JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Количественный мультиплекс иммунопрецитификации (ЗМИ) использует поток цитометрии для чувствительного обнаружения различий в изобилии целевых белково-белковых взаимодействий между двумя образцами. ЗМИ может быть выполнена с использованием небольшого количества биоматериала, не требует генетически модифицированных тегов, и может быть адаптирована для любой ранее определенной сети взаимодействия белка.

Аннотация

Динамические белково-белковые взаимодействия контролируют клеточное поведение, от подвижности до репликации ДНК и сигнала трансдукции. Однако, мониторинг динамических взаимодействий между несколькими белками в сети взаимодействия белка технически трудно. Здесь мы представляем протокол количественного мультиплексного иммунопрециционного протеина (ЗМИ), который позволяет количественно оценивать изменения складов в белковых взаимодействиях на основе относительных измерений флуоресценции белков в общих комплексах, обнаруженных exposed Поверхностные эпитопы (PiSCES). В ЗМИ белковые комплексы из клеточных лисатов иммунопронифицируются на микросферы, а затем исследуются с помеченным антителом для другого белка, чтобы количественно оставить PiSCES. Иммунопрефференционные антитела спрягаются с различными спектральными областями MagBead, что позволяет цитометро потока дифференцировать несколько параллельных иммунопрециций и одновременно количественно количество антител зонда, связанных с каждым из них. ЗМИ не требует генетической маркировки и может быть выполнена с использованием минимального биоматериала по сравнению с другими методами иммунопреципции. ЗМИ может быть адаптирован атлетировал для любой определенной группы взаимодействующих белков, и до сих пор использовался для характеристики сигнальных сетей в Т-клетках и нейрональных синапсах глутамата. Результаты привели к порождению новых гипотез с потенциальным диагностическим и терапевтическим применением. Этот протокол включает в себя инструкции для выполнения ЗМИ, от первоначального выбора панели антител до беговых анализов и анализа данных. Первоначальная сборка асссея ЗМИ включает скрининговых антител для создания панели и эмпирически определение соответствующего буфера лиза. Последующий препарат реагента включает в себя ковалентно екосочетание иммунопрецитификации антител к MagBeads, и биотинилатации антител зонда, чтобы они могли быть помечены стрептавидин-конъюгированный фторофор. Для запуска асса, lysate смешивается с MagBeads ночь, а затем бисер делятся и инкубируются с различными антителами зонда, а затем флюорофор этикетки, и читать поток цитометрии. Для выявления PiSCES, которые значительно различаются между экспериментальными условиями, проводятся два статистических теста, и результаты визуализироваться с помощью тепловых карт или диаграмм узла.

Введение

Динамические белково-белковые взаимодействия представляют собой молекулярные сигнальные каскады имотил-структуры, которые являются функциональной основой большинства клеточной физиологии 1. Эти процессы часто изображаются как линейные сигнальные пути, которые переключаются между устойчивыми состояниями на основе одного ввода, но экспериментальные и модельные данные ясно показывают, что они функционируют как интегрированные сети2,3, 4. В случае G белков, различные рецепторы часто имеют возможность активировать тот же белок G, и один рецептор может также активировать более одного типа белка G5,6. Для того, чтобы относительно небольшое количество классов белка G специально модулировать широкий спектр клеточных функций, таких как синаптическая передача, гормональная регуляция, и миграция клеток, клетки должны как интегрировать и дифференцировать эти сигналы4 , 5. Доказательства показали, что эта специфичность сигнала, для G белков, а также другие, в первую очередь происходит на основе тонко настроенных белково-белковых взаимодействий и их височной динамики1,3, 4 , 5 , 6 , 7. Поскольку сигнальные сети состоят из динамических белковых комплексов с несколькими входными данными, выходами и циклами обратной связи, одно возмущение имеет возможность изменить общий гомеостатический баланс физиологии клетки4 ,7. В настоящее время широко ели, что сигнализация должна быть рассмотрена с точки зрения сети, с тем чтобы лучше понять, как интеграция нескольких входов контролирует дискретные клеточные функции в области здравоохранения и болезни7,8, 9,10,11,12,13. В свете этого, Количественный мультиплекс иммунопреципсии (ЗМИ) был разработан для сбора средней пропускной связи, количественные данные об изменениях раза в динамических сетей взаимодействия белка.

ЗМИ является антитела основе анализ, в котором клеточный лизат инкубируется с панелью иммунопрецит антител, которые ковалентно связаны с магнитными бусинами, содержащими различные соотношения флуоресцентных красителей. Наличие специфических антител в сочетании с отдельными классами магнитного биса позволяет одновременно со-иммунопрецитировать несколько белков-мишеней из одного и того же лизата. После иммунопреципиции (IP), магнитные бусы инкубируются со вторым, фторофор-конъюгированных антитела зонда (или биотинилаповые антитела в сочетании с фторофором-конъюгированный стрептавидин). Со-ассоциации между белками, распознаемыми каждой антител-зондом IP, или PiSCES (белки в общих комплексах, обнаруженных открытыми поверхностными эпитопами), затем обнаруживаются цитометрией потока и могут быть количественно сопоставлены между различными условия выборки14. Иллюстрации на рисунке 1 показывают шаги, участвующие в запуске анализом ЗМИ, в том числе диаграмму магнитных бусин с иммунопромизированными белковыми комплексами, помеченными флуоресцентно спряженных антителами зонда (рисунок1C).

Чувствительность ЗМИ зависит от концентрации белка лизата относительно количества магнитных бусин, используемых для иммунопрециционности, и достижение разрешения для обнаружения 10% раз изменения требует лишь небольшое количество исходного материала по сравнению с другими методы совместного IP14,15. Например, количество исходного материала, используемого в ЗМИ, аналогично тому, которое требуется для сэндвича Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA), но несколько взаимодействий обнаруживаются в одном анализе ЗМИ. Анализы с использованием 20 IPs и 20 целей зонда были выполнены с использованием 1-5 х 105 первичных Т-клеток, изолированных от биопсии кожи 4 мм, Синаптосомные препараты P2 из 3 мм корональной секции мыши префронтальной коры, или 3 х 106 культивированных мышей первичной корковых нейронов14,16,17. Эта чувствительность делает ЗМИ полезным для анализа клеток или тканей с ограниченной доступностью, таких как клинические образцы.

ЗМИ может быть адаптирована для любой ранее определенной сети взаимодействия белков (при условии, что антитела доступны), и на сегодняшний день была разработана для анализа Т-клеточного рецептора антигена (TCR) сигналосомы и подмножество белков на глутаматергических синапсов в нейронах 17 Лет , 18. В исследованиях Сигнализирующих рецепторов Т-клеток, ЗМИ был впервые использован для выявления вызванных стимуляцией изменений в PiSCES, а затем, чтобы отличить аутоиммунных пациентов от контрольной группы, обнаружить эндогенные аутоиммунные сигнализации, и, наконец, для создания гипотеза, связанная с несбалансированной болезнью, связанной с подсетью взаимодействий14. Совсем недавно, та же панель ЗМИ была использована для определения того, что выбор тимоцита определяется количественными, а не качественными различиями в TCR-ассоциированного белка сигнализации19. В нейронах, ЗМИ был использован для описания входной конкретной перестановки сети взаимодействия белка для различных типов входных сигналов таким образом, который поддерживает вновь возникающих моделей синаптической пластичности17. Кроме того, эта синаптическая панель ЗМИ была использована для выявления различий в семи моделях мыши аутизма, кластера моделей в подгруппы на основе их PiSCES биоподписей, и точно предположить общий молекулярный дефицит, который был ранее непризнанным в одной из моделей16. Аналогичный подход можно было бы использовать для проверки других подгрупп, которые могли бы реагировать на различные методы лечения наркомании, или назначать лекарства конкретным адаптивным подгруппам. В дополнение к фундаментальной науке, помимо фундаментальной науки, у компании «МИ» есть потенциальное применение в области диагностики, субтипирования пациентов и разработки лекарственных средств.

Для того чтобы собрать панель антитела зМИ, начальные протоколы скрининга антител и выбора описаны в разделе 1, ниже. После выявления панелей антител в разделе 2 описаны протоколы спряжения выбранных антител к магнитным бусинам для ИС и биотинилации выбранных антител зонда. Протокол для запуска анализа ЗМИ на лисаты клеток или тканей описан в разделе 3. Наконец, поскольку один эксперимент может генерировать отдельные точки данных в размере 5 х 10 5, в разделе 4 предусмотрены инструкции и компьютерные коды для оказания помощи в обработке данных, анализе и визуализации. Обзор рабочего процесса, описанного в разделах 2-4, показан на рисунке 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Ассаи дизайн

  1. Препарат антитела кандидата
    1. Для каждого интересуемого белка выберите от 3 до 5 антител для проверки. Когда это возможно, используйте моноклональные антитела, которые распознают различные эпитопы. Также включите одно неспецифическое антитело управления.
    2. Чтобы удалить Tris, выполните буферный обмен, добавив антитела к 30 kDa спин-фильтр, спиннинг до минимального объема, добавив 500 злител фосфат-буферных солив (PBS), и повторять 3 раза. Чтобы удалить белки носителя, выполняйте очистку антител в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу Материалов для конкретной рекомендации по очистке).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается потому, что белки и буферы носителей со свободными группами амина (такие как Tris) будут реагировать с группами COOH и утолять последующие реакции соединения бисера и биотиниляции. Убедитесь, что все антитела очищены (без переносимых белков) и в буфере, свободном от первичных аминов (т.е. нет Tris).
    3. Пара каждого антитела к карбоксилат модифицированный латекс (CML) бусы, как описано Дэвис и Шрум20. Для сохранения антител, смазать вниз бисера сцепления реакций до 1/5 (т.е., 3,6 х 106 бусин с 10 л 0,2-1 мг/мл антитела).
    4. Оцените цифры бисины с помощью гемоцитометра (обычно 108/мл) и храните при 4 градусах Цельсия. Бусы хранятся в течение года и успешно используются в анализах ЗМИ, но срок годности или срок годности не были официально установлены. NaN3 в буфере B/S предотвращает рост бактерий.
    5. Биотинилат часть каждого антитела (см. раздел 2.2 ниже). Хранить при 4 градусах по Цельсию.
    6. Подтвердите эффективное соединение шарика CML и точный подсчет путем окрашивания 1 х 105 шариков с PE-конъюгированных антител реактивной к виду, в котором антитела были подняты и чтения на поток цитометра.
    7. Подтвердите биоинфиниляцию антител точечной подоплеки с помощью стрептавидидина-HRP.
    8. После того, как лаборатория создала реагенты, которые, как известно, являются эффективными, используйте эти реагенты в качестве положительного контроля в подтверждение реакции в шагах 1.1.5 и 1.1.6.
  2. Скрининг антител IP-FCM (иммунопрецит, обнаруженный цитометрией потока)
    1. Принять решение о соответствующем скрининговом лизате. Для этого и всех других предварительных этапов скрининга (все, что включено в этот раздел 1: Анализ Дизайн), не используйте биопробы с ограниченной доступностью. Вместо этого выберите сопоставимый контрольный материал, такой как ткань мыши дикого типа, клеточные линии или нормальная донорская ткань человека, которая не является ограничивающим ресурсом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор буфера lysis для этого асссе не тривиальны, и обсуждается в разделе 1.5: Отбор детергента, а также в предпоследнем абзаце раздела Обсуждение. Стандартные буферы лисиса имеют базу 150 мМ NaCl, 50 мм Трис (pH 7.4), 10 мМ фторид натрия, 2 ММ ортованадат, протеазы и ингибиторы фосфатазы коктейли. Детергенты совместимы с ЗМИ включают 1% NP-40, 1% Digitonin, 0,1-1% Тритон X-100, и 0,5-1% дезоксихолита14,16,17,18,19,21.
    2. Рассчитайте общий объем lysate, который будет использоваться для каждого IP, используя 10 Зл для каждой комбинации IP-зонда для проверки. Если скрининг X зонд антител и с помощью одного управления IgG, каждый IP будет использовать (X '1) ( (10 л) (1,1 для трубачной ошибки); Х-1 должен учитывать необходимый контроль зонда IgG. Например, на экране антител 3x3 каждый IP должен использовать 44 ul. Не забудьте включить IP-контроль IgG (см. пример настройки скрининга на рисунке 2).
    3. Рассчитайте номер cML биса, который будет использоваться. Если вы скрининг X зонд антител, используйте (X'1) 5 х 104 бусины. В идеале, 5000 шариков на хорошо приведет к йgt;2,000 шариков на хорошо читается цитометр потока. Например, на экране антител 3 x 3 каждый IP должен использовать 20 000 шариков, что составляет примерно 0,66 л подготовленных запасов шариков CML со ступени 1.1.3 (бусы должны сначала быть количественно с помощью гемоцитометра для обеспечения точности).
    4. Инкубировать объем lysate от шага 1.2.2 с объемом каждого шарика CML, который будет экранирован от шага 1.2.3, на ночь при 4 c с вращением для того чтобы предотвратить шарики от устанавливать. Как правило, выполнять инкубации в первой колонке 96-хорошо ПЦР пластины, и крышка с ПЦР прокладки прокладки.
    5. Спин вниз CML бусы на 3200 х г в течение 1 мин и удалить лизат одним, быстрым щелчком пластины над раковиной. Крошечные белые гранулы должны быть видны в нижней части каждого хорошо как до, так и после щелчка.
    6. Resuspend CML шарики в объеме буфера FlyP, чтобы равняться 20 зл для каждой пары бисера зонда; для антител зонда X, используйте (X'1) ( 20 л) (1,1 для ошибки трубачки), подобно шагу 1.2.2. Для экрана 3 x 3, повторно приостановите в 88 зл. FlyP буфер 100 мМ NaCl, 50 мм Tris рН 7,4, 1% BSA, 0,01% NaN3.
    7. Распределите каждый IP-адрес по скважинам 96-угольной пластины ПЦР, где X является числом проверяемых антител зонда, используя 20 Л/ну. Рисунок 2 На примере настройки скрининга.
    8. Вымойте 2 дополнительных раза, используя 200 л буфера FlyP на скважину. Спин пластины, как в шаге 1.2.5 и Флик пластины для удаления мыть буфера после каждой стирки. Пеллеты будут очень маленькими, но должны быть видны после каждой стирки.
    9. Для каждого биотиниляционного антитела, подаренного, вычислите общий объем как (Y-1) - 1,1 и 50 л, где Y является числом ис.п. антител, скринингуенных. Разбавить антитела к рабочей концентрации в этом объеме буфера FlyP, как правило, начиная с 1:100 разбавления 0,5 мг/мл запасов.
    10. Распределите каждое разбавленное антитела вниз каждый столбец пластины 96 хорошо, и обеспечить CML шарики resuspended.
    11. Инкубировать при 4 градусах по 1 ч, либо с вращением или пайпеткой с интервалом 15 минут, чтобы обеспечить, чтобы CML шарики оставались в подвеске.
    12. Вымойте 3x в 200 л буфера FlyP, для каждой центрифуги стирки и удалить лизат, как в шаге 1.2.5.
    13. Отдохните все шарики CML в 50 л 1:200 Стрептавидин-PE в буфере FlyP.
    14. Инкубировать при 4 градусах по Цельсию в темноте в течение 30 мин.
    15. Вымойте 3x в 200 л буфера FlyP, для каждой центрифуги стирки и удалить лизат, как в шаге 1.2.5.
    16. Повторно едкните в 200 зл буфера FlyP, а затем запустить на поток цитометра.
  3. Выбор антител для включения в ассай
    1. Ворота на размер с помощью FSC-H против SSC-H, и устранить дублеты с помощью FSC-H против FSC-A.
    2. Генерировать гистограммы интенсивности ФЛуоресценции PE и наложения обоих элементов управления IgG (IgG бис-тест зонд, тест бис-IgG зонд) на испытания пар (Рисунок 2).
    3. Ищите бисо-зонд пара, которая дает четкий сигнал над шумом(Рисунок 2B). Кроме того, это не идеально, чтобы использовать те же антитела для биса и зонда. Дифференциальное распознавание эпитопов максимизирует шансы наблюдения за взаимодействиями, поскольку некоторые эпитопы могут быть окклюзии в некоторых белковых комплексах. Если нет приемлемых вариантов, повторите экран с дополнительными антителами.
  4. Подтверждение специфики антител
    1. Для обеспечения специфичности антител для намеченных целей используйте образец лизата, в котором цель была выбита; например, мышь нокаута или линия ячейки РНК. Кроме того, используйте лизат из целевой отрицательной клеточной линии, в которой был искусственно выражен целевой белок.
    2. Выполните IP-FCM, как описано в шаге 1.2, изменяя в соответствии с экспериментом.
  5. Отбор детергента
    1. Поскольку моющие средства имеют решающее значение в экспериментах по совместному IP, эмпирически тестируют различные вариации, чтобы убедиться, что анализ имеет максимальную вероятность обнаружения изменений. Для начала выберите относительно небольшую панель взаимодействий (4-8), которые, как известно, меняются в данном состоянии и/или представляют особый интерес для вашего исследования.
    2. Используя нефлуоресцентные, антитела-конъюгированные cML бусы, сделанные для начальных экранов, выполнять IP-FCM, как описано в 1.2 с использованием разнообразных условий моющего средства буфера лисиса. Экраны детергента могут быть выполнены с моющим средством в качестве единственной переменной, или с различными условиями клеток для каждого моющего средства. Всегда используйте элементы управления IgG как для бисера, так и для зондов, так как моющие средства иногда производят неожиданный фон в некоторых комбинациях IP-зондов.
    3. На основе МФО с экрана, выбрать моющее средство, которое оптимизирует сигнал для PiSCES интереса. Вполне вероятно, что некоторые компромиссы должны быть сделаны22.

2. Подготовка реагента Multiplex

  1. Соединение магнитного биса
    1. Используя карту области магнитного биса, выберите области биса для использования в шаблоне, который сводит к минимуму риск перекрестного обнаружения. Магнитный бис обычно смазать и вправо, так что избегайте биса регионов, которые по диагонали смежных. Рекомендуется бисер из любой другой колонки диаграммы бисера, показанной на веб-сайте Luminex (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/).
    2. Подготовьте антитела без переносчиков на уровне 0,1 мг/мл в PBS (как в 1.1.2) в 250 зЛ. Держите на льду для последующего использования.
    3. Вихрь магнитные бусы широко, а затем aliquot 250 зл в янтарь микроцентрифуг трубки (для защиты бисера от фотоотбелевания).
    4. Магнитно отдельные магнитные бусы на 60 с и удалить супернатант.
    5. Добавьте 250 кл. буфера МЧС (50 мМ ММ MES pH 6.0, 1 mM EDTA), вихрь, магнитно отделяющийся на 60 с, и удалите супернатант. Повторите и повторно магнитные бусы в 200 зл буфера MES.
    6. Добавьте 40 мг МЧС к 2 мг одноразовой трубки Sulfo-NHS, чтобы сделать 50 мг/мл бульона.
    7. Добавьте 25 л свежеприготовленных Sulfo-NHS к магнитным бусинкам. Вихрь.
    8. Добавьте в буфер МЧС 25 л 50 мг/мл свежерастворенного EDAC No1-этил-3-(-3-диметиламинопропил) карбодиимидного гидрохлорида, также называемого EDC. Вихрь.
    9. Накройте крышкой и встряхните на вихре с трубкой-держащей креплением в течение 20 минут при комнатной температуре, 1000 об/мин.
    10. Магнитно отделить на 60 с и удалить супернатант.
    11. Повторно езбитая в 500 Л PBS, вихрь, магнитно отделяется на 60 с и удалите супернатант. Повторите.
    12. Повторное в 250 л раствора антител от шага 2.1.2. Вихрь.
    13. Инкубировать 2 ч при комнате темп с тряской на вихре при 1000 об/мин.
    14. Добавьте 500 л PBS к магнитным бусинкам, вихрю, магнитно отделяем на 60 s, и удалите супернатант.
    15. Добавить 750 qL блокирования / хранения (B / S) буфер (1% BSA в PBS рН 7,4, 0,01% NaN3). Накрыть крышкой и инкубировать 30 мин при температуре в комнате, 1000 об/мин.
    16. Магнитно отделить на 60 с и удалить супернатант. Повторное действие в 100 кл.л буфера B/S.
    17. Хранить при 4 градусах по Цельсию. Бусы хранятся в течение года и успешно используются в анализах ЗМИ, но срок годности или срок годности не были официально установлены. NaN3 в буфере B/S должен предотвратить рост бактерий.
    18. Проверить магнитное соединение шарика путем окрашивания 0,25 л соединенных магнитных бусин оков с флуоресцентными анти-хост видов вторичной и чтения на цитометр потока, как и в шаге 1.1.5.
  2. Биотинилаация
    1. Убедитесь, что антитела находятся в PBS без белка перевозчика.
    2. Рассчитайте общее количество мкг антител, которые будут биоинтиниляции (100-200 мкг рекомендуется для использования в мультиплексе, 25-50 мкг рекомендуется для скрининга).
    3. Приготовьте свежий 10 мМ сульфо-NHS-биотин (можно сделать, добавив 224 л дДГ2O в трубку без взвешивания 1 мг).
    4. Добавьте 1 кЛ 10 мМ сульфо-NHS-биотина на 25 мкг антител, вихря или пипетки вверх и вниз, чтобы смешать.
    5. Инкубировать при температуре номера 1 ч.
    6. Инкубировать при 4 градусах по Цельсию на 1 ч.
    7. Используйте 30 kDa спин-фильтр, чтобы удалить несвязанный биотин и остановить реакцию. Добавьте 500 л PBS и закрутите столбец до тех пор, пока не будет достигнут минимальный объем. Добавьте 500 кл дополнительных PBS и повторите для 3 общих буферных обменов.
    8. Оцените концентрацию путем измерения абсорбции 1-2 л на спектрофотометре, а затем довести концентрацию антител до 0,5 мг/мл.
    9. Хранить при 4 градусах по Цельсию.

3. Количественный мультиплекс иммунопреципсии

  1. Планировка плиты
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ лучше всего работает при выполнении с использованием 96-колодец пластин и 2-4 образцов условий.
    1. Всегда запускайте соответствующие элементы управления (т.е. стимулируемые против нестимулированных клеток) на одной пластине для обнаружения изменений между условиями. Распределите каждый образец горизонтально по пластине и используйте каждый столбец для различных антител зонда. Набор технических повторов для каждого зонда должен быть запущен сразу после первого набора. Нарисунке рисунок 3 можно например.
    2. Тщательно задокументируйте макет пластины, чтобы облегчить точную загрузку пластини и анализ.
  2. Подготовка образцов и иммунопрецит (День 1)
    1. Лисы ткани или клетки в соответствующих моющих средств с протеазой и ингибиторами фосфатазы и инкубировать на льду в течение 15 минут. Позаботьтесь, чтобы держать лизат холодным во все времена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точное количество указаний биоматериала и лизат ной концентрации белка должны быть эмпирически определены, и некоторые примеры ранее использованных образцов перечислены в третьем пункте введения. В целом, в диапазоне 200 кЛ 2 мг/мл белка на образец был успешным в прошлом для 20 IP и 20 целей зонда, но идеальные входы для каждой панели антител и типа клеток или ткани должны быть определены эмпирически.
    2. Спин вниз при 4 градусах по Цельсию в течение 15 мин при 16 000 х г для удаления мембран и мусора; держать супернатант, как lysate.
    3. Выполните BCA анализ или аналогичные для определения концентрации белка, а затем нормализовать концентрацию белка между образцами. При использовании клеток, начните с равного количества клеток на состояние и нормализации является необязательным.
    4. Подготовьте мастер магнитной смеси шарика, который содержит 250 магнитных бусин каждого класса в хорошо в ходе асссе. Отрегулируйте номера шарика после анализа данных так, чтобы в будущем анализы в среднем 110 бусин каждого класса будут читаться в скважине.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пример расчета: (Новый объем биса) Объемы биса должны корректироваться таким образом примерно каждые 8 пробежек или по мере необходимости. Как правило, 3-4 л каждого магнитного биса (подготовленного как указано выше) используются для 2-плитного эксперимента.
    5. Вымойте магнитную смесь биса 2x в буфере FlyP с магнитным разделением, а затем повторно в буфере FlyP. Для повторной приостановки используйте 10 л л на образец на тарелку. FlyP буфер 100 мМ NaCl, 50 мм Tris рН 7,4, 1% BSA, 0,01% NaN3.
    6. После тщательного вихря магнитной смеси бисера, aliquot 10 qL в ледяные микроцентрифугные трубки (одна трубка на образец). Добавьте равные объемы лизата (с нормализованными концентрациями) к каждой трубке для иммунопрецициции.
    7. Aliquot лизатно-магнитной смеси биса в одну трубку для каждой пластины запускаются; например, для 2-плитного эксперимента разделите лизат на две трубки. Поместите трубки на ротатор при температуре 4 градусов цельсия на ночь для иммунопрецицитария, покрытые, чтобы не допустить света.
  3. Запуск асссе (День 2)
    1. Начните с лисат-магнитных трубок биса для плиты #1. Используйте магнитную стойку шарика для удаления лисата из магнитных бусин, и резерва lysate для будущего анализа. Вымойте бисер 2x в 500 л ледяного буфера FlyP. Держите трубки всегда на льду или при 4 градусах Цельсия.
    2. Рассчитайте объем повторной подвески как (количество зондов) ( 2 технических репликации) Resuspend IPs в расчетном объеме ледяного буфера FlyP.
    3. После тщательной повторной приостановки магнитных бусин нежных пипеток, распределить 25 л на хорошо через плоским дном 96 хорошо пластины, на льду.
    4. В другой 96-колодчатой пластине, разбавлять биоинтинилатированные антитела зонда до 2x рабочей концентрации (рабочая концентрация, как правило, 1:100 или 1:200, эмпирически определяется) в буфере FlyP так, что их порядок соответствует столбцов на макет елейной пластины (см. Рисунок Рисунок 3 ). Окончательный объем зондовых антител в рабочей концентрации составит 50 л на скважину, поэтому объем каждого 2x подготовленных антител должен быть (25 кЛ)
    5. Используйте многоканальный пипетку для распределения 25 зл и разбавления антитела каждого зонда в магнитно-содержащую доску.
    6. Встряхните на горизонтальной пластине шейкер, чтобы смешать и resuspend магнитные бусы, а затем инкубировать при 4 c в течение 1 ч, встряхивая при 450 об/мин в темноте.
    7. Вымойте 3x с буфером FlyP на магнитной пластине шайбу при 4 градусах Цельсия.
    8. Приостановите действие магнитных бусин в 50 л от 1:200 Стрептавидидин-ПЭ.
    9. Встряхните, чтобы смешать и resuspend бисер, а затем инкубировать при 4 кв кв в течение 30 минут, встряхивая при 450 об/мин в темноте.
    10. Вымойте 3x с буфером FlyP на магнитной пластине шайбу при 4 градусах Цельсия.
    11. Повторное действие в 125 зл буфера FlyP.
    12. Встряхните в течение 1 мин при 900 об/мин, чтобы тщательно переприопроизнять бусы.
    13. Запуск на цитометре охлажденных потоков (см. диаграмму на рисунке S1). Используйте "высокую цель RP1" настройки в потоке цитометра программного обеспечения, и стоп-условие 1000 бусин в регионе (значительно превышение числа, которое должно быть в любом отдельном колодце, чтобы предотвратить машину от остановки преждевременно) и объем выборки 80 Л.
    14. Приостановить запустить половину пути через и resuspend бусы, чтобы предотвратить урегулирование.
    15. Экспортные файлы данных в формате .xml.
    16. Повторите процесс для остальных пластин, начиная с шага 3.3.1.

4. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Код АНК был разработан для сравнения двух условий из экспериментов N и 4, каждое из которых имеет 2 технических повтора для каждого состояния. Например, клетки стимулируются четыре независимых раза, ЗМИ работает в четыре разных дня на контроль (нестимулированных) и стимулированных клеток, с техническими репликациями, как указано выше, и анализ данных продолжается, как описано ниже.

  1. Адаптивный непараметрический с регулируемым альфа-отсечением (ANC)
    1. Откройте MATLAB и установите активный каталог в папку, содержащую компоненты программы ANC и файлы .xml, экспортированные из цитометра потока.
    2. Заполните файл "ANC ввода", чтобы отразить детали экспериментального дизайна. Пример файла, включенного в дополнительный файл, был предварительно заполнен для запуска также предоставленных данных примера.
    3. Запустите программу, которая напишет файл .csv в активный каталог. Файл сообщает PiSCES, которые значительно отличаются, на ложноположительном (альфа) уровне 0,05, между контрольными и экспериментальными условиями, во всех 4 экспериментальных репликациях, или по крайней мере 3/4 репликации.
    4. Обратите внимание на "ANC хитов", которые определяются как PiSCES со значительными различиями, по крайней мере 3 экспериментальных реплик, представленных как 3 /4 '4'4 в файле, для использования в шаге 4.3.1.
  2. Анализ взвешенной корреляции сети23 (CNA)
    1. Вставьте-переносите заголовки столбцов вывода файла данных Matlab, заканчивающиеся в "МФИ. CSV" в первый ряд нового листа Excel. Добавьте столбцы "эксперимент" для числа экспериментов и "лечение", для экспериментального лечения или любых других переменных, которые должны быть проанализированы. Сохранить этот файл как "traits.csv".
    2. Откройте студию R и установите рабочий каталог в папку, содержащую «МФТИ. CSV" и "TRAITS. CSV" файлы.
    3. Выполнить команды R, как указано в прокомментированный файл команды и подробно в инструкции, включенные в файлы. Модули WCNA, значительно коррелированные с каждой экспериментальной чертой, выходят как графический файл, и корреляция каждого взаимодействия IPi'ProbeJ с каждым модулем выводится как файл .csv.
    4. Обратите внимание, "CNA хитов", которые определяются как взаимодействия с модулем членства (MM) 0,7 и стр lt; 0,05 для членства в модуле, который был определен как значительно коррелирует с экспериментальной переменной интереса, для использования в шаге 4.3.1.
  3. Положительные «хиты» и визуализация
    1. Для каждого взаимодействия в списке "3/4" 4/4 хитов в выходном файле ANC (от шага 4.1.4) определите, является ли это взаимодействие также «ударом CNA» путем проверки выходного файла CNA (см. шаг 4.2.6). Создайте новую колонку, которая указывает, является ли каждый удар ANC также хитом CNA.
    2. Рассчитайте среднее значение изменения2 раза для каждого удара ANC и CNA, усреднев значения, приведенные в таблице вывода ANC "Hits.csv" с шага 4.1.3. Преобразуйте значения для изменения2 раз перед усреднением. Для взаимодействий, которые были значительными только в 3/4 репликации, удалите значение выброса.
    3. Сделайте электронную таблицу с каждым попаданием ANC CNA, указанным в виде IP в одной колонке, зондом во второй колонке и значением изменения складки в третьей колонке. Используйте эту таблицу для создания диаграммы узла края в Cytoscape путем импорта файла в качестве сети.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Скрининг антител
Рисунок 2 B показывает результаты экрана для белка Connexin36. Большинство комбинаций IP-зондов не производят сигнала над элементами управления IgG. IP с моноклональным антителом 1E5 и зондом с 1E5 или поликлональным антителом 6200 производит сдв...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Анализ ЗМИ требует значительных инвестиций в разработку антител панели, оборудование и реагенты, но как только анализ установлен, можно собирать высокомерные данные наблюдения белковых сетей взаимодействия, как они реагируют на экспериментально контролируемых Стимулы. Технически, З?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.

Благодарности

Авторы хотели бы отметить Тесса Дэвис за важный вклад в развитие исследования ЗМИ, а также нынешних и бывших членов лабораторий Смита и Шрума за техническое руководство и интеллектуальный вклад. Эта работа финансировалась NIMH гранты R01 MH113545 и R00 MH 102244.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well flat bottomed platesBio Rad171025001
96-well PCR platesVWR82006-704
Bioplex 200 System with HTFBio Rad171000205modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash StationBio Rad30034376
BSASigma
CML beadsInvitrogenC37481
EDTASigmaE6758
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo ScientificA39256
MagPlex MicrospheresLuminexMC12xxx-01xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification KitThermo Scientific45206used for antibody purification
MESSigmaM3671
Microplate film, non-sterileUSA Scientific2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2SigmaP5726
Protease inhibitor cocktailSigmaP8340
Sandwich Prep RefrigeratorNorlakeSMP 36 15for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluorideSigma201154
Sodium orthovanadateSigma450243
Streptavidin-PEBioLegend405204
Sulfo NHSThermo ScientificA39269
TrisFisher ScientificBP152

Ссылки

  1. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  2. Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
  3. Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
  4. Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
  5. Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
  6. Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
  7. Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
  8. Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
  9. Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23(2005).
  10. Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
  11. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807(2010).
  12. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
  13. Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
  14. Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7(2016).
  15. Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science's STKE. 2007 (389), (2007).
  16. Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48(2018).
  17. Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
  18. Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
  19. Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
  20. Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
  21. Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722(2012).
  22. Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
  23. Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559(2008).
  24. Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

150IP FCM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены