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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) verwendet Durchflusszytometrie zum empfindlichen Nachweis von Unterschieden in der Häufigkeit gezielter Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei Proben. QMI kann mit einer kleinen Menge an Biomaterial durchgeführt werden, erfordert keine gentechnisch veränderten Tags und kann für jedes zuvor definierte Protein-Interaktionsnetzwerk angepasst werden.

Zusammenfassung

Dynamische Protein-Protein-Wechselwirkungen steuern das zelluläre Verhalten, von der Beweglichkeit über die DNA-Replikation bis hin zur Signaltransduktion. Die Überwachung dynamischer Wechselwirkungen zwischen mehreren Proteinen in einem Protein-Interaktionsnetzwerk ist jedoch technisch schwierig. Hier stellen wir ein Protokoll für quantitative Multiplex-Immunpräzipitation (QMI) vor, das eine quantitative Bewertung von Faltenveränderungen in Protein-Wechselwirkungen auf der Grundlage relativer Fluoreszenzmessungen von Proteinen in Shared Complexes ermöglicht, die von Exposed Oberflächenepitope (PiSCES). In QMI werden Proteinkomplexe aus Zelllysaten auf Mikrosphären immunpräzipiert und dann mit einem markierten Antikörper für ein anderes Protein untersucht, um die Fülle von PiSCES zu quantifizieren. Immunpräzipitationsantikörper werden mit verschiedenen MagBead-Spektralregionen konjugiert, was es einem Durchflusszytometer ermöglicht, mehrere parallele Immunpräzipitationen zu unterscheiden und gleichzeitig die Menge der mit jedem zugeordneten Sondenantikörper zu quantifizieren. QMI erfordert keine genetische Kennzeichnung und kann mit minimalem Biomaterial im Vergleich zu anderen Immunpräzipitationsmethoden durchgeführt werden. QMI kann für jede definierte Gruppe von interagierenden Proteinen angepasst werden und wurde bisher verwendet, um Signalnetzwerke in T-Zellen und neuronalen Glutamatsynapsen zu charakterisieren. Die Ergebnisse haben zu einer neuen Hypothesengenerierung mit potenziellen diagnostischen und therapeutischen Anwendungen geführt. Dieses Protokoll enthält Anweisungen zur Durchführung von QMI, von der ersten Auswahl des Antikörper-Panels bis hin zum Ausführen von Assays und der Analyse von Daten. Die erste Montage eines QMI-Assays umfasst das Screening von Antikörpern zur Erzeugung eines Panels und empirisch die Bestimmung eines geeigneten Lysepuffers. Die anschließende Reagenzpräparation umfasst kovalente Kopplung von Immunpräzipitationsantikörpern an MagBeads und Biotinylatations-Sondenantikörpern, so dass sie durch ein streptavidinkonjugiertes Fluorophor gekennzeichnet werden können. Um den Test durchzuführen, wird Lysat über Nacht mit MagBeads gemischt, und dann werden Perlen geteilt und mit verschiedenen Sondenantikörpern und dann einem Fluorophor-Etikett und durch Durchflusszytometrie gelesen. Zwei statistische Tests werden durchgeführt, um PiSCES zu identifizieren, die sich zwischen den versuchslichen Bedingungen erheblich unterscheiden, und die Ergebnisse werden mithilfe von Heatmaps oder Knotenkantendiagrammen visualisiert.

Einleitung

Dynamische Protein-Protein-Wechselwirkungen bilden die molekularen Signalkaskaden und motilen Strukturen, die die funktionelle Basis der meisten zellulärenPhysiologie1 sind. Diese Prozesse werden oft als lineare Signalwege dargestellt, die zwischen stationären Zuständen auf der Grundlage einzelner Eingänge wechseln, aber experimentelle und modellierungsdaten zeigen deutlich, dass sie als integrierte Netzwerke funktionieren2,3, 4. Im Falle von G-Proteinen haben verschiedene Rezeptoren oft die Fähigkeit, das gleiche G-Protein zu aktivieren, und ein einzelner Rezeptor kann auch mehr als einen Typ von G-Protein5,6aktivieren. Damit die relativ kleine Anzahl von G-Proteinklassen gezielt eine Vielzahl zellulärer Funktionen wie synaptische Übertragung, Hormonregulation und Zellmigration modulieren kann, müssen die Zellen diese Signale integrieren und differenzieren4 , 5. Es hat sich gezeigt, dass diese Signalspezifität sowohl für G-Proteine als auch für andere in erster Linie auf der Grundlage fein abgestimmter Protein-Protein-Wechselwirkungen und ihrer zeitlichen Dynamik abgeleitet wird1,3, 4 , 5 , 6 , 7. Da Signalnetze aus dynamischen Proteinkomplexen mit mehreren Ein-, Ausgängen und Rückkopplungsschleifen bestehen, hat eine einzige Störung die Möglichkeit, das gesamte panostatische Gleichgewicht der Physiologie einer Zelle zu verändern4 ,7. Es besteht inzwischen weitgehend Einigkeit darüber, dass die Signalisierung aus netzwerkischer Sicht untersucht werden sollte, um besser zu verstehen, wie die Integration mehrerer Eingänge diskrete zelluläre Funktionen in Gesundheit und Krankheit steuert7,8, 9,10,11,12,13. Vor diesem Hintergrund wurde quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) entwickelt, um quantitative Daten über Faltenänderungen in dynamischen Proteininteraktionsnetzwerken zu sammeln.

QMI ist ein Antikörper-basierter Assay, bei dem Zelllysat mit einem Panel von Immunpräzipitationsantikörpern inkubiert wird, die kovalent mit magnetischen Perlen gekoppelt sind, die unterschiedliche Verhältnisse von fluoreszierenden Farbstoffen enthalten. Mit spezifischen Antikörpern gekoppelt, um verschiedene magnetische Perlenklassen ermöglicht die gleichzeitige Co-Immunpräzipitation mehrerer Zielproteine aus dem gleichen Lysat. Nach der Immunpräzipitation (IP) werden magnetische Perlen mit einem zweiten, fluorophorkonjugierten Sondenantikörper (oder biotinytem Antikörper in Verbindung mit fluorophorkonjugiertem Streptavidin) inkubiert. Die Koverbindungen zwischen den Proteinen, die von jedem IP-Antikörper-Sonden-Antikörperpaar oder PiSCES (Proteine in gemeinsamen Komplexen, die von exponierten Oberflächenepitopen nachgewiesen werden), werden dann durch Durchflusszytometrie nachgewiesen und können quantitativ zwischen verschiedenen Probenbedingungen14. Abbildungen in Abbildung 1 zeigen die Schritte, die bei der Durchführung eines QMI-Tests erforderlich sind, einschließlich eines Diagramms von magnetischen Perlen mit immunpräzipierten Proteinkomplexen, die durch fluoreszierend konjugierte Sondenantikörper gekennzeichnet sind (Abbildung 1C).

Die Sensitivität von QMI hängt von der Proteinkonzentration des Lysats im Verhältnis zur Anzahl der magnetischen Perlen ab, die für Immunpräzipitation verwendet werden, und die Erreichung einer Auflösung zum Nachweis von 10% Faltenänderungen erfordert im Vergleich zu anderen Co-IP-Methoden14,15. Beispielsweise ist die Menge des in QMI verwendeten Ausgangsmaterials ähnlich wie die Menge, die für einen Sandwich-Enzym-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) erforderlich ist, aber mehrere Wechselwirkungen werden in einem einzigen QMI-Test nachgewiesen. QMI-Assays mit 20 IPs und 20 Sondenzielen wurden mit 1-5 x 105 primären T-Zellen durchgeführt, die aus einer 4 mm Hautbiopsie isoliert wurden, P2-Synaptosomalpräparaten aus einem 3 mm koronalen Abschnitt des präfrontalen Kortex der Maus oder 3 x 106 kultivierte Mausprimär- kortikale Neuronen14,16,17. Diese Empfindlichkeit macht QMI nützlich für die Analyse von Zellen oder Geweben mit begrenzter Verfügbarkeit, wie z. B. klinische Proben.

QMI kann für jedes zuvor definierte Protein-Interaktionsnetzwerk angepasst werden (vorausgesetzt, dass Antikörper verfügbar sind), und wurde bisher entwickelt, um das T-Zell-Antigenrezeptor (TCR)-Signalososom und eine Teilmenge von Proteinen an glutamatergen Synapsen in Neuronen zu analysieren. 17 , 18. In Studien zur T-Zell-Rezeptor-Signalisierung wurde QMI zunächst verwendet, um stimulationsinduzierte Veränderungen in PiSCES zu identifizieren und dann Autoimmunpatienten von einer Kontrollgruppe zu unterscheiden, endogene Autoimmunsignale zu erkennen und schließlich eine Hypothese mit einem unausgewogenen krankheitsassoziierten Subnetz von Wechselwirkungen14. In jüngerer Zeit wurde das gleiche QMI-Panel verwendet, um zu bestimmen, dass die Thymoseexzesse durch quantitative und nicht durch qualitative Unterschiede in der TCR-assoziierten Proteinsignalisierung19bestimmt wird. In Neuronen wurde QMI verwendet, um die eingangsspezifische Neuanordnung eines Protein-Interaktionsnetzwerks für verschiedene Arten von Eingangssignalen in einer Weise zu beschreiben, die neu entstehende Modelle der synaptischen Plastizitätunterstützt 17. Zusätzlich wurde dieses synaptische QMI-Panel verwendet, um Unterschiede in sieben Mausmodellen von Autismus zu identifizieren, die Modelle auf Basis ihrer PiSCES-Biosignaturen in Untergruppen zu bündeln und genau ein gemeinsames molekulares Defizit zu vermuten, das zuvor nicht erkannt wurde. in einem der Modelle16. Ein ähnlicher Ansatz könnte verwendet werden, um andere Untergruppen zu überprüfen, die auf verschiedene medikamentöse Behandlungen reagieren könnten, oder Medikamente bestimmten reaktionsfähigen Untergruppen zuzuweisen. QMI hat neben der Grundlagenforschung auch mögliche Anwendungen in der Diagnostik, der Patienten-Subtypisierung und der Arzneimittelentwicklung.

Um ein QMI-Antikörperpanel zusammenzustellen, werden die ersten Antikörper-Screening- und Selektionsprotokolle in Abschnitt 1 unten beschrieben. Sobald Antikörper-Panels identifiziert sind, werden in Abschnitt 2 Protokolle für die Konjugation der ausgewählten Antikörper zu magnetischen Perlen für IP und zur Biotinylierung der ausgewählten Sondenantikörper beschrieben. Das Protokoll zum Ausführen des QMI-Assays auf Zell- oder Gewebelysaten wird in Abschnitt 3 beschrieben. Da ein einzelnes Experiment 5 x 105 einzelne Datenpunkte generieren kann, werden Anweisungen und Computercodes zur Unterstützung der Datenverarbeitung, -analyse und -visualisierung in Abschnitt 4 bereitgestellt. Eine Übersicht über den in den Abschnitten 2-4 beschriebenen Workflow ist in Abbildung 1dargestellt.

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Protokoll

1. Assay-Design

  1. Kandidaten-Antikörper-Vorbereitung
    1. Wählen Sie für jedes Protein von Interesse 3 bis 5 Antikörper zum Abschirmen aus. Verwenden Sie nach Möglichkeit monoklonale Antikörper, die verschiedene Epitope erkennen. Enthalten auch einen unspezifischen Kontrollantikörper.
    2. Um Tris zu entfernen, führen Sie den Pufferaustausch durch, indem Sie den Antikörper zu einem 30 kDa-Spinfilter hinzufügen, sich auf sein minimales Volumen drehen, 500 l Phosphat-gepufferte Salin (PBS) hinzufügen und 3-mal wiederholen. Um Trägerproteine zu entfernen, führen Sie die Antikörperreinigung gemäß dem Herstellerprotokoll durch (siehe Tabelle der Materialien für spezifische Reinigungsempfehlungen).
      HINWEIS: Dies geschieht, weil Trägerproteine und Puffer mit freien Amingruppen (wie Tris) mit COOH-Gruppen reagieren und die nachfolgenden Perlenkopplungs- und Biotinylierungsreaktionen abschrecken. Stellen Sie sicher, dass alle Antikörper gereinigt werden (keine Trägerproteine) und in einem Puffer frei von primären Aern (d. h. keine Tris).
    3. Koppeln Sie jeden Antikörper an Carboxylat modifizierte Latexperlen (CML) wie von Davis und Schrum20beschrieben. Um den Antikörper zu erhalten, skalieren Sie die Perlenkupplungsreaktionen um bis zu 1/5 (d. h. 3,6 x 106 Perlen mit 10 l 0,2-1 mg/ml Antikörper).
    4. Schätzen Sie die Perlenzahlen mit einem Hämozytometer (in der Regel 108/ml) und lagern Sie sie bei 4 °C. Perlen werden seit über einem Jahr gelagert und erfolgreich in QMI-Assays verwendet, aber Haltbarkeit oder Ablaufdaten wurden nicht offiziell festgelegt. NaN3 im B/S-Puffer verhindert das Bakterienwachstum.
    5. Biotinylat einen Teil jedes Antikörpers (siehe Abschnitt 2.2 unten). Bei 4 °C lagern.
    6. Bestätigen Sie die effektive CML-Perlenkopplung und genaue Zählung, indem Sie 1 x 105 Perlen mit einem PE-konjugierten Antikörper färben, der auf die Art reaktiv ist, bei der der Antikörper angehoben wurde, und auf einem Durchflusszytometer lesen.
    7. Bestätigen Sie die Antikörperbiotinylierung durch Punktblot mit Streptavidin-HRP.
    8. Sobald das Labor Reagenzien erzeugt hat, von denen bekannt ist, dass sie wirksam sind, verwenden Sie diese Reagenzien als positive Kontrollen in Bestätigungsreaktionen in den Schritten 1.1.5 und 1.1.6.
  2. Antikörper-Screening durch IP-FCM (Immunpräzipitation durch Durchflusszytometrie nachgewiesen)
    1. Entscheiden Sie sich für ein geeignetes Screening-Lysat. Verwenden Sie für diesen und alle anderen Vor-QMI-Screening-Schritte (alles, was in diesem Abschnitt 1: Assay Design enthalten ist) keine Biosamples mit begrenzter Verfügbarkeit. Wählen Sie stattdessen ein vergleichbares Kontrollmaterial wie Wildtyp-Mausgewebe, Zelllinien oder normales menschliches Spendergewebe, das keine einschränkende Ressource ist.
      ANMERKUNG: Die Auswahl eines Lysepuffers für diesen Test ist nicht trivial und wird in Abschnitt 1.5: Waschmittelauswahl sowie im vorletzten Absatz des Abschnitts Diskussion erläutert. Standardlysepuffer haben eine Basis von 150 mM NaCl, 50 mM Tris (pH 7.4), 10 mM Natriumfluorid, 2 mM Natriumorthovanadate sowie Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktails. Mit QMI kompatible Waschmittel sind 1% NP-40, 1% Digitonin, 0,1-1% Triton X-100 und 0,5-1% Desoxycholat14,16,17,18,19,21.
    2. Berechnen Sie das Gesamtvolumen des Lysats, das für jede IP-Ip verwendet werden soll, wobei 10 l für jede zu prüfende IP-Sonden-Kombination verwendet werden. Wenn X-Sonden-Antikörper untersucht werden und ein IgG-Steuerelement verwendet wird, verwendet jede IP (X+1) * (10 l) * (1,1 für Pipettierfehler); X+1 ist für die erforderliche IgG-Sondensteuerung zu berücksichtigen. In einem 3x3-Antikörper-Bildschirm sollte beispielsweise jede IP 44 ul verwenden. Denken Sie daran, ein IgG-IP-Steuerelement einzuschließen (siehe Beispiel-Screening-Setup in Abbildung 2).
    3. Berechnen Sie die zu verwendende CML-Perlennummer. Wenn Sie X-Sonden-Antikörper untersuchen, verwenden Sie [(X+1) * 5 x 104 Perlen]. Im Idealfall führen 5.000 Perlen pro Brunnen dazu, dass >2.000 Perlen pro Gut durch das Durchflusszytometer gelesen werden. In einem 3 x 3 Antikörper-Bildschirm sollte z. B. jede IP 20.000 Perlen verwenden, was etwa 0,66 l des vorbereiteten CML-Perlenbestands ab Schritt 1.1.3 entspricht (Perlen sollten zuerst mit einem Hämozytometer quantifiziert werden, um die Genauigkeit zu gewährleisten).
    4. Inkubieren Sie das Lysatvolumen ab Schritt 1.2.2 mit dem Volumen jeder CML-Perle, die ab Schritt 1.2.3 abgeschirmt werden soll, über Nacht bei 4 °C mit Rotation, um zu verhindern, dass sich Perlen absetzen. Führen Sie in der Regel Inkubationen in der ersten Spalte einer 96-Well-PCR-Platte und Kappe mit PCR-Rohrstreifenkappen durch.
    5. CML-Perlen bei 3.200 x g für 1 min abdrehen und Lysat durch ein einzelnes, schnelles Flicken der Platte über das Waschbecken entfernen. Ein winziges weißes Pellet sollte an der Unterseite jedes Brunnens sowohl vor als auch nach dem Flicken sichtbar sein.
    6. CML-Perlen in einem Volumen des FlyP-Puffers auf 20 L für jedes Perlen-Sonden-Paar resuspendieren; für X-Sonden-Antikörper verwenden Sie (X+1) * (20 l) * (1.1 für Pipettierfehler), ähnlich wie Schritt 1.2.2. Für einen 3 x 3-Bildschirm in 88 L FlyP-Puffer resuspendieren. FlyP Puffer ist 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,4, 1% BSA, 0,01% NaN3.
    7. Verteilen Sie jede IP über (X+1) Brunnen einer 96-Well-PCR-Platte, wobei X die Anzahl der untersuchten Prüfkörper der Sonde ist, wobei 20 L/Well verwendet werden. Abbildung 2 A zeigt ein Beispiel-Screening-Setup.
    8. Waschen Sie 2 zusätzliche Male mit 200 L FlyP-Puffer pro Bohrgut. Drehen Sie die Platte wie in Schritt 1.2.5 und flicken Sie die Platte, um den Waschpuffer nach jeder Wäsche zu entfernen. Pellets werden extrem klein sein, sollten aber nach jeder Wäsche sichtbar sein.
    9. Berechnen Sie für jeden zu überprüfenden biotinylierten Antikörper das Gesamtvolumen als (Y+1) * 1,1 * 50 l, wobei Y die Anzahl der zu gesiegelten IP-Antikörper ist. Verdünnung des Antikörpers auf eine Arbeitskonzentration in diesem Volumen des FlyP-Puffers, typischerweise beginnend mit 1:100 Verdünnung eines 0,5 mg/ml-Bestands.
    10. Verteilen Sie jeden verdünnten Antikörper in jeder Spalte der 96-Well-Platte, und stellen Sie sicher, dass CML-Perlen resuspendiert werden.
    11. Bei 4 °C für 1 h inkubieren, entweder mit Drehung oder Pipettierung in 15 min Abständen, um sicherzustellen, dass CML-Perlen in Suspension bleiben.
    12. Waschen Sie 3x in 200 l FlyP Puffer, für jede Waschzentrifuge und entfernen Lysat wie in Schritt 1.2.5.
    13. Setzen Sie alle CML-Perlen in 50 l von 1:200 Streptavidin-PE im FlyP-Puffer aus.
    14. Bei 4 °C im Dunkeln 30 min inkubieren.
    15. Waschen Sie 3x in 200 l FlyP Puffer, für jede Waschzentrifuge und entfernen Lysat wie in Schritt 1.2.5.
    16. Resuspend ieren Sie in 200 L FlyP-Puffer, und führen Sie dann auf einem Durchflusszytometer.
  3. Die Wahl von Antikörpern, die in den Assay aufgenommen werden sollen
    1. Tor auf Größe mit FSC-H gegen SSC-H, und beseitigen Doublets mit FSC-H gegen FSC-A.
    2. Generieren Sie Histogramme der PE-Fluoreszenzintensität und überlagern Sie beide IgG-Steuerungen (IgG-Perlentestsonde, Test-Bead-IgG-Sonde) auf getestete Paare (Abbildung 2).
    3. Suchen Sie nach einem Perlen-Sonden-Paar, das ein klares Signal über Rauschen gibt (Abbildung 2B). Darüber hinaus ist es nicht ideal, den gleichen Antikörper für Perle und Sonde zu verwenden. Die Differential-Epitoperkennung maximiert die Chancen, Wechselwirkungen zu beobachten, da einige Epitope in bestimmten Proteinkomplexen verfliegt sein können. Wenn keine akzeptablen Optionen vorhanden sind, wiederholen Sie den Bildschirm mit zusätzlichen Antikörpern.
  4. Bestätigung der Antikörper-Spezifität
    1. Um die Antikörperspezifität für die beabsichtigten Ziele zu gewährleisten, verwenden Sie eine Lysatprobe, bei der das Ziel ausgeschlagen wurde; z. B. eine Knockout-Maus oder eine RNAi-Zelllinie. Alternativ können Sie Lysat aus einer zielnegativen Zelllinie verwenden, in der das Zielprotein künstlich exprimiert wurde.
    2. Führen Sie IP-FCM wie in Schritt 1.2 beschrieben aus und ändern Sie dies, um dem Experiment zu entsprechen.
  5. Waschmittelauswahl
    1. Da Detergenzien in Co-IP-Experimenten kritisch sind, testen Sie empirisch verschiedene Variationen, um sicherzustellen, dass der Test die maximale Wahrscheinlichkeit hat, Veränderungen zu erkennen. Wählen Sie zunächst ein relativ kleines Panel von Interaktionen (4-8), von denen bekannt ist, dass sie sich in einer bestimmten Bedingung ändern und/oder für Ihre Studie von besonderem Interesse sind.
    2. Mit den nicht fluoreszierenden, antikörperkonjugierten CML-Perlen für Erstbildschirme führen IP-FCM, wie in 1.2 beschrieben, unter Verwendung unterschiedlicher Lysepuffer-Waschmittelbedingungen durch. Waschmittelsiebe können mit Reinigungsmittel als einziger Variable oder mit unterschiedlichen Zellbedingungen für jedes Reinigungsmittel durchgeführt werden. Verwenden Sie immer IgG-Steuerungen für Perlen und Sonden, da Detergenzien gelegentlich in einigen IP-Probe-Kombinationen unerwarteten Hintergrund erzeugen.
    3. Wählen Sie auf der Grundlage der MFIs vom Bildschirm ein Reinigungsmittel, das das Signal für die PiSCES von Interesse optimiert. Es ist wahrscheinlich, dass einige Kompromisse gemacht werden müssen22.

2. Multiplex-Reagenz-Präparat

  1. Magnetische Perlenkupplung
    1. Wählen Sie mithilfe der magnetischen Perlenbereichskarte Perlenregionen aus, die in einem Muster verwendet werden sollen, das das Risiko einer Kreuzerkennung minimiert. Magnetische Perle in der Regel verschmieren nach oben und nach rechts, so vermeiden Sie Perlenbereiche, die diagonal angrenzend sind. Perlen aus jeder anderen Spalte des Perlendiagramms, das auf der Luminex-Website angezeigt wird, werden empfohlen (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/).
    2. Bereiten Sie den trägerfreien Antikörper bei 0,1 mg/ml in PBS (wie in 1.1.2) in 250 l vor. Für die spätere Anwendung auf Eis halten.
    3. Vortex magnetische Perlen ausgiebig, und dann aliquot 250 l in einem Bernstein Mikrozentrifugenrohr (zum Schutz der Perlen vor Photobleichungen).
    4. Magnetisch getrennte Magnetperlen für 60 s und entfernen Sie den Überstand.
    5. Fügen Sie 250 l MES-Puffer (50 mM MES pH 6,0, 1 mM EDTA), Wirbel, magnetisch getrennt für 60 s, und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen und resuspendieren Sie magnetische Perlen in 200 l MES-Puffer.
    6. Fügen Sie 40 l MES zu einem 2 mg Einwegrohr von Sulfo-NHS hinzu, um einen 50 mg/ml-Bestand herzustellen.
    7. Fügen Sie den Magnetperlen 25 L frisch zubereiteten Sulfo-NHS hinzu. wirbel.
    8. Fügen Sie 25 l von 50 mg/ml frisch gelöstem EDAC [1-ethyl-3-(-3-dimethylaminopropyl)-Carbodiimidhydrochlorid, auch EDC genannt] in den MES-Puffer. wirbel.
    9. Bedecken und schütteln Sie an einem Wirbelmiteinem mit einem Rohrhalteaufsatz für 20 min bei Raumtemperatur, 1000 U/min.
    10. Magnetisch für 60 s getrennt und den Überstand entfernen.
    11. In 500 l PBS, Wirbel, magnetisch für 60 s trennen und den Überstand entfernen. wiederholen.
    12. Resuspend in 250 l Antikörperlösung ab Schritt 2.1.2. wirbel.
    13. Inkubieren Sie 2 h im Zimmer Temp mit Schütteln auf einem Wirbel bei 1000 Rpm.
    14. Fügen Sie den magnetischen Perlen 500 l PBS, Wirbel, magnetisch getrennt für 60 s, und entfernen Sie den Überstand.
    15. Fügen Sie 750 L Blockierungs-/Speicherpuffer (B/S) hinzu (1% BSA in PBS pH 7.4, 0.01% NaN3). Abdeckung und inkubieren 30 min bei Raumtemperatur, 1000 Rpm.
    16. Magnetisch für 60 s getrennt und den Überstand entfernen. Resuspend in 100 L B/S Puffer.
    17. Bei 4 °C lagern. Perlen werden seit über einem Jahr gelagert und erfolgreich in QMI-Assays verwendet, aber Haltbarkeit oder Ablaufdaten wurden nicht offiziell festgelegt. NaN3 im B/S-Puffer sollte das Bakterienwachstum verhindern.
    18. Validieren Sie die magnetische Perlenkopplung, indem Sie gekoppelte magnetisch perlen mit einer fluoreszierenden Anti-Wirt-Art verfärben und auf einem Durchflusszytometer lesen, wie in Schritt 1.1.5.
  2. Biotinylierung
    1. Stellen Sie sicher, dass Antikörper in PBS ohne Trägerprotein sind.
    2. Berechnen Sie die Gesamtmenge an zu biotinylierten Antikörpern (100-200 g empfohlen für die Verwendung im Multiplex, 25-50 g für das Screening empfohlen).
    3. Bereiten Sie frisches 10 mM Sulfo-NHS-Biotin vor (kann durch Hinzufügen von 224 l ddH2O zu einem 1 mg No-Weigh-Rohr erfolgen).
    4. Fügen Sie 1 l von 10 mM Sulfo-NHS-Biotin pro 25 g Antikörper, Wirbel oder Pipette nach oben und unten hinzu, um sie zu mischen.
    5. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 h.
    6. Bei 4 °C für 1 h inkubieren.
    7. Verwenden Sie einen 30 kDa Spin-Filter, um ungebundenes Biotin zu entfernen und die Reaktion zu stoppen. Fügen Sie 500 L PBS hinzu und drehen Sie die Spalte, bis das minimale Volumen erreicht ist. Fügen Sie 500 L zusätzliche PBS hinzu und wiederholen Sie dies für 3 Gesamtpufferwechsel.
    8. Schätzen Sie die Konzentration, indem Sie die Absorptionsfähigkeit von 1-2 l auf einem Spektralphotometer messen, und bringen Sie dann die Antikörperkonzentration auf 0,5 mg/ml.
    9. Bei 4 °C lagern.

3. Quantitative Multiplex-Immunpräzipitation

  1. Plattenlayout
    HINWEIS: Dieser Test funktioniert am besten, wenn er mit 96-Well-Platten und 2-4 Probenbedingungen durchgeführt wird.
    1. Führen Sie immer geeignete Kontrollen (d. h. stimulierte v. stimulierte Zellen) auf derselben Platte aus, um Veränderungen zwischen den Bedingungen zu erkennen. Verteilen Sie jede Probe horizontal über die Platte, und verwenden Sie jede Säule für einen anderen Sondenantikörper. Eine Reihe technischer Replikationen für jeden Testpunkt sollte unmittelbar nach dem ersten Satz ausgeführt werden. Siehe Abbildung 3 für ein Beispiel.
    2. Dokumentieren Sie sorgfältig das Plattenlayout, um eine genaue Plattenbeladung und -analyse zu ermöglichen.
  2. Probenvorbereitung & Immunpräzipitation (Tag 1)
    1. LyseGewebe oder Zellen in geeigneten Waschmitteln mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren und 15 min auf Eis brüten. Achten Sie darauf, das Lysat jederzeit kalt zu halten.
      ANMERKUNG: Die genaue Menge der Angabe der Biomaterial- und Lysatproteinkonzentration muss empirisch bestimmt werden, und einige Beispiele für zuvor verwendete Proben sind im dritten Absatz der Einführung aufgeführt. Im Allgemeinen war im Bereich von 200 l von 2 mg/ml Protein pro Probe in der Vergangenheit für 20 IP und 20 Sondenziele erfolgreich, aber ideale Inputs für jedes Antikörperpanel und jeden Zell- oder Gewebetyp müssen empirisch bestimmt werden.
    2. Drehen Sie bei 4 °C für 15 min bei 16.000 x g, um Membranen und Schmutz zu entfernen; als Lysat überstand zu halten.
    3. Führen Sie einen BCA-Assay oder ähnliches durch, um Proteinkonzentrationen zu bestimmen, und normalisieren Sie dann die Proteinkonzentration zwischen den Proben. Wenn Sie Zellen verwenden, beginnen Sie mit einer gleichen Anzahl von Zellen pro Bedingung, und die Normalisierung ist optional.
    4. Bereiten Sie eine magnetische Master-Perlenmischung vor, die im Test 250 magnetische Perlen jeder Klasse pro Brunnen enthält. Passen Sie die Perlenzahlen nach der Datenanalyse so an, dass in zukünftigen Assays durchschnittlich 110 Perlen jeder Klasse pro Brunnen gelesen werden.
      HINWEIS: Beispielberechnung: (Neues Perlenvolumen) = [(Durchschnitt ausführen) / 110] * (vorheriges Perlenvolumen). Perlenvolumina sollten auf diese Weise etwa alle 8 Durchläufe oder nach Bedarf angepasst werden. Typischerweise werden 3-4 l jeder magnetischen Perle (wie oben vorbereitet) für ein 2-Platten-Experiment verwendet.
    5. Waschen Sie die magnetische Perle 2x im FlyP-Puffer mit magnetischer Trennung, und setzen Sie dann im FlyP-Puffer wieder ab. Für die Resuspension 10 l pro Probe pro Platte verwenden. FlyP Puffer ist 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,4, 1% BSA, 0,01% NaN3.
    6. Nach gründlicher Wirbelung der magnetischen Perlenmischung, aliquot 10 l in eiskalte Mikrozentrifugenröhren (ein Rohr pro Probe). Fügen Sie jedem Rohr für Immunpräzipitation gleiche Mengen Ansaugen von Lysat (mit normalisierten Konzentrationen) hinzu.
    7. Aliquot das lysat-magnetische Perlengemisch in einem Rohr für jede Platte, die ausgeführt wird; z.B. für ein 2-Platten-Experiment, teilen Sie das Lysat in zwei Röhren. Legen Sie Die Rohre bei 4 °C über Nacht auf einen Rotator, um immunitititizipiert zu werden, um Licht fernzuhalten.
  3. Ausführen des Assays (Tag 2)
    1. Beginnen Sie mit den lysat-magnetischen Perlenrohren für Platte #1. Verwenden Sie ein magnetisches Perlengestell, um Lysat aus den magnetischen Perlen zu entfernen, und reservieren Sie Lysat für zukünftige Analysen. Waschen Sie Perlen 2x in 500 l eiskalten FlyP-Puffer. Rohre immer auf Eis oder bei 4 °C aufbewahren.
    2. Berechnen Sie das Resuspensionsvolumen als (Anzahl der Sonden) * (2 technische Replikationen) * (25 l pro Bohrstand) * (1,1 für Pipettierfehler). Resuspend IPs in berechnetem Volumen des eiskalten FlyP-Puffers.
    3. Nach gründlicher Aufhebens von Magnetperlen durch sanftes Pipettieren, verteilen Sie 25 L pro Brunnen über eine flache 96-Well-Platte auf Eis.
    4. In einer anderen 96-Well-Platte, verdünnt biotinylierte Sondenantikörper gegen 2x Arbeitskonzentration (Arbeitskonzentration ist in der Regel 1:100 oder 1:200, empirisch bestimmt) in FlyP Puffer, so dass ihre Reihenfolge entspricht den Säulen auf dem Plattenlayout (siehe Abbildung 3 ). Das Endvolumen der Sondenantikörper bei der Arbeitskonzentration beträgt 50 l pro Bohrkörper, so dass das Volumen jedes 2x-Antikörpers (25 l) * (Anzahl biologischer Proben) * (2 technische Replikationen) * (1,1 für Pipettierfehler) betragen sollte.
    5. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 25 l jeder Sonden-Antikörperverdünnung in die magnetische, perlenhaltige Assayplatte zu verteilen.
    6. Schütteln Sie auf einem horizontalen Plattenshaker, um die magnetischen Perlen zu mischen und wieder aufzuhängen, und tauchen Sie dann bei 4 °C für 1 h ein, schütteln Sie bei 450 Umdrehungen pro Minute im Dunkeln.
    7. 3x mit FlyP-Puffer auf einer magnetischen Plattenscheibe bei 4 °C waschen.
    8. Setzen Sie die magnetischen Perlen in 50 l von 1:200 Streptavidin-PE aus.
    9. Schütteln, um Perlen zu mischen und wieder aufzuhängen, und dann bei 4 °C für 30 min inkubieren, schütteln bei 450 Umdrehungen im Dunkeln.
    10. 3x mit FlyP-Puffer auf einer magnetischen Plattenscheibe bei 4 °C waschen.
    11. Resuspend in 125 L FlyP-Puffer.
    12. Schütteln Sie für 1 min bei 900 Rpm, um Perlen gründlich wieder aufzuhängen.
    13. Laufen auf gekühlten Durchflusszytometer (siehe Diagramm in Abbildung S1). Verwenden Sie die Einstellung "hohes RP1-Ziel" in der Durchfluss-Zytometer-Software und eine Stoppbedingung von 1.000 Perlen pro Region (erheblich überschießen die Zahl, die in jedem einzelnen Brunnen sein sollte, um zu verhindern, dass die Maschine vorzeitig anhält) und Probenvolumen von 80 l.
    14. Halten Sie den Lauf auf halbem Weg an und setzen Sie die Perlen wieder aus, um eine Abgewöhnung zu verhindern.
    15. Exportieren Sie Datendateien im .xml-Format.
    16. Wiederholen Sie den Vorgang für die verbleibenden Platten, beginnend mit Schritt 3.3.1.

4. Datenanalyse

HINWEIS: Der ANC-Code wurde entwickelt, um zwei Bedingungen aus N = 4 Experimenten zu vergleichen, die jeweils zwei technische Replikationen für jede Bedingung haben. Zum Beispiel werden Zellen vier unabhängige Zeiten stimuliert, QMI wird an vier verschiedenen Tagen auf Kontrolle (unstimuliert) und stimulierten Zellen ausgeführt, mit technischen Replikationen wie oben, und die Datenanalyse verläuft wie unten beschrieben.

  1. Adaptive nicht-parametrische mit einstellbarem Alpha-Cutoff (ANC)
    1. Öffnen Sie MATLAB, und legen Sie das Aktive Verzeichnis auf einen Ordner fest, der die ANC-Programmkomponenten und die aus dem Durchflusszytometer exportierten XML-Dateien enthält.
    2. Füllen Sie die Datei "ANC-Eingabe" aus, um die Details des experimentellen Entwurfs widerzuspiegeln. Die in Supplementary File enthaltene Beispieldatei wurde vorgefüllt, um die Ebenfalls bereitgestellten Beispieldaten auszuführen.
    3. Führen Sie das Programm aus, das eine CSV-Datei in das Active Directory schreibt. Die Datei meldet PiSCES, die sich bei einem falsch positiven (Alpha)-Niveau von 0,05, zwischen Kontroll- und Versuchsbedingungen, in allen 4 experimentellen Replikationen oder mindestens 3/4 Replikationen erheblich unterscheiden.
    4. Anmerkung 'ANC-Treffer', die als PiSCES mit signifikanten Unterschieden in mindestens 3 experimentellen Replikationen definiert sind, dargestellt als 3/4-4/4 in der Datei, zur Verwendung in Schritt 4.3.1.
  2. Gewichtete Korrelationsnetzwerkanalyse23 (CNA)
    1. Die Spaltentitel der von Matlab ausgegebenen Datendatei mit der Endung "_MFI" transponieren. CSV" in die erste Zeile eines neuen Excel-Blatts. Fügen Sie die Spalten "Experiment" für die Experimentnummer und "Behandlung" für die experimentelle Behandlung oder andere zu analysierende Variablen hinzu. Speichern Sie diese Datei als "traits.csv".
    2. Öffnen Sie R studio, und legen Sie das Arbeitsverzeichnis auf einen Ordner fest, der das "_MFI" enthält. CSV" und "TRAITS. CSV"-Dateien.
    3. Führen Sie die R-Befehle aus, wie in der kommentierten Befehlsdatei angegeben, und führen Sie die in den Anweisungen in den Dateien enthaltenen Anweisungen aus. Die WCNA-Module, die erheblich mit jedem experimentellen Merkmal korreliert sind, werden als Grafikdatei ausgegeben, und die Korrelation jeder Interaktion IPi_ProbeJ mit jedem Modul wird als CSV-Datei ausgegeben.
    4. Hinweis 'CNA-Treffer', die als Interaktionen mit Modulmitgliedschaft (MM) > 0,7 und p < 0,05 für die Mitgliedschaft in einem Modul definiert sind, das als signifikant mit der experimentellen Variablen von Interesse korreliert identifiziert wurde, für die Verwendung in Schritt 4.3.1.
  3. Positive 'Treffer' & Visualisierung
    1. Identifizieren Sie für jede Interaktion in der AnC-Ausgabedatei (ab Schritt 4.1.4) ob diese Interaktion auch ein "CNA-Treffer" ist, indem Sie die CNA-Ausgabedatei überprüfen (siehe Schritt 4.2.6). Erstellen Sie eine neue Spalte, die angibt, ob jeder ANC-Treffer auch ein CNA-Treffer ist.
    2. Berechnen Sie den durchschnittlichen Änderungswert für das Protokoll 2-fache für jeden ANC- CNA-Treffer, indem Sie die in der ANC-Ausgabetabelle "_Hits.csv" angegebenen Werte aus Schritt 4.1.3 mittelisieren. Konvertieren Sie Werte in Protokoll2 Falten änderung vor der Mittelung. Löschen Sie bei Interaktionen, die nur in 3/4 Replikationen signifikant waren, den Ausreißerwert.
    3. Erstellen Sie eine Kalkulationstabelle mit jedem ANC-CNA-Treffer, der als IP in einer Spalte aufgeführt ist, einem Prüfpunkt in der zweiten Spalte und dem Faltenänderungswert in der dritten Spalte. Verwenden Sie diese Kalkulationstabelle, um ein Knotenkantendiagramm in Cytoscape zu erstellen, indem Sie die Datei als Netzwerk importieren.

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Ergebnisse

Antikörper-Screening
Abbildung 2 B zeigt die Ergebnisse eines Bildschirms für das Protein Connexin36. Die meisten IP_probe-Kombinationen erzeugen kein Signal über IgG-Steuerungen. IP mit dem monoklonalen Antikörper 1E5 und Sonde mit entweder 1E5 oder dem polyklonalen Antikörper 6200 erzeugt eine Rechtsverschiebung in der Perlenverteilung im Vergleich zu IgG-Steuerungen. Hier wurden IP 1E5 und Sonde 6200poly ausgewählt, um die Verwendung desselben An...

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Diskussion

Der QMI-Test erfordert erhebliche Investitionen in die Entwicklung von Antikörperplatten, Ausrüstungen und Reagenzien, aber sobald der Assay etabliert ist, kann man hochdimensionale Daten sammeln, die Protein-Interaktionsnetzwerke beobachten, während sie auf experimentell kontrollierte Reize. Technisch gesehen erfordert QMI eine sorgfältige Pipettierung und Verfolgung von Proben- und Antikörperbrunnenstandorten. Die sorgfältige Beschriftung der Assay-Platten ist nützlich, ebenso wie eine detaillierte Vorlage von B...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren möchten Tessa Davis für wichtige Beiträge zur ENTWICKLUNG von QMI-Assay und aktuelle und ehemalige Mitglieder der Smith- und Schrum-Labore für technische Beratung und intellektuellen Input würdigen. Diese Arbeit wurde durch NIMH-Zuschüsse R01 MH113545 und R00 MH 102244 finanziert.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well flat bottomed platesBio Rad171025001
96-well PCR platesVWR82006-704
Bioplex 200 System with HTFBio Rad171000205modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash StationBio Rad30034376
BSASigma
CML beadsInvitrogenC37481
EDTASigmaE6758
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo ScientificA39256
MagPlex MicrospheresLuminexMC12xxx-01xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification KitThermo Scientific45206used for antibody purification
MESSigmaM3671
Microplate film, non-sterileUSA Scientific2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2SigmaP5726
Protease inhibitor cocktailSigmaP8340
Sandwich Prep RefrigeratorNorlakeSMP 36 15for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluorideSigma201154
Sodium orthovanadateSigma450243
Streptavidin-PEBioLegend405204
Sulfo NHSThermo ScientificA39269
TrisFisher ScientificBP152

Referenzen

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