna per un anticorpo sonda diverso. Un set di repliche tecniche per ogni probe deve essere eseguito immediatamente dopo il primo set. Vedere Figura 3 per un esempio.
    2. Documentare attentamente il layout della piastra per facilitare il caricamento e l'analisi accurate della piastra.
  2. Preparazione del campione e immunoprecipitazioni (giorno 1)
    1. Tessuto di linse o cellule in detergente appropriato con inibitori di proteasi e fosforate e incubare sul ghiaccio per 15 min. Fare attenzione a mantenere il lisato freddo in ogni momento.
      NOTA: L'esatta quantità di indicazione della concentrazione di proteine biomateriali e lisate deve essere determinata empiricamente, e alcuni esempi di campioni utilizzati in precedenza sono elencati nel terzo paragrafo dell'introduzione. In generale, nell'intervallo di 200 :L di 2 mg/mL di proteine per campione ha avuto successo in passato per 20 IP e 20 obiettivi della sonda, ma gli input ideali per ogni pannello di anticorpi e tipo di cellule o tessuti devono essere determinati empiricamente.
    2. Ruotare verso il basso a 4 gradi centigradi per 15 min a 16.000 x g per rimuovere le membrane e i detriti; mantenere supernatante come lisato.
    3. Eseguire un saggio BCA o simile per determinare le concentrazioni di proteine, e quindi normalizzare la concentrazione proteica tra i campioni. Se si utilizzano le celle, iniziare con un numero uguale di celle per condizione e la normalizzazione è facoltativa.
    4. Preparare un master mix di perline magnetiche che contiene 250 perline magnetiche di ogni classe per bene nel saggio. Regolare i numeri di perline dopo l'analisi dei dati in modo che in futuro i saggi una media di 110 perline di ogni classe saranno lette per bene.
      NOTA: Calcolo di esempio: (Nuovo volume di perline) : [(Media di esecuzione) / 110] - (volume di tallone precedente). I volumi di perline devono essere regolati in questo modo circa ogni 8 piste o in base alle esigenze. Tipicamente, 3-4 L di ogni perline magnetico (preparato come sopra) vengono utilizzati per un esperimento a 2 piastre.
    5. Lavare il mix di perline magnetico 2x nel buffer FlyP con la separazione magnetica, quindi risospendere nel buffer FlyP. Per la sospensione, utilizzare 10 L per campione per piastra. Buffer FlyP è 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.4, 1% BSA, 0.01% NaN3.
    6. Dopo aver vortice a fondo il mix magnetico di perline, 10 l'aliquota in tubi di microcentrifuga ghiacciati (un tubo per campione). Aggiungere volumi uguali di lisatura (con concentrazioni normalizzate) ad ogni tubo per l'immunoprecipitazioni.
    7. Aliquota la miscela di perline lisate-magnetico in un tubo per ogni piastra in esecuzione; ad esempio per un esperimento a 2 piastre, dividere il lisato in due tubi. Posizionare i tubi su un rotatore a 4 gradi centigradi per l'immunoprecipitazioni, coperti per tenere fuori la luce.
  3. Esecuzione del saggio (Giorno 2)
    1. Iniziare con i tubi di perla lisa-magnetica per piastra #1. Utilizzare un rack di perline magnetico per rimuovere il lisa dalle perline magnetiche e riservare illisa per analisi future. Lavare perline 2x in 500 - L di ghiaccio freddo Lavatore FlyP. Tenere i tubi tubi sempre sul ghiaccio o a 4 gradi centigradi.
    2. Calcolare il volume di sospensione come (numero di sonde) - (2 repliche tecniche) - (25 l per pozzo) - (1.1 per errore pipettaggio). Risospendere gli IP nel volume calcolato del buffer FlyP ghiacciato.
    3. Dopo aver accuratamente riacceso le perle magnetiche con un leggero tubo, distribuire 25 l per pozzo su una piastra piatta 96, sul ghiaccio.
    4. In una piastra diversa da 96 pozze, diluire gli anticorpi della sonda biotinylata alla concentrazione di lavoro 2x (la concentrazione di lavoro è in genere 1:100 o 1:200, determinata empiricamente) nel buffer FlyP in modo che il loro ordine corrisponda alle colonne sul layout della piastra (vedere la figura 3 ). Il volume finale degli anticorpi della sonda alla concentrazione di lavoro sarà di 50 gradi l per pozzo, quindi il volume di ogni anticorpo 2x preparato dovrebbe essere (25 xL) (numero di campioni biologici) ( 2 repliche tecniche) ( 1,1 per l'errore di pipettaggio).
    5. Utilizzare una pipetta multicanale per distribuire 25 l'uno di ogni sonda anticorpo di lui nella piastra di analisi magnetica contenente perline.
    6. Agitare su uno shaker piatto orizzontale per mescolare e risospendere le perline magnetiche, quindi incubare a 4 gradi centigradi per 1 h, agitando a 450 rpm al buio.
    7. Lavare 3x con tampone FlyP su una lavatrice a lamina magnetica a 4 gradi centigradi.
    8. Risospendere le perline magnetiche in 50:L di 1:200 Streptavidin-PE.
    9. Agitare per mescolare e risospendere le perline, quindi incubare a 4 gradi centigradi per 30 min, agitando a 450 giri al buio.
    10. Lavare 3x con tampone FlyP su una lavatrice a lamina magnetica a 4 gradi centigradi.
    11. Risospendere in 125 - L di buffer FlyP.
    12. Agitare per 1 min a 900 giri/mm per risospendere completamente le perline.
    13. Eseguire su citometro di flusso refrigerato (vedere diagramma nella figura S1). Utilizzare l'impostazione "obiettivo RP1 elevato" nel software del citometro di flusso e una condizione di arresto di 1.000 perline per regione (superando notevolmente il numero che dovrebbe essere in ogni singolo pozzo per evitare che la macchina si fermi prematuramente) e il volume del campione di 80.
    14. Mettere in pausa la corsa a metà strada e risospendere le perline per evitare l'instacco.
    15. Esportare i file di dati in formato .xml.
    16. Ripetere la procedura per le piastre rimanenti, a partire dal passaggio 3.3.1.

4. Analisi dei dati

NOTA: Il codice ANC è stato progettato per confrontare due condizioni degli esperimenti N e 4, ognuna con 2 repliche tecniche per ogni condizione. Ad esempio, le cellule vengono stimolate quattro volte indipendenti, QMI viene eseguito in quattro giorni diversi sul controllo (non stimolato) e sulle cellule stimolate, con repliche tecniche come sopra, e l'analisi dei dati procede come descritto di seguito.

  1. Adattivo non parametrico con taglio alfa regolabile (ANC)
    1. Aprire MATLAB e impostare Active Directory su una cartella contenente i componenti del programma ANC e i file XML esportati dal cilindro di flusso.
    2. Compilare il file "ANC input" per riflettere i dettagli del progetto sperimentale. Il file di esempio incluso in Supplementary File è stato precompilato per eseguire i dati di esempio, forniti anche.
    3. Eseguire il programma, che scriverà un file CSV in Active Directory. Il file riporta PiSCES significativamente diversi, a un livello di falsi positivi (alfa) di 0,05, tra condizioni di controllo e sperimentale, in tutte e 4 le repliche sperimentali, o almeno 3/4 repliche.
    4. Nota: "Riscontri ANC", che sono definiti come PiSCES con differenze significative in almeno 3 repliche sperimentali, rappresentate come 3/4 /4/4 nel file, per l'utilizzo nel passaggio 4.3.1.
  2. Analisi della rete di correlazione ponderata23 (CNA)
    1. Incolla e trasponi i titoli delle colonne dell'output del file di dati da Matlab terminando con "_MFI. CSV" nella prima riga di un nuovo foglio Excel. Aggiungere le colonne "esperimento" per il numero dell'esperimento e "trattamento", per il trattamento sperimentale o qualsiasi altra variabile da analizzare. Salvare il file come "traits.csv".
    2. Aprire R studio e impostare la directory di lavoro su una cartella contenente il "_MFI. CSV" e "TRAITS. CSV".
    3. Eseguire i comandi R come indicato nel file di comando commentato e i dettagli nelle istruzioni incluse nei file. I moduli WCNA significativamente correlati con ogni tratto sperimentale vengono emessi come file grafico e la correlazione di ogni interazione IPi_ProbeJ con ogni modulo viene emesso come file .csv.
    4. Nota: "Riscontri CNA", che sono definiti come interazioni con l'appartenenza al modulo (MM) > 0,7 e p < 0,05 per l'appartenenza a un modulo identificato come significativamente correlato con la variabile sperimentale di interesse, da utilizzare nel passaggio 4.3.1.
  3. "hits" positivi e visualizzazione
    1. Per ogni interazione nell'elenco "3/4 , 4 , 4 / 4 " nel file di output ANC (dal passaggio 4.1.4), identificare se tale interazione è anche un "hit CNA" controllando il file di output CNA (vedere passo 4.2.6). Creare una nuova colonna che indica se ogni hit ANC è anche un hit CNA.
    2. Calcolare il valore medio di modifica del logdi 2 volte per ogni hit di ANC-CNA calcolando i valori indicati nel foglio di calcolo di output ANC "_Hits.csv" dal passaggio 4.1.3. Convertire i valori in una modifica di piegatura del log2 prima della media. Per le interazioni che erano significative solo in 3/4 repliche, eliminare il valore outlier.
    3. Creare un foglio di calcolo con ogni hit ANC-CNA elencato come un IP in una colonna, un probe nella seconda colonna e il valore di modifica della piega nella terza colonna. Utilizzare questo foglio di calcolo per creare un diagramma perimetrale dei nodi in Cytoscape importando il file come rete.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Screening anticorpale
Figura 2 B mostra i risultati di uno schermo per la proteina Connexin36. La maggior parte delle combinazioni IP_probe non produce alcun segnale sui controlli IgG. IP con l'anticorpo monoclonale 1E5 e sonda con 1E5 o l'anticorpo policlonale 6200 produce uno spostamento verso destra nella distribuzione del tallone rispetto ai controlli IgG. Qui sono stati selezionati IP 1E5 e la sonda 6200poly per evitare l'uso dello stesso anticorpo d...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Il test QMI richiede notevoli investimenti nello sviluppo, nelle attrezzature e nei reagenti dei pannelli anticorpi, ma una volta stabilito il test, si possono raccogliere dati ad alta dimensione osservando le reti di interazione delle proteine mentre rispondono ai controlli sperimentali Stimoli. Tecnicamente, QMI richiede un'attenta pipettatura e tracciamento delle posizioni dei pozzi di campioni e anticorpi. È utile etichettare con attenzione le lastre di analisi, così come un modello dettagliato di posizioni dei poz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Riconoscimenti

Gli autori desiderano riconoscere Tessa Davis per importanti contributi allo sviluppo dei saggi QMI e per gli attuali ed ex membri dei laboratori Smith e Schrum per l'orientamento tecnico e l'input intellettuale. Questo lavoro è stato finanziato dalle sovvenzioni NIMH R01 MH113545 e R00 MH 102244.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well flat bottomed platesBio Rad171025001
96-well PCR platesVWR82006-704
Bioplex 200 System with HTFBio Rad171000205modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash StationBio Rad30034376
BSASigma
CML beadsInvitrogenC37481
EDTASigmaE6758
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo ScientificA39256
MagPlex MicrospheresLuminexMC12xxx-01xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification KitThermo Scientific45206used for antibody purification
MESSigmaM3671
Microplate film, non-sterileUSA Scientific2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2SigmaP5726
Protease inhibitor cocktailSigmaP8340
Sandwich Prep RefrigeratorNorlakeSMP 36 15for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluorideSigma201154
Sodium orthovanadateSigma450243
Streptavidin-PEBioLegend405204
Sulfo NHSThermo ScientificA39269
TrisFisher ScientificBP152

Riferimenti

  1. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  2. Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
  3. Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
  4. Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
  5. Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
  6. Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
  7. Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
  8. Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
  9. Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23(2005).
  10. Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
  11. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807(2010).
  12. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
  13. Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
  14. Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7(2016).
  15. Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science's STKE. 2007 (389), (2007).
  16. Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48(2018).
  17. Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
  18. Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
  19. Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
  20. Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
  21. Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722(2012).
  22. Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
  23. Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559(2008).
  24. Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

BiochimicaNumero 150IP FCMproteomicainterazione con proteinesegnalazioneimmunoprecipitazioniQMI

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati