JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Kantitatif Multipleks İmmünopantü (QMI), iki örnek arasındaki hedeflenen protein-protein etkileşimlerinin bolluğundaki farklılıkların hassas tespiti için akış sitometrisini kullanır. QMI biyomalzeme küçük bir miktar kullanılarak yapılabilir, genetiği değiştirilmiş etiketleri gerektirmez, ve daha önce tanımlanmış herhangi bir protein etkileşim ağı için adapte edilebilir.

Özet

Dinamik protein-protein etkileşimleri, motiliteden DNA repliğine ve sinyal transdüksiyonuna kadar hücresel davranışı kontrol eder. Ancak, bir protein etkileşim ağında birden fazla protein arasındaki dinamik etkileşimleri izlemek teknik olarak zordur. Burada, Maruz Kalan Proteinlerin göreceli floresan ölçümlerine dayalı olarak protein etkileşimlerinde kat değişimlerinin kantitatif değerlendirmesini sağlayan Kantitatif Multipleks İmmünenyağış (QMI) için bir protokol sayılmiyoruz. Yüzey epitopleri (PiSCES). QMI'de, hücre lisatlarından gelen protein kompleksleri mikrokürelere immünpresipitat edilse ve pisces bolluğunu ölçmek için farklı bir protein için etiketli bir antikor ile incelenir. İmmünenen anatomikler farklı MagBead spektral bölgelere konjuge edilir, bu da bir akış sitometresinin birden fazla paralel immünoprepliti ayırt etmesini ve aynı anda her biriyle ilişkili prob antikor miktarını ölçmesini sağlar. QMI genetik etiketleme gerektirmez ve diğer immünopredipredityöntemleriile karşılaştırıldığında minimal biyomalzeme kullanılarak yapılabilir. QMI, etkileşim eden proteinlerin tanımlanmış herhangi bir grubu için uyarlanabilir ve şimdiye kadar T hücreleri ve nöronal glutamat sinapslarında sinyal ağlarını karakterize etmek için kullanılmıştır. Sonuçlar, potansiyel tanı ve tedavi uygulamaları ile yeni hipotez oluşumuna yol açmıştır. Bu protokol, ilk antikor paneli seçiminden çalışan tahlillere ve analiz verilerine kadar QMI'yi gerçekleştirmek için talimatlar içerir. Bir QMI tahlilinin ilk montajı, bir panel oluşturmak için antikorların taranmasını ve uygun bir lisis tamponunun ampirik olarak belirlenmesini içerir. Sonraki reaktif hazırlığı magbeadlar için kovalent kaplin immünopresian antikorlar içerir, ve bir streptavidin-konjuge florofile etiketlenmiş olabilir böylece biyotinilting prob antikorlar. Tofaş çalıştırmak için, lysate magbeads ile bir gecede karıştırılır, ve sonra boncuk bölünmüş ve farklı prob antikorları ile kuluçka, ve daha sonra bir florofor etiketi, ve akış sitometri tarafından okunur. PiSCES'i deneysel koşullar arasında önemli ölçüde farklılık gösteren iki istatistiksel test yapılır ve sonuçlar ısı haritaları veya düğüm kenarı diyagramları kullanılarak görselleştirilmiştir.

Giriş

Dinamik protein-protein etkileşimleri, çoğu hücresel fizyolojinin fonksiyonel temeli olan moleküler sinyalbasamaklarını ve hareketli yapıları oluşturur 1. Bu süreçler genellikle tek girişlere dayalı sabit durumlar arasında geçiş yapan doğrusal sinyal yolları olarak tasvir edilir, ancak deneysel ve modelleme verileri entegre ağlar olarak işlev ettiklerini açıkça göstermektedir2,3, 4. G proteinleri durumunda, farklı reseptörler genellikle aynı G proteinini aktive etme yeteneğine sahiptir ve tek bir reseptör de birden fazla G proteini türünü aktive edebilir5,6. Göreceli olarak az sayıda g protein sınıfının sinaptik iletim, hormon düzenlemesi ve hücre göçü gibi çok çeşitli hücresel fonksiyonları modüle edebilmesi için, hücrelerin bu sinyalleri hem entegre etmesi hem de farklılaştırmasıgerekir 4 , 5. Kanıtlar göstermiştir ki bu sinyal özgüllüğü, G proteinleri için yanı sıra diğerleri için, öncelikle ince ayarlı protein-protein etkileşimleri ve zamansal dinamikleri1temelinde türetilmiştir1 ,3, 4.2.2 , 5.000 , 6.000 , 7. Sinyal ağları birden fazla giriş, çıkış ve geri besleme döngüleri ile dinamik protein kompleksleri oluşur çünkü, tek bir pertürbasyon bir hücrenin fizyolojisi4 genel homeostatik dengesini değiştirmek için fırsat vardır ,7. Şimdi yaygın olarak sinyalizasyon daha iyi anlamak için bir ağ perspektifinden incelenmesi gerektiğini kabul edilir nasıl birden fazla girdi entegrasyonu sağlık ve hastalık ayrık hücresel fonksiyonları kontrol eder7,8, 9,10,11,12,13. Bunun ışığında, dinamik protein etkileşim ağlarında kıvrım değişiklikleri hakkında orta-iş- ve nicel veriler toplamak için Kantitatif Multipleks İmmünopantüen (QMI) geliştirilmiştir.

QMI, hücre lisatının floresan boyaların farklı oranlarda bulunan manyetik boncuklarla kovalent olarak birleşen immünopresid antikorlarından oluşan bir panel ile kuluçkaya yatırıldığı antikor bazlı bir tahlilidir. Farklı manyetik boncuk sınıfları ile birleşen spesifik antikorların olması, aynı lysate'den birden fazla hedef proteinin eşzamanlı olarak ko-immünoprepitasyon almasına olanak sağlar. İmmünenyağış (IP) sonrasında manyetik boncuklar ikinci bir florofor konjuge prob antikor (veya florofor konjuge streptavidin ile birlikte biyotinylated antikor) ile kuluçkaya yatırılır. Her IP antikor-probu antikor çifti veya PiSCES (maruz kalan yüzey epitoprepleri tarafından saptanan ortak komplekslerde proteinler) tarafından tanınan proteinler arasındaki ortak ilişki, akış sitometrisi tarafından saptanır ve farklı örnek koşulları14. Şekil 1'deki çizimler, flüoresanslı konjuge prob antikorları ile etiketlenmiş immünopsipitated protein kompleksleri ile manyetik boncuk diyagramı da dahil olmak üzere, bir QMI testi nin çalıştırılmasında yer alan adımları göstermektedir (Şekil 1C).

QMI'nin duyarlılığı, immünopresipitasyon için kullanılan manyetik boncuk sayısına göre lysate protein konsantrasyonuna bağlıdır ve %10 kat değişikliklerini tespit etmek için bir çözüm elde etmek, diğer co-IP yöntemleri14,15. Örneğin, QMI'de kullanılan başlangıç materyalinin miktarı sandviç Enzime Bağlı İmmünosorbent Test (ELISA) için gerekli olana benzer, ancak tek bir QMI testinde birden fazla etkileşim algılanır. 4 mm deri biyopsisinden izole edilmiş 1-5 x 105 primer T hücreleri, fare prefrontal korteksin 3 mm koronal bölümünden P2 sinaptozomal preparatlar veya 3 x 106 kültürlü fare primemi kullanılarak 20 IP ve 20 prob hedefi kullanılarak QMI tahlilleri yapılmıştır. kortikal nöronlar14,16,17. Bu duyarlılık QMI'yi klinik numuneler gibi sınırlı kullanılabilirlik teshisi olan hücrelerin veya dokunun analiziiçin yararlı hale getirir.

QMI daha önce tanımlanmış herhangi bir protein etkileşim ağına uyarlanabilir (antikorların mevcut olması koşuluyla) ve bugüne kadar T hücre antijen reseptörü (TCR) sinyalozomve nöronlarda glutamaterjik sinapslarda protein alt kümesini analiz etmek için geliştirilmiştir. 17.000 , 18- T hücre reseptör sinyalizasyonu çalışmalarında, QMI ilk PiSCES stimülasyon kaynaklı değişiklikleri belirlemek için kullanılan ve daha sonra bir kontrol grubundan otoimmün hastaları ayırt etmek için, endojen otoimmün sinyal tespit ve son olarak oluşturmak için etkileşimlerin dengesiz bir hastalık ilişkili alt ağ içeren hipotez14. Daha yakın zamanda, aynı QMI paneli timosit seçimi tcr ilişkili protein sinyal19 nitel farklılıklar yerinenicel tarafından belirlenir belirlemek için kullanılmıştır. Nöronlarda, QMI sinaptik plastisite yeni ortaya çıkan modelleri destekleyen bir şekilde giriş sinyalleri farklı türleri için bir protein etkileşim ağının giriş-özel yeniden düzenlenmesi tanımlamak için kullanılmıştır17. Ayrıca, bu sinaptik QMI paneli otizm yedi fare modeli farklılıkları belirlemek için kullanılmıştır, kendi PiSCES biyoimzadayalı alt gruplar halinde modelleri küme, ve doğru daha önce tanınmamış bir paylaşılan moleküler açık hipotez modellerinden birinde16. Benzer bir yaklaşım, farklı uyuşturucu tedavilerine yanıt verebilecek diğer alt grupları taramak veya belirli duyarlı alt gruplara ilaç atamak için de kullanılabilir. QMI temel bilime ek olarak tanı, hasta alt yazma ve ilaç geliştirme potansiyel uygulamalara sahiptir.

QMI antikor paneli oluşturmak için, ilk antikor taraması ve seçim protokolleri Bölüm 1'de aşağıda açıklanmıştır. Antikor panelleri tanımlandıktan sonra, seçilen antikorların IP için manyetik boncuklara konjugasyonu ve seçilen prob antikorlarının biyotinylasyonu için protokoller Bölüm 2'de açıklanmıştır. Hücre veya doku lysates üzerinde QMI test çalıştırmak için protokol Bölüm 3 açıklanmıştır. Son olarak, tek bir deneme ~ 5 x 105 bireysel veri noktaları, talimatlar ve bilgisayar kodları veri işleme, analiz ve görselleştirme yardımcı üretebilir beri Bölüm 4 sağlanır. Bölüm 2-4'te açıklanan iş akışına genel bir bakış Şekil1'de gösterilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Ataşe tasarımı

  1. Aday antikor hazırlığı
    1. İlgi çekici her protein için, ekrana 3-5 antikor seçin. Mümkün olduğunda, farklı epitopsiyi tanıyan monoklonal antikorlar kullanın. Ayrıca bir non-spesifik kontrol antikor içerir.
    2. Tris'i kaldırmak için, antikor30 kDa spin filtresine ekleyerek, minimum hacmine inerek, 500 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyerek ve 3 kez tekrarlayarak tampon değişimi gerçekleştirin. Taşıyıcı proteinleri çıkarmak için, üreticinin protokolüne göre antikor saflaştırma gerçekleştirin (spesifik arıtma tavsiyesi için Malzeme Tablosu'na bakın).
      NOT: Bu işlem, serbest amin gruplarına sahip taşıyıcı proteinler ve tamponların (Tris gibi) COOH gruplarıyla reaksiyona girerek sonraki boncuk kaplin ve biyotinylasyon reaksiyonlarını söndürmesi nedeniyle yapılır. Tüm antikorların saflaştırıldığından (taşıyıcı protein olmadığından) ve primer aminiçermeyen bir tamponda (yani Tris'siz) olduğundan emin olun.
    3. Davis ve Schrum20tarafından açıklandığı gibi karboksite modifiye lateks (CML) boncuk çift her antikor . Antikorkorumak için boncuk kaplin reaksiyonlarını 1/5'e kadar küçültün (yani, 10 μL 0.2-1 mg/mL antikorlu 3.6 x 106 boncuk).
    4. Hemositometre (genellikle ~108/mL) kullanarak boncuk sayılarını tahmin edin ve 4 °C'de saklayın. Boncuklar bir yılı aşkın bir süredir depolanmış ve QMI tahlillerinde başarıyla kullanılmıştır, ancak raf ömrü veya son kullanma tarihleri resmi olarak belirlenmemıştır. NaN3 B / S tampon bakteri büyümesini önler.
    5. Her antikorbir kısmını biyotinylate (aşağıdaki bölüm 2.2 bakınız). 4 °C'de saklayın.
    6. Etkili CmL boncuk kaplin ve doğru sayma 1 x 105 boncuk bir PE-konjuge antikor reaktif antikor hangi antikor yükseltilmiş ve bir akış sitometre üzerinde okuma ile boyama tarafından onaylayın.
    7. Streptavidin-HRP kullanarak nokta lekesi ile antikor biyotinylasyonu doğrulayın.
    8. Laboratuvar etkili olduğu bilinen reaktifler oluşturduktan sonra, bu reaktifleri 1.1.5 ve 1.1.6 adımlarında onay reaksiyonlarında pozitif kontroller olarak kullanın.
  2. IP-FCM ile antikor taraması (akış sitometrisi ile immünopresiye saptanır)
    1. Uygun bir tarama lysate karar verin. Bu ve diğer tüm qmi öncesi tarama adımları için (bu bölüm 1: Assay Design'da yer alan herhangi bir şey), sınırlı kullanılabilirlik te biyoörnekleri kullanmayın. Bunun yerine, wildtype fare dokusu, hücre hatları veya sınırlayıcı bir kaynak olmayan normal insan donör dokusu gibi karşılaştırılabilir bir kontrol malzemesi seçin.
      NOT: Bu tarak için bir lysis arabelleği seçmek önemsiz değildir ve bölüm 1.5: Deterjan Seçimi'nde ve Tartışma bölümünün sondan bir önceki paragrafında ele alınmıştır. Standart lisis tamponlar 150 mM NaCl, 50 mM Tris (pH 7.4), 10 mM sodyum florür, 2 mM sodyum ortonovaat ve proteaz ve fosfataz inhibitör kokteylleri tabanına sahiptir. QMI ile uyumlu deterjanlar içerir 1% NP-40, 1% Digitonin, 0.1-1% Triton X-100, ve 0.5-1% deoksiol14,16,17,18,19,21.
    2. Taranacak her IP-prob kombinasyonu için 10 μL kullanarak her IP için kullanılacak lysate'nin toplam hacmini hesaplayın. X prob antikorları ve bir IgG kontrolü kullanarak tarama varsa, her IP kullanır (X+1) * (10 μL) * (1.1 pipetleme hatası için); X+1 gerekli IgG prob kontrolü için hesap etmektir. Örneğin, bir 3x3 antikor ekranında, her IP 44 ul kullanmalıdır. IgG IP denetimi eklemeyi unutmayın (Şekil 2'deki örnek tarama kurulumuna bakın).
    3. Kullanılacak CML boncuk numarasını hesaplayın. X prob antikorlarını tarıyorsanız [(X+1) * 5 x 104 boncuk] kullanın. İdeal olarak, iyi başına 5.000 boncuk >2.000 boncuk başına iyi akış sitometre tarafından okunuyor neden olacaktır. Örneğin, 3 x 3 antikor ekranında, her IP 20.000 boncuk kullanmalıdır, bu da 1.1.3 adımdan yaklaşık 0,66 μL hazırlanmış CML boncuk stokudur (boncuklar ilk olarak doğruluğu sağlamak için bir hemositometre kullanılarak ölçülmelidir).
    4. Boncukların yerleşmesini önlemek için 1.2.3 adımdan, gece boyunca 4 °C'de, her BIR CML boncuk hacmi ile 1.2.2'den lysate hacmini inkübe edin. Tipik olarak, 96 kuyulu BIR PCR plakanın ilk sütununda kuluçka işlemleri yapın ve PCR tüp şerit kapakları ile kaplayın.
    5. 1 dk için 3.200 x g cml boncuk aşağı spin ve lavabo üzerinde plaka tek, hızlı flicking tarafından lysate kaldırın. Küçük bir beyaz pelet önce ve flicking sonra her kuyunun altında görünür olmalıdır.
    6. FlyP arabelleği hacmindeki CML boncukları her boncuk-prob çifti için 20°L'ye eşit olacak şekilde yeniden askıya alın; X prob antikorları için, 1.2.2 adımına benzer şekilde (X+1) * (20 μL) * (pipetleme hatası için 1.1) kullanın. 3 x 3 ekran için, FlyP arabelleği 88 μL'de yeniden askıya alın. FlyP tampon 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.4, 1% BSA, 0.01% NaN3.
    7. Her IP'yi 96 kuyulu bir PCR plakanın (X+1) kuyularına dağıtın ve burada X, 20 μL/iyi kullanarak taranmakta olan prob antikorlarının sayısıdır. Şekil 2 A, örnek bir tarama kurulumu gösterir.
    8. Kuyu başına 200 μL FlyP tamponu kullanarak 2 kez daha yıkayın. Adım 1.2.5'teki gibi plakayı döndürün ve her yıkamadan sonra yıkama tamponunu çıkarmak için plakayı hareket ettirin. Peletler son derece küçük olacak, ancak her yıkamadan sonra görünür olmalıdır.
    9. Taranacak her biyotinylated antikor için, (Y+1) * 1.1 * 50 μL, Y'nin taranmakta olan IP antikor sayısı olduğu toplam hacmi hesaplayın. FlyP tamponbu hacminde çalışan bir konsantrasyona karşı antikor seyreltin, genellikle 0,5 mg/mL stok 1:100 seyreltme ile başlayan.
    10. Seyreltilmiş her antikor'u 96 kuyu plakasının her sütununa dağıtın ve CML boncuklarının askıya alınmasından emin olun.
    11. CML boncukların süspansiyonda kalmasını sağlamak için 15 dk aralıklarla dönme veya borulama ile 4 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
    12. Her yıkama santrifüjü için 200 μL FlyP tamponunda 3x yıkayın ve adım 1.2.5'teki gibi lysate'yi çıkarın.
    13. FlyP tamponundaki 1:200 Streptavidin-PE'nin 50 μL'lik tüm CML boncuklarını yeniden askıya alın.
    14. 30 dakika karanlıkta 4 °C'de kuluçka.
    15. Her yıkama santrifüjü için 200 μL FlyP tamponunda 3x yıkayın ve adım 1.2.5'teki gibi lysate'yi çıkarın.
    16. FlyP arabelleği 200 μL'de yeniden askıya alın ve bir akış sitometresi üzerinde çalıştırın.
  3. Tsay'a Dahil Etmek Için Antikorların Seçilmesi
    1. FSC-H vs SSC-H kullanarak boyut kapısı ve FSC-H vs FSC-A kullanarak doublets ortadan kaldırın.
    2. Test edilmiş çiftlerüzerine HEM IgG kontrolleri (IgG boncuk testi probu, test boncuk-IgG probu) hem DE PEfloresan yoğunluğu histogramları oluşturun ve bindirme (Şekil 2).
    3. Gürültü üzerinde net sinyal veren bir boncuk sondası çiftine bakın (Şekil 2B). Ayrıca, boncuk ve prob için aynı antikor kullanmak için ideal değildir. Diferansiyel epitop tanıma etkileşimleri gözlemleme şansını en üst düzeye çıkarır, çünkü bazı epitoplar bazı protein komplekslerinde tıkanmış olabilir. Kabul edilebilir bir seçenek yoksa, ek antikorlarla ekranı tekrarlayın.
  4. Antikor Özgüllüğünün Teyidi
    1. Amaçlanan hedefler için antikor özgüllüğü sağlamak için, hedefin nakavt edildiği lysate numunesi kullanın; örneğin, nakavt faresi veya RNAi hücre satırı. Alternatif olarak, hedef proteinin yapay olarak ifade edildiği hedef-negatif hücre hattından lysate kullanın.
    2. Adım 1.2'de açıklandığı gibi IP-FCM gerçekleştirin ve denemeyi sığdıracak şekilde değiştirin.
  5. Deterjan Seçimi
    1. Deterjanlar co-IP deneylerinde kritik öneme sahip olduğundan, testin değişiklikleri algılama olasılığının maksimum olduğundan emin olmak için farklı varyasyonları ampirik olarak test edin. Başlamak için, belirli bir durumda değiştiği bilinen ve/veya çalışmanızın özellikle ilgilendiği nispeten küçük bir etkileşim paneli (4-8) seçin.
    2. İlk ekranlar için yapılmış floresan olmayan, antikor konjuge CML boncukları kullanarak, çeşitli lisis tampon deterjan koşulları kullanılarak 1.2'de açıklandığı gibi IP-FCM gerçekleştirin. Deterjan perdeleri tek değişken olarak deterjanla veya her deterjan için farklı hücre koşullarıyla yapılabilir. Deterjanlar zaman zaman bazı IP-Probe kombinasyonlarında beklenmeyen arka plan lar ürettiğinden, her zaman hem boncuklar hem de problar için IgG kontrolleri kullanın.
    3. Ekrandaki MFI'lere göre, ilgi çekici PiSCES için sinyali optimize eden bir deterjan seçin. Bazı tavizler22yapılması gerekecektir muhtemeldir .

2. Multipleks reaktif hazırlama

  1. Manyetik boncuk kaplin
    1. Manyetik boncuk bölge haritasını kullanarak, çapraz algılama riskini en aza indiren bir desende kullanmak üzere boncuk bölgelerini seçin. Manyetik boncuk genellikle kadar ve sağa yayma, bu yüzden çapraz bitişik boncuk bölgeleri kaçının. Luminex web sitesinde gösterilen boncuk diyagramının diğer her sütunundan boncuk tavsiye edilir (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/).
    2. 250 μL'de PBS'de 0,1 mg/mL 'de taşıyıcı içermeyen antikor hazırlayın.
    3. Vortex manyetik boncuklar yoğun, ve sonra bir amber mikrosantrifüj tüp içine 250 μL aliquot (photobleaching boncukları korumak için).
    4. Manyetik olarak 60 s için manyetik boncuklar ayırın ve supernatant kaldırın.
    5. 250 μL MES tampon (50 mM MES pH 6.0, 1 mM EDTA), girdap, manyetik olarak 60 s için ayrı ekleyin ve supernatant çıkarın. 200 μL MES tamponunda manyetik boncukları tekrarlayın ve yeniden askıya alın.
    6. 50 mg/mL stok yapmak için 2 mg sulfo-NHS tek kullanımlık tüpe 40 μL MES ekleyin.
    7. Manyetik boncuklar için taze yapılmış Sulfo-NHS 25 μL ekleyin. Girdap.
    8. MES tamponuna 50 mg/mL taze çözünmüş EDAC [1-etil-3-(-3-dimethylaminopropil) karbodiimid hidroklorür, ayrıca EDC olarak da adlandırılır] ekleyin. Girdap.
    9. Kapak ve oda sıcaklığında 20 dakika, 1000 rpm bir tüp tutma eki ile bir girdap üzerinde sallamak.
    10. Manyetik 60 s için ayrı ve supernatant kaldırın.
    11. PBS, girdap, manyetik 60 s için ayrı 500 μL resuspend ve supernatant kaldırın. Tekrar.
    12. 2.1.2 adımdan 250 μL antikor çözeltisinde resuspend. Girdap.
    13. 1000 rpm bir girdap üzerinde sallayarak oda sıcaklığında 2 saat kuluçka.
    14. Manyetik boncuklar, girdap, manyetik 60 s için ayrı 500 μL PBS ekleyin ve supernatant kaldırın.
    15. 750 μL Engelleme/Depolama (B/S) tamponu ekleyin (%PBS pH 7.4'te %1 BSA, %0.01 NaN3). Kapak ve oda sıcaklığında 30 dk kuluçka, 1000 rpm.
    16. Manyetik 60 s için ayrı ve supernatant kaldırın. 100 μL B/S arabelleğinde yeniden askıya alın.
    17. 4 °C'de saklayın. Boncuklar bir yılı aşkın bir süredir depolanmış ve QMI tahlillerinde başarıyla kullanılmıştır, ancak raf ömrü veya son kullanma tarihleri resmi olarak belirlenmemıştır. NaN3 B / S tampon bakteri büyümesini önlemek gerekir.
    18. 1.1.5 adımda olduğu gibi, bir floresan anti-konak türü ikincil ve bir akış sitometre üzerinde okuma ile birleştirilmiş manyetik boncuk ~0,25 μL boyama tarafından manyetik boncuk kaplin doğrulayın.
  2. Biyotinylasyon
    1. Antikorların taşıyıcı protein olmadan PBS'de olduğundan emin olun.
    2. Biyotinylated edilecek antikor toplam μg hesaplayın (100-200 μg multipleks kullanım için önerilen, 25-50 μg tarama için önerilir).
    3. Taze 10 mM sulfo-NHS-biotin hazırlayın (1 mg tartısız tüpe 224 μL ddH2O ekleyerek yapılabilir).
    4. Karıştırmak için 25 g antikor, girdap veya pipet başına 1 μL 10 mM sulfo-NHS-biotin ekleyin.
    5. 1 saat boyunca oda sıcaklığında kuluçka.
    6. 4 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
    7. Bağlanmamış biotinkaldırmak ve reaksiyonu durdurmak için 30 kDa spin filtresi kullanın. 500 μL PBS ekleyin ve minimum ses eulaşınakadar sütunu döndürün. 500 μL ek PBS ekleyin ve toplam 3 arabellek değişimi için tekrarlayın.
    8. Bir spektrofotometrede 1-2 μL'lik emiciliği ölçerek konsantrasyonu tahmin edin ve antikor konsantrasyonu 0,5 mg/mL'ye getirin.
    9. 4 °C'de saklayın.

3. Kantitatif multipleks immünopresidivar

  1. Plaka düzeni
    NOT: Bu test en iyi 96-iyi plakalar ve 2-4 örnek koşulları kullanılarak yapıldığında çalışır.
    1. Koşullar arasındaki değişiklikleri tespit etmek için her zaman uygun kontrolleri (örneğin, uyarılmış v. uyarılmamış hücreler) aynı plaka üzerinde çalıştırın. Her örneği plaka boyunca yatay olarak dağıtın ve her sütunu farklı bir prob antikoriçin kullanın. Her sonda için bir dizi teknik çoğaltma ilk kümeden hemen sonra çalıştırılmalıdır. Örnek olarak Şekil 3'e bakın.
    2. Doğru plaka yüklemesini ve analizini kolaylaştırmak için plaka düzenini dikkatle belgele.
  2. Numune hazırlama ve immünopresipitasyon (Gün 1)
    1. Proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile uygun deterjan doku veya hücreleri lyse ve 15 dakika buz üzerinde kuluçka. Her zaman lysate soğuk tutmaya özen.
      NOT: Biyomalzeme ve lysatprotein konsantrasyonunun tam miktarı ampirik olarak belirlenmeli ve daha önce kullanılan örneklerin bazı örnekleri girişin üçüncü paragrafında listelenmiştir. Genel olarak, numune başına 200 μL 2 mg/mL protein aralığında geçmişte 20 IP ve 20 prob hedefi için başarılı olmuştur, ancak her antikor paneli ve hücre veya doku tipi için ideal girdiler ampirik olarak belirlenmelidir.
    2. Membranları ve döküntüleri temizlemek için 16.000 x g'da 15 dk için 4 °C'de aşağı doğru dön; lysate olarak supernatant tutun.
    3. Protein konsantrasyonlarını belirlemek için BCA Analizi veya benzeri bir işlem yapın ve numuneler arasındaki protein konsantrasyonu normalleştirin. Hücreleri kullanıyorsanız, koşul başına eşit sayıda hücre ile başlayın ve normalleştirme isteğe bağlıdır.
    4. Her sınıf başına ~250 manyetik boncuk içeren bir ana manyetik boncuk karışımı hazırlayın. Veri analizinden sonra boncuk sayılarını ayarlayın, böylece gelecekte her sınıftan ortalama 110 boncuk iyi okunacak.
      NOT: Örnek hesaplama: (Yeni boncuk hacmi) = [(Run Average) / 110] * (önceki boncuk hacmi). Boncuk hacimleri her 8 çalışır veya gerektiği gibi bu şekilde ayarlanmalıdır. Tipik olarak, her manyetik boncuk 3-4 μL (yukarıdaki gibi hazırlanan) 2 plakalı bir deney için kullanılır.
    5. Manyetik boncuk karışımını FlyP tamponunda 2x'i manyetik ayırma ile yıkayın ve flyp tamponunda yeniden askıya alın. Yeniden süspansiyon için, plaka başına numune başına 10 μL kullanın. FlyP tampon 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.4, 1% BSA, 0.01% NaN3.
    6. Manyetik boncuk karışımını iyice girdapladıktan sonra, aliquot 10 μL buz gibi mikrosentrifüge tüplere (numune başına bir tüp) yerleştirin. İmmünenyağış için her tüpe eşit hacimlerde lysate (normalleştirilmiş konsantrasyonlarda) ekleyin.
    7. Aliquot lysate-manyetik boncuk karışımı çalıştırılan her plaka için bir tüp içine; örneğin 2 plakalı bir deney için lysate'yi iki tüpe bölün. İmmünyağış için gece boyunca 4 °C'de bir rotator üzerine tüpler yerleştirin, ışık uzak tutmak için kapalı.
  3. Atanın çalıştırıl (Gün 2)
    1. Plaka #1 için lysate-manyetik boncuk tüpleri ile başlayın. Manyetik boncuklardan lysate'yi çıkarmak için manyetik boncuk rafı kullanın ve ileride analiz için ayırın. 500 μL buz gibi FlyP tamponu içinde boncukları 2x yıkayın. Tüpleri her zaman buzda veya 4 °C'de tutun.
    2. Resuspension hacmini (prob sayısı) * (2 teknik çoğaltma sayısı) * (kuyu başına 25 μL) * (pipetleme hatası için 1,1) olarak hesaplayın. Hesaplanan buz gibi FlyP arabelleği hacminde IP'leri yeniden askıya alın.
    3. Manyetik boncukları nazik pipetleme ile iyice yeniden sulandırdıktan sonra, düz dipli 96 kuyu plakası boyunca her 25°L'yi buz üzerinde dağıtın.
    4. Farklı bir 96 kuyuplakasında, flyp tamponunda biyotinylated prob antikorlarını 2x çalışma konsantrasyonuna (çalışma konsantrasyonu tipik olarak 1:100 veya 1:200 olarak belirlenir) seyrelterek sıraları plaka düzenindeki sütunlara eşleşir (bkz. Şekil 3 ). Çalışma konsantrasyonundaki prob antikorlarının son hacmi kuyu başına 50°L olacaktır, bu nedenle hazırlanan her 2x antikorun hacmi (25 μL) * (biyolojik numune sayısı) * (2 teknik çoğaltma) * (pipetleme hatası için 1,1) olmalıdır.
    5. Manyetik boncuk içeren bir adak plakasına her probuantikor seyreltme 25 μL dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın.
    6. Manyetik boncukları karıştırmak ve yeniden askıya almak için yatay bir plaka çalkalayıcı üzerinde sallayın ve sonra karanlıkta 450 rpm'de titreyerek 4 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
    7. 4 °C'de manyetik plakalı bir çamaşır lı üzerinde FlyP tamponu ile 3x yıkayın.
    8. 1:200 Streptavidin-PE 50 μL manyetik boncuklar resuspend.
    9. Sallamak ve boncukları yeniden askıya alın ve sonra karanlıkta 450 rpm'de sallayarak, 30 dakika boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
    10. 4 °C'de manyetik plakalı bir çamaşır lı üzerinde FlyP tamponu ile 3x yıkayın.
    11. FlyP arabelleği 125 μL'de yeniden askıya alın.
    12. Iyice boncukreaskıya 900 rpm 1 dakika çalkalayın.
    13. Soğutulmuş akış sitometreüzerinde çalıştırın (ŞekilS1'deki diyagrama bakın). Akış sitometre yazılımındaki "yüksek RP1 hedefi" ayarını ve bölge başına 1.000 boncukluk bir durdurma koşulunu (makinenin zamanından önce durmasını önlemek için herhangi bir kuyuda olması gereken sayıyı büyük ölçüde aşarak) ve 80 μL'lik numune hacmini kullanın.
    14. İşi yarı yolda durdurun ve yerleşmeyi önlemek için boncukları askıya alın.
    15. Veri dosyalarını .xml biçiminde dışa aktarın.
    16. 3.3.1 adımdan başlayarak kalan plakalar için işlemi tekrarlayın.

4. Veri analizi

NOT: ANC kodu, her biri her koşul için 2 teknik çoğaltma içeren N = 4 deneylerinden iki koşulu karşılaştırmak üzere tasarlanmıştır. Örneğin, hücreler dört bağımsız kez uyarılır, QMI kontrol (uyarılmamış) ve uyarılmış hücreler üzerinde dört farklı gün çalıştırılır, yukarıdaki gibi teknik çoğaltmalar ile, ve veri analizi aşağıda açıklandığı gibi devam eder.

  1. Ayarlanabilir alfa kesme (ANC) ile adaptif parametrik olmayan
    1. MATLAB'ı açın ve etkin dizini ANC program bileşenlerini ve akış sitometresinden dışa aktarılan .xml dosyalarını içeren bir klasöre ayarlayın.
    2. Deneysel tasarımın ayrıntılarını yansıtmak için "ANC girişi" dosyasını doldurun. Ek Dosya'da yer alan örnek dosya, ayrıca sağlanan örnek verileri çalıştırmak için önceden doldurulmuştur.
    3. Etkin dizine bir .csv dosyası yazacak programı çalıştırın. Dosya, kontrol ve deneysel koşullar arasında, 4 deneysel çoğaltmanın tümünde veya en az 3/4 çoğaltmada, yanlış pozitif (alfa) düzeyde 0,05'lik yanlış pozitif (alfa) düzeyde önemli ölçüde farklı pisces bildirir.
    4. 4.3.1 adımda kullanılmak üzere dosyada 3/4/4/4 olarak tanımlanan, en az 3 deneysel kopyada önemli farklılıklar alabilen PiSCES olarak tanımlanan 'ANC isabetleri' notu.
  2. Ağırlıklı korelasyon ağ analizi23 (CNA)
    1. "_MFI" ile biten Matlab tarafından veri dosyası çıktısının sütun başlıklarını yapıştırın.. CSV" yeni bir excel sayfasının ilk satırına. Deney numarası için "deney" ve deney tedavisi veya analiz edilecek diğer değişkenler için "deney" sütunlarını ekleyin. Bu dosyayı "traits.csv" olarak kaydedin.
    2. R stüdyosunu açın ve çalışma dizini "_MFI" içeren bir klasöre ayarlayın. CSV" ve "ÖZELLİkLerİ. CSV" dosyaları.
    3. R komutlarını, yorumlanan komut dosyasında ve dosyalarla birlikte verilen talimatlarda ayrıntılı olarak belirtildiği şekilde çalıştırın. Her bir deneysel özellik ile önemli ölçüde ilişkili WCNA modülleri bir grafik dosyası olarak çıktı ve her etkileşim IPi_ProbeJ her modül ile korelasyon bir .csv dosyası olarak çıktı.
    4. 4.3.1 adımda kullanılmak üzere, deneysel ilgi değişkeni ile önemli ölçüde ilişkili olarak tanımlanan bir modüle üyelik için modül üyeliği (MM) > 0.7 ve p < 0.05 ile etkileşim olarak tanımlanan 'CNA isabetleri' notu.
  3. Pozitif 'hits' & görselleştirme
    1. ANC çıktı dosyasındaki "3/4/4/4 isabet" listesindeki her etkileşim için (adım 4.1.4'ten itibaren), cna çıktı dosyasını işaretleyerek bu etkileşimin de bir "CNA hiti" olup olmadığını belirleyin (bkz. adım 4.2.6). Her ANC isabetinin de Bir CNA isabeti olup olmadığını belirten yeni bir sütun oluşturun.
    2. 4.1.3 adımdan ANC çıktı tablosu "_Hits.csv"de verilen değerlerin ortalamasını alarak her ANC-CNA isabeti için ortalama günlük2 kat değişim değerini hesaplayın. Değerleri ortalamadan önce2 kat değiştirerek günlüğü dönüştürün. Yalnızca 3/4 yinelemelerde önemli olan etkileşimler için, aykırı değeri silin.
    3. Bir sütunda IP, ikinci sütunda bir sonda ve üçüncü sütundaki kat değişim değeri olarak listelenen her ANC-CNA isabetli bir elektronik tablo yapın. Dosyayı ağ olarak içe aktararak Cytoscape'te düğüm kenarı diyagramı oluşturmak için bu elektronik tabloyu kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Antikor Taraması
Şekil 2 B protein Connexin36 için bir ekran sonuçlarını gösterir. Ip_probe kombinasyonlarının çoğu IgG kontrolleri üzerinde sinyal üretmez. 1E5 veya poliklonal antikor 6200 ile monoklonal antikor 1E5 ve prob ile IP IgG kontrolleri ile karşılaştırıldığında boncuk dağılımında sağa doğru bir kayma üretir. Burada IP 1E5 ve probe 6200poly, hem spesifik olmayan bir proteinin iki bağımsız antikor tarafından tanın...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

QMI tahlili antikor paneli geliştirme, ekipman ve reaktifler için önemli bir yatırım gerektirir, ancak tahkikat kurulduktan sonra, deneysel olarak kontrol edilen yanıt olarak protein etkileşim ağlarını gözlemleyerek yüksek boyutlu veri toplayabilir Uyaran. Teknik olarak, QMI dikkatli pipetleme ve örnek ve antikor kuyu yerleri izleme gerektirir. Tahlil plakalarının dikkatle etiketlenmesi, kağıt üzerindeki iyi konumların ayrıntılı bir şablonu nun yapılması gibi, daha sonra veri analizi için kayded...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.

Teşekkürler

Yazarlar QMI tahlil geliştirme önemli katkıları için Tessa Davis kabul etmek istiyorum, ve teknik rehberlik ve entelektüel giriş için Smith ve Schrum laboratuvarları mevcut ve eski üyeleri. Bu çalışma NIMH hibe R01 MH113545 ve R00 MH 102244 tarafından finanse edilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well flat bottomed platesBio Rad171025001
96-well PCR platesVWR82006-704
Bioplex 200 System with HTFBio Rad171000205modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash StationBio Rad30034376
BSASigma
CML beadsInvitrogenC37481
EDTASigmaE6758
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo ScientificA39256
MagPlex MicrospheresLuminexMC12xxx-01xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification KitThermo Scientific45206used for antibody purification
MESSigmaM3671
Microplate film, non-sterileUSA Scientific2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2SigmaP5726
Protease inhibitor cocktailSigmaP8340
Sandwich Prep RefrigeratorNorlakeSMP 36 15for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluorideSigma201154
Sodium orthovanadateSigma450243
Streptavidin-PEBioLegend405204
Sulfo NHSThermo ScientificA39269
TrisFisher ScientificBP152

Referanslar

  1. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  2. Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
  3. Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
  4. Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
  5. Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
  6. Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
  7. Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
  8. Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
  9. Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23(2005).
  10. Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
  11. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807(2010).
  12. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
  13. Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
  14. Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7(2016).
  15. Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science's STKE. 2007 (389), (2007).
  16. Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48(2018).
  17. Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
  18. Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
  19. Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
  20. Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
  21. Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722(2012).
  22. Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
  23. Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559(2008).
  24. Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 150IP FCMproteomikprotein etkile imisinyalizasyonimm noprepitasyonQMI

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır