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Résumé

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) utilise la cytométrie du débit pour détecter sensible les différences dans l'abondance des interactions protéines-protéines ciblées entre deux échantillons. QMI peut être effectué en utilisant une petite quantité de biomatériau, ne nécessite pas d'étiquettes génétiquement modifiées, et peut être adapté pour tout réseau d'interaction protéique précédemment défini.

Résumé

Les interactions dynamiques protéines-protéines contrôlent le comportement cellulaire, de la motilité à la réplication de l'ADN en passant par la transduction du signal. Cependant, il est techniquement difficile de surveiller les interactions dynamiques entre plusieurs protéines dans un réseau d'interaction protéique. Ici, nous présentons un protocole pour l'immunoprécipitation multiplexe quantitative (QMI), qui permet l'évaluation quantitative des changements de pli dans les interactions protéiques basées sur des mesures relatives de fluorescence des protéines dans les complexes partagés détectés par Exposed Épitopes de surface (PiSCES). Dans QMI, les complexes protéiques des lysates cellulaires sont immunoprécipités sur les microsphères, puis sondés avec un anticorps étiqueté pour une protéine différente afin de quantifier l'abondance du PiSCES. Les anticorps immunoprécipitations sont conjugués à différentes régions spectrales magbead, ce qui permet à un cytomètre de flux de différencier plusieurs immunoprécipitations parallèles et de quantifier simultanément la quantité d'anticorps de sonde associée à chacune. QMI n'exige pas le marquage génétique et peut être effectué en utilisant un biomatériau minimal par rapport à d'autres méthodes d'immunoprécipitation. QMI peut être adapté pour n'importe quel groupe défini de protéines en interaction, et a jusqu'à présent été utilisé pour caractériser les réseaux de signalisation dans les lymphocytes T et les synapses neuronales de glutamate. Les résultats ont mené à la nouvelle génération d'hypothèse s'est chargée d'applications diagnostiques et thérapeutiques potentielles. Ce protocole comprend des instructions pour effectuer QMI, de la sélection initiale du panneau d'anticorps jusqu'aux essais en cours d'exécution et à l'analyse des données. L'assemblage initial d'un test QMI consiste à filtrer les anticorps pour générer un panneau et à déterminer empiriquement un tampon de lyse approprié. La préparation subséquente de réactif inclut covalently accouplement des anticorps d'immunoprécipitation aux MagBeads, et anticorps de sonde de biotinylating de sorte qu'ils puissent être étiquetés par un fluorophore streptavidin-conjugué. Pour exécuter l'essai, le lysate est mélangé avec des MagBeads pendant la nuit, puis les perles sont divisées et incubées avec différents anticorps de sonde, et puis une étiquette de fluorophore, et lues par cytométrie de flux. Deux tests statistiques sont effectués pour identifier les PiSCES qui diffèrent considérablement entre les conditions expérimentales, et les résultats sont visualisés à l'aide de cartes thermiques ou de diagrammes de nœuds.

Introduction

Les interactions protéines-protéines dynamiques constituent les cascades de signalisation moléculaire et les structures motiles qui sont la base fonctionnelle de la plupart des physiologie cellulaires1. Ces processus sont souvent représentés comme des voies de signalisation linéaires qui passent d'un état stable à partir d'entrées uniques, mais les données expérimentales et de modélisation montrent clairement qu'elles fonctionnent comme des réseaux intégrés2,3, 4. Dans le cas des protéines G, différents récepteurs ont souvent la capacité d'activer la même protéine G, et un seul récepteur peut également activer plus d'un type de protéine G5,6. Pour que le nombre relativement faible de classes de protéines G module spécifiquement un vaste éventail de fonctions cellulaires telles que la transmission synaptique, la régulation hormonale et la migration cellulaire, les cellules doivent à la fois intégrer et différencier ces signaux4 , 5. Les preuves ont montré que cette spécificité de signal, pour les protéines G aussi bien que d'autres, est principalement dérivée sur la base des interactions protéine-protéine finement réglées et de leur dynamique temporelle1,3, 4 ( en plus) , 5 Annonces , 6 Annonces , 7. Étant donné que les réseaux de signalisation sont composés de complexes protéiques dynamiques avec de multiples entrées, sorties et boucles de rétroaction, une seule perturbation a la possibilité de modifier l'équilibre homéostatique global de la physiologie d'une cellule4 ,7. Il est maintenant largement admis que la signalisation devrait être examinée du point de vue du réseau afin de mieux comprendre comment l'intégration de multiples entrées contrôle les fonctions cellulaires discrètes dans la santé et la maladie7,8, 9,10,11,12,13. À la lumière de cela, Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) a été développé pour recueillir à moyen débit, des données quantitatives sur les changements de pli dans les réseaux dynamiques d'interaction des protéines.

QMI est un test à base d'anticorps dans lequel le lysate cellulaire est incubé avec un panneau d'anticorps immunoprécipitation qui sont covalently couplés à des perles magnétiques contenant des rapports distincts de colorants fluorescents. Le fait d'avoir des anticorps spécifiques couplés à des classes distinctes de perles magnétiques permet une co-immunoprécipitation simultanée de protéines cibles multiples provenant du même lysate. Après l'immunoprécipitation (IP), les perles magnétiques sont incubées avec un deuxième anticorps de sonde fluorophore-conjugué (ou anticorps biotinylated en même temps que le streptavidin fluorophore-conjugué). Les co-associations entre les protéines reconnues par chaque paire d'anticorps ip anticorps-probe, ou PiSCES (protéines dans des complexes partagés détectés par des épitopes de surface exposés), sont ensuite détectées par cytométrie de débit et peuvent être comparées quantitativement entre différents conditions de l'échantillon14. Des illustrations de la figure 1 montrent les étapes de l'exécution d'un test QMI, y compris un diagramme de perles magnétiques avec des complexes protéiques immunoprécipités étiquetés par des anticorps de sonde conjugués fluorescents (figure 1C).

La sensibilité de QMI dépend de la concentration en protéines du lysate par rapport au nombre de perles magnétiques utilisées pour l'immunoprécipitation, et la réalisation d'une résolution pour détecter 10% des changements de pli ne nécessite qu'une petite quantité de matériau de départ par rapport à d'autres méthodes co-IP14,15. Par exemple, la quantité de matériel de départ utilisée dans QMI est similaire à celle requise pour un sandwich Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA), mais de multiples interactions sont détectées dans un seul essai QMI. Des analyses QMI utilisant 20 IP et 20 cibles de sonde ont été effectuées à l'aide de 1-5 x 105 lymphocytes T primaires isolés d'une biopsie de la peau de 4 mm, des préparations synaptosomal P2 d'une section coronale de 3 mm du cortex préfrontal de la souris, ou 3 x 106 souris cultivées primaires neurones corticaux14,16,17. Cette sensibilité rend QMI utile pour l'analyse de cellules ou de tissus avec une disponibilité limitée, comme les échantillons cliniques.

QMI peut être adapté pour n'importe quel réseau d'interaction protéique précédemment défini (à condition que des anticorps soient disponibles), et à ce jour a été développé pour analyser le signalosome de récepteur d'antigène de cellules T (TCR) et un sous-ensemble de protéines aux synapses glutamatergiques dans les neurones 17 Annonces , 18. Dans des études sur la signalisation des récepteurs des lymphocytes T, QMI a d'abord été utilisé pour identifier les changements induits par la stimulation dans piSCES, puis pour distinguer les patients auto-immuns d'un groupe témoin, détecter la signalisation auto-immune endogène, et enfin générer un hypothèse impliquant un sous-réseau déséquilibré d'interactions associés à la maladie14. Plus récemment, le même panneau QMI a été utilisé pour déterminer que la sélection des thymocytes est déterminée par des différences quantitatives plutôt que qualitatives dans la signalisation des protéines associées au TCR19. Dans les neurones, QMI a été utilisé pour décrire la réorganisation spécifique à l'entrée d'un réseau d'interaction protéique pour des types distincts de signaux d'entrée d'une manière qui soutient les nouveaux modèles émergents de plasticité synaptique17. En outre, ce panneau QMI synaptique a été utilisé pour identifier les différences dans sept modèles murins de l'autisme, regrouper les modèles en sous-groupes en fonction de leurs biosignatures PiSCES, et émettre avec précision un déficit moléculaire partagé qui n'était pas reconnu auparavant. dans l'un des modèles16. Une approche similaire pourrait être utilisée pour dépister d'autres sous-groupes qui pourraient répondre à différents traitements médicamenteux, ou affecter des médicaments à des sous-groupes spécifiques réactifs. QMI a des applications potentielles dans le diagnostic, la sous-typage des patients, et le développement de médicaments, en plus de la science fondamentale.

Pour assembler un panneau d'anticorps QMI, les protocoles initiaux de dépistage et de sélection des anticorps sont décrits à la section 1, ci-dessous. Une fois que les panneaux d'anticorps sont identifiés, les protocoles de conjugaison des anticorps sélectionnés aux perles magnétiques pour la propriété intellectuelle, et pour la biotinylation des anticorps de la sonde sélectionnés, sont décrits à la section 2. Le protocole d'exécution de l'analyse QMI sur les lysates cellulaires ou tissulaires est décrit dans la section 3. Enfin, puisqu'une seule expérience peut générer 5 x 105 points de données individuels, des instructions et des codes informatiques pour faciliter le traitement, l'analyse et la visualisation des données sont fournis à la section 4. Un aperçu du flux de travail décrit dans les sections 2-4 est affiché à la figure 1.

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Protocole

1. Conception d'assay

  1. Préparation d'anticorps candidat
    1. Pour chaque protéine d'intérêt, choisissez 3 à 5 anticorps à l'écran. Dans la mesure du possible, utilisez des anticorps monoclonaux qui reconnaissent différents épitopes. Inclure également un anticorps de contrôle non spécifique.
    2. Pour supprimer Tris, effectuez un échange de mémoire tampon en ajoutant l'anticorps à un filtre de rotation de 30 kDa, en tournant jusqu'à son volume minimum, en ajoutant 500 l de salin tamponné par phosphate (PBS), et en répétant 3 fois. Pour enlever les protéines porteuses, effectuer la purification des anticorps selon le protocole du fabricant (voir tableau des matériaux pour une recommandation de purification spécifique).
      REMARQUE : Cela est fait parce que les protéines porteuses et les tampons avec des groupes d'amine libres (tels que Tris) réagiront avec les groupes coOH et étancheront les réactions subséquentes de couplage de perles et de biotinylation. Assurez-vous que tous les anticorps sont purifiés (pas de protéines porteuses) et dans un tampon exempt d'amines primaires (c.-à-d., pas de Tris).
    3. Couplez chaque anticorps à carboxylate latex modifié (CML) perles comme décrit par Davis et Schrum20. Pour conserver l'anticorps, réduire les réactions d'accouplement de perles jusqu'à 1/5 (c.-à-d. 3,6 x 106 perles avec 10 l d'anticorps de 0,2 à 1 mg/mL).
    4. Estimer le nombre de perles à l'aide d'un hémocytomètre (généralement 108/mL) et entreposer à 4 oC. Les perles sont entreposées depuis plus d'un an et utilisées avec succès dans les analyses QMI, mais la durée de conservation ou les dates d'expiration n'ont pas été officiellement établies. NaN3 dans le tampon B/S empêche la croissance bactérienne.
    5. Biotinylate une partie de chaque anticorps (voir la section 2.2 ci-dessous). Conserver à 4 oC.
    6. Confirmer l'accouplement efficace de perles de LMC et le comptage précis en taclant 1 x 105 perles avec un anticorps conjugué par PE réactif à l'espèce dans laquelle l'anticorps a été soulevé et la lecture sur un cytomètre de flux.
    7. Confirmer la biotinylation des anticorps par tache de points à l'aide de streptavidin-HRP.
    8. Une fois que le laboratoire a généré des réactifs qui sont connus pour être efficaces, utilisez ces réactifs comme contrôles positifs dans les réactions de confirmation dans les étapes 1.1.5 et 1.1.6.
  2. Dépistage des anticorps par IP-FCM (immunoprécipitation détectée par cytométrie du débit)
    1. Décidez d'un lysate de criblage approprié. Pour cette étape et pour toutes les autres étapes de dépistage pré-QMI (tout ce qui est inclus dans la présente section 1 : Conception des tests), n'utilisez pas de bioéchantillons dont la disponibilité est limitée. Choisissez plutôt un matériau témoin comparable comme le tissu de souris wildtype, les lignées cellulaires ou le tissu normal des donneurs humains qui n'est pas une ressource limitante.
      REMARQUE : Le choix d'un tampon de lyse pour cet analyse n'est pas anodin et est discuté à la section 1.5 : Sélection des détergents, ainsi que dans l'avant-dernier paragraphe de la section Discussion. Les tampons de lyse standard ont une base de 150 mM NaCl, 50 mM Tris (pH 7,4), 10 mM de fluorure de sodium, 2 mM d'orthovanadate de sodium et des cocktails inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase. Les détergents compatibles avec QMI comprennent 1% NP-40, 1% Digitonin, 0.1-1% Triton X-100, et 0.5-1% deoxycholate14,16,17,18,19,21.
    2. Calculez le volume total de lysate à utiliser pour chaque IP, en utilisant 10 L pour chaque combinaison IP-probe à filtrer. Si le dépistage des anticorps de la sonde X et l'utilisation d'un contrôle IgG, chaque IP utilisera (X 1) (10 l) (1,1 pour l'erreur de tuyauterie); Le contrôle de la sonde IgG est nécessaire. Par exemple, dans un écran d'anticorps 3x3, chaque IP doit utiliser 44 ul. N'oubliez pas d'inclure un contrôle IP IgG (voir l'exemple de la configuration de dépistage dans la figure 2).
    3. Calculer le numéro de perle CML à utiliser. Si vous testez des anticorps de la sonde X, utilisez [(X-1) 5 x 104 perles]. Idéalement, 5 000 perles par puits se traduiront par des perles de 2 000 perles par puits lu par le cytomètre de débit. Par exemple, dans un écran d'anticorps de 3 x 3, chaque IP devrait utiliser 20 000 perles, soit environ 0,66 l de perle de LMC préparée à partir de l'étape 1.1.3 (les perles doivent d'abord être quantifiées à l'aide d'un hémocytomètre pour assurer l'exactitude).
    4. Incuber le volume de lysate à partir de l'étape 1.2.2 avec le volume de chaque perle de LMC à filtrer à partir de l'étape 1.2.3, pendant la nuit à 4 oC avec rotation pour empêcher les perles de se tasser. Typiquement, effectuer des incubations dans la première colonne d'une plaque PCR 96-bien, et le bouchon avec des bouchons de bande de tube PCR.
    5. Faites baisser les perles de LMC à 3 200 x g pendant 1 min et retirez le lysate par un seul clignotement rapide de la plaque au-dessus de l'évier. Une minuscule pastille blanche doit être visible au fond de chaque puits avant et après le clignotement.
    6. Resuspendre les perles de LMC dans un volume de tampon FlyP à l'équivalent de 20 L pour chaque paire de perles-probe; pour les anticorps de la sonde X, l'utilisation (X-1) (20 l) (1,1 pour l'erreur de tuyauterie), similaire à l'étape 1.2.2. Pour un écran 3 x 3, resuspendre en 88 oL de mémoire tampon FlyP. FlyP tampon est de 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,4, 1% BSA, 0,01% NaN3.
    7. Distribuez chaque IP sur les puits d'une plaque PCR de 96 puits, où X est le nombre d'anticorps de sonde qui sont examinés, à l'aide de 20 l/puits. Figure 2 A montre un exemple de configuration de dépistage.
    8. Laver 2 fois de plus à l'aide de 200 l de tampon FlyP par puits. Faites tourner la plaque comme à l'étape 1.2.5 et faites glisser la plaque pour enlever le tampon de lavage après chaque lavage. Les granulés seront extrêmement petits, mais devraient être visibles après chaque lavage.
    9. Pour que chaque anticorps biotinylated soit examiné, calculez le volume total comme (Y-1) comme 1,1 à 50 L, où Y est le nombre d'anticorps IP qui sont examinés. Diluer l'anticorps à une concentration de travail dans ce volume de tampon FlyP, commençant généralement par une dilution de 1:100 d'un stock de 0,5 mg/mL.
    10. Distribuez chaque anticorps dilué dans chaque colonne de la plaque de puits 96 et assurez-vous que les perles de LMC sont remises en suspension.
    11. Incuber à 4 oC pendant 1 h, soit avec rotation ou tuyauterie à intervalles de 15 min pour s'assurer que les perles de LMC restent en suspension.
    12. Laver 3x en 200 l de tampon FlyP, pour chaque centrifugeuse de lavage et retirer le lysate comme à l'étape 1.2.5.
    13. Resuspendre toutes les perles de LMC dans 50 'L de 1:200 Streptavidin-PE dans le tampon FlyP.
    14. Incuber à 4 oC dans l'obscurité pendant 30 min.
    15. Laver 3x en 200 l de tampon FlyP, pour chaque centrifugeuse de lavage et retirer le lysate comme à l'étape 1.2.5.
    16. Resuspendre dans 200 l de tampon FlyP, puis exécuter sur un cytomètre de flux.
  3. Choisir des anticorps à inclure dans l'action de travail
    1. Porte zona sur la taille en utilisant FSC-H vs SSC-H, et éliminez les doublets en utilisant FSC-H vs FSC-A.
    2. Générer des histogrammes d'intensité de fluorescence PE et recenser les deux contrôles IgG (sonde igG perle-test, sonde de perle-IgG) sur des paires testées (Figure 2).
    3. Recherchez une paire de perles-probe qui donne un signal clair sur le bruit (Figure 2B). En outre, il n'est pas idéal d'utiliser le même anticorps pour la perle et la sonde. La reconnaissance différentielle de l'épitopes maximise les chances d'observer les interactions, car certaines épitopes peuvent être occludes dans certains complexes protéiques. S'il n'y a pas d'options acceptables, répétez l'écran avec des anticorps supplémentaires.
  4. Confirmation de la spécificité des anticorps
    1. Pour assurer la spécificité des anticorps pour les cibles visées, utilisez un échantillon de lysate dans lequel la cible a été éliminée; par exemple, une souris knock-out ou une ligne cellulaire RNAi. Alternativement, utilisez le lysate à partir d'une lignée cellulaire négative cible dans laquelle la protéine cible a été exprimée artificiellement.
    2. Effectuer IP-FCM tel que décrit à l'étape 1.2, en modifiant pour s'adapter à l'expérience.
  5. Sélection de détergents
    1. Comme les détergents sont essentiels dans les expériences de co-PI, tester empiriquement différentes variations pour s'assurer que l'essai a une probabilité maximale de détecter les changements. Pour commencer, choisissez un panel relativement restreint d'interactions (4-8) qui sont connues pour changer dans un état donné et/ ou qui sont d'un intérêt particulier pour votre étude.
    2. À l'aide des perles de LMC non fluorescentes et conjuguées par anticorps faites pour les écrans initiaux, effectuez IP-FCM comme décrit dans 1.2 en utilisant des conditions de détergent tampon de lyse variées. Les écrans détergents peuvent être exécutés avec le détergent comme seule variable, ou avec des conditions cellulaires différentes pour chaque détergent. Utilisez toujours des commandes IgG pour les perles et les sondes, car les détergents produisent parfois des antécédents inattendus dans certaines combinaisons IP-Probe.
    3. En fonction des IMF de l'écran, choisissez un détergent qui optimise le signal pour le PiSCES d'intérêt. Il est probable que certains compromis devront être faits22.

2. Préparation de réactif multiplex

  1. Couplage de perles magnétiques
    1. À l'aide de la carte de la région des perles magnétiques, sélectionnez les régions perlées à utiliser dans un modèle qui minimise le risque de détection croisée. Les perles magnétiques s'enduisent généralement vers le haut et vers la droite, ainsi évitez des régions de perle qui sont diagonalement adjacentes. Les perles de toutes les autres colonnes du diagramme de perles affichées sur le site Web de Luminex sont recommandées (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/).
    2. Préparer l'anticorps sans porteur à 0,1 mg/mL en PBS (comme dans 1,1,2) dans 250 L. Restez sur la glace pour une utilisation ultérieure.
    3. Les perles magnétiques de Vortex sont intensivement, puis aliquot 250 l dans un tube de microcentrifuge ambre (pour protéger les perles contre le photoblanchiment).
    4. Perles magnétiques séparées pendant 60 s et retirez le supernatant.
    5. Ajouter 250 l de tampon MES (50 mM MES pH 6,0, 1 mM EDTA), vortex, magnétiquement séparé pour 60 s, et retirer le supernatant. Répétez et resuspendez les perles magnétiques dans 200 l de tampon MES.
    6. Ajouter 40 'L de MES à un 2 mg de tube à usage unique de Sulfo-NHS pour faire un stock de 50 mg/mL.
    7. Ajouter 25 L de Sulfo-NHS fraîchement préparé aux perles magnétiques. Vortex.
    8. Ajouter 25 'L de 50 mg/mL EDAC fraîchement dissous [1-éthyl-3-(-3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, également appelé EDC] dans le tampon MES. Vortex.
    9. Couvrir et secouer sur un vortexer avec une pièce jointe à tube pendant 20 min à température ambiante, 1000 tr/min.
    10. Séparer magnétiquement pour 60 s et retirer le supernatant.
    11. Resuspendre dans 500 OL de PBS, vortex, magnétiquement séparé pour 60 s et enlever le supernatant. répéter.
    12. Resuspendre dans 250 l de solution d'anticorps à partir de l'étape 2.1.2. Vortex.
    13. Incuber 2 h à température ambiante en secouant sur un vortexer à 1000 tr/min.
    14. Ajouter 500 L de PBS aux perles magnétiques, vortex, magnétiquement séparés pour 60 s, et retirer le supernatant.
    15. Ajouter 750 l de tampon de blocage/stockage (B/S) (1 % de BSA en PBS pH 7,4, 0,01 % NaN3). Couvrir et incuber 30 min à température ambiante, 1000 tr/min.
    16. Séparer magnétiquement pour 60 s et retirer le supernatant. Resuspendre dans 100 oL de tampon B/S.
    17. Conserver à 4 oC. Les perles sont entreposées depuis plus d'un an et utilisées avec succès dans les analyses QMI, mais la durée de conservation ou les dates d'expiration n'ont pas été officiellement établies. NaN3 dans le tampon B/S devrait prévenir la croissance bactérienne.
    18. Valider l'accouplement de perles magnétiques en taclant 0,25 l de perles magnétiques couplées avec une espèce fluorescente anti-hôte secondaire et la lecture sur un cytomètre de flux, comme dans l'étape 1.1.5.
  2. Biotinylation
    1. Assurez-vous que les anticorps sont dans PBS sans protéine porteuse.
    2. Calculer le total des anticorps à biotinylated (100-200 g recommandés pour une utilisation dans le multiplexe, 25-50 g recommandé pour le dépistage).
    3. Préparer du sulfo-NHS-biotine frais de 10 mM (peut être fait en ajoutant 224 L de ddH2O à un tube sans poids de 1 mg).
    4. Ajouter 1 'L de sulfo-NHS-biotine de 10 mM par 25 g d'anticorps, de vortex ou de pipette de haut en bas pour mélanger.
    5. Incuber à la température de la chambre pour 1 h.
    6. Incuber à 4 oC pendant 1 h.
    7. Utilisez un filtre à rotation de 30 kDa pour éliminer la biotine non liée et arrêter la réaction. Ajouter 500 L de PBS et faire tourner la colonne jusqu'à ce que le volume minimum soit atteint. Ajouter 500 L de PBS supplémentaires et répéter pour 3 échanges tampons totaux.
    8. Estimer la concentration en mesurant l'absorption de 1 à 2 L sur un spectrophotomètre, puis porter la concentration d'anticorps à 0,5 mg/mL.
    9. Conserver à 4 oC.

3. Immunoprécipitation quantitative de multiplex

  1. Mise en page des plaques
    REMARQUE : Cet exemple fonctionne mieux lorsqu'il est effectué à l'aide de plaques de puits de 96 et de 2 à 4 conditions d'échantillonnage.
    1. Exécutez toujours des contrôles appropriés (c.-à-d. des cellules stimulées c. non stimulées) sur la même plaque afin de détecter les changements entre les conditions. Distribuez chaque échantillon horizontalement sur la plaque et utilisez chaque colonne pour un anticorps de sonde différent. Un ensemble de répliques techniques pour chaque sonde doit être exécuté immédiatement après le premier set. Voir La figure 3 pour un exemple.
    2. Documentez soigneusement la disposition de la plaque pour faciliter le chargement et l'analyse des plaques.
  2. Préparation de l'échantillon et immunoprécipitation (Jour 1)
    1. Lyse le tissu ou les cellules dans un détergent approprié avec des inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase et incuber sur la glace pendant 15 min. Prenez soin de garder le lysate froid en tout temps.
      REMARQUE : La quantité exacte de la concentration de protéines de biomatériau et de lysate indiquantdoit doit être déterminée empiriquement, et quelques exemples d'échantillons précédemment utilisés sont énumérés dans le troisième paragraphe de l'introduction. En général, dans la gamme de 200 oL de 2 mg/mL de protéines par échantillon a été couronnée de succès dans le passé pour 20 cibles IP et 20 sondes, mais les intrants idéaux pour chaque panneau d'anticorps et type de cellule ou de tissu doivent être déterminés empiriquement.
    2. Faire une rotation à 4 oC pendant 15 min à 16 000 x g pour enlever les membranes et les débris; garder supernatant comme lysate.
    3. Effectuez un test BCA ou similaire pour déterminer les concentrations de protéines, puis normalisez la concentration de protéines entre les échantillons. Si vous utilisez des cellules, commencez par un nombre égal de cellules par condition et la normalisation est facultative.
    4. Préparer un mélange de perles magnétiques maître qui contient 250 perles magnétiques de chaque classe par puits dans l'assay. Ajuster les nombres de perles après l'analyse des données afin qu'à l'avenir, les analyses soient interprétées en moyenne par puits par puits.
      REMARQUE : Calcul de l'exemple : (Nouveau volume de perles) '[(Run Average) / 110] (volume de perles antérieurs). Les volumes de perles doivent être ajustés de cette façon à environ toutes les 8 courses ou au besoin. En règle générale, 3-4 L de chaque perle magnétique (préparée comme ci-dessus) sont utilisées pour une expérience à 2 plaques.
    5. Laver le mélange de perles magnétiques 2x dans le tampon FlyP avec séparation magnétique, puis resuspendre dans flyP tampon. Pour la suspension, utilisez 10 L par échantillon par assiette. FlyP tampon est de 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,4, 1% BSA, 0,01% NaN3.
    6. Après avoir complètement vortexé le mélange de perles magnétiques, aliquot 10 L dans des tubes de microcentrifuge à froid (un tube par échantillon). Ajouter des volumes égaux de lysate (avec des concentrations normalisées) à chaque tube pour l'immunoprécipitation.
    7. Aliquot le mélange de perles lysate-magnétique dans un tube pour chaque plaque en cours d'exécution; p. ex. pour une expérience à deux plaques, diviser le lysate en deux tubes. Placer les tubes sur un rotateur à 4 oC pendant la nuit pour l'immunoprécipitation, couvert pour empêcher la lumière.
  3. Exécution de l'assay (Jour 2)
    1. Commencez par les tubes de perles lysate-magnétiques pour la #1. Utilisez un support de perles magnétiques pour enlever le lysate des perles magnétiques, et réservez du lysate pour une analyse future. Laver les perles 2x dans 500 'L de tampon flyP froid de glace. Conserver les tubes toujours sur la glace ou à 4 oC.
    2. Calculer le volume de la suspension en tant que (nombre de sondes) (2 répliques techniques) (25 l par puits) -1,1 pour l'erreur de tuyauterie. Resuspendre les adresses IP en volume calculé de tampon FlyP glacé.
    3. Après avoir soigneusement resuspendu les perles magnétiques par un tuyauterie doux, répartir 25 L par puits sur une plaque de puits à fond plat de 96, sur la glace.
    4. Dans une autre plaque de 96 puits, diluer les anticorps de la sonde biotinylated à 2x concentration de travail (la concentration de travail est généralement 1:100 ou 1:200, déterminé empiriquement) dans le tampon FlyP de sorte que leur ordre correspond aux colonnes sur la disposition de la plaque (voir La figure 3 ). Le volume final des anticorps de la sonde à la concentration de travail sera de 50 L par puits, de sorte que le volume de chaque anticorps de 2 x préparé doit être (25 L) (nombre d'échantillons biologiques) (2 répliques techniques) (1,1 pour l'erreur de tuyauterie).
    5. Utilisez une pipette multicanal pour distribuer 25 ll de chaque dilution d'anticorps de sonde dans la plaque d'aspiration magnétique contenant des perles.
    6. Agiter sur un shaker horizontal pour mélanger et resuspendre les perles magnétiques, puis couver à 4 oC pendant 1 h, en secouant à 450 tr/min dans l'obscurité.
    7. Laver 3x avec un tampon FlyP sur une laveuse à plaque magnétique à 4 oC.
    8. Resuspendre les perles magnétiques en 50 oL de 1:200 Streptavidin-PE.
    9. Agiter pour mélanger et resuspendre les perles, puis incuber à 4 oC pendant 30 min, en secouant à 450 tr/min dans l'obscurité.
    10. Laver 3x avec un tampon FlyP sur une laveuse à plaque magnétique à 4 oC.
    11. Resuspendre dans 125 l de tampon FlyP.
    12. Agiter pendant 1 min à 900 tr/min pour bien suspendre les perles.
    13. Exécuter sur le cytomètre d'écoulement réfrigéré (voir diagramme dans la figure S1). Utilisez le paramètre « cible RP1 élevée » dans le logiciel de cytomètre de débit, et une condition d'arrêt de 1 000 perles par région (dépassant considérablement le nombre qui devrait être dans n'importe quel puits individuel pour empêcher la machine de s'arrêter prématurément) et un volume d'échantillon de 80 L.
    14. Pause de la course à mi-chemin et resuspendre les perles pour éviter le règlement.
    15. Fichiers de données d'exportation dans le format .xml.
    16. Répétez le processus pour les plaques restantes, en commençant par l'étape 3.3.1.

4. Analyse des données

REMARQUE : Le code ANC a été conçu pour comparer deux conditions d'expériences N et 4, chacune avec 2 répliques techniques pour chaque condition. Par exemple, les cellules sont stimulées quatre fois indépendantes, QMI est exécuté sur quatre jours différents sur le contrôle (non stimulé) et les cellules stimulées, avec des répliques techniques comme ci-dessus, et l'analyse des données se déroule comme décrit ci-dessous.

  1. Adaptatif non paramétrique avec coupure alpha réglable (ANC)
    1. Ouvrez MATLAB et fixez l'annuaire actif à un dossier contenant les composants du programme ANC et les fichiers .xml exportés à partir du cytomètre de flux.
    2. Remplissez le fichier « Entrée ANC » pour refléter les détails de la conception expérimentale. L'exemple de fichier inclus dans le fichier supplémentaire a été pré-rempli pour exécuter les données d'exemple, également fournies.
    3. Exécutez le programme, qui écrira un fichier .csv dans le répertoire actif. Le fichier signale piSCES qui sont significativement différents, à un niveau faux positif (alpha) de 0,05, entre le contrôle et les conditions expérimentales, dans les 4 répliques expérimentales, ou au moins 3/4 répliques.
    4. Remarque 'ANC hits', qui sont définis comme PiSCES avec des différences significatives dans au moins 3 répliques expérimentales, représentés comme 3/4 '4/4 dans le fichier, pour une utilisation à l'étape 4.3.1.
  2. Analyse pondérée du réseau de corrélation23 (CNA)
    1. Coller-transposer les titres de colonne de la sortie de fichier de données par Matlab se terminant par "MFI. CSV" dans la première rangée d'une nouvelle feuille excel. Ajouter les colonnes "expérience" pour le nombre d'expériences, et "traitement", pour le traitement expérimental, ou toute autre variable à analyser. Enregistrer ce fichier comme "traits.csv".
    2. Ouvrez le studio R et fixez le répertoire de travail à un dossier contenant le « MFI. CSV" et "TRAITS. fichiers CSV".
    3. Exécutez les commandes R indiquées dans le fichier de commande commenté et les instructions détaillées dans les instructions incluses dans les fichiers. Les modules WCNA significativement corrélés avec chaque trait expérimental sont la sortie comme un fichier graphique, et la corrélation de chaque interaction IPi'ProbeJ avec chaque module est sortie comme un fichier .csv.
    4. Remarque ' CNA hits,' qui sont définis comme des interactions avec l'adhésion au module (MM) 'gt; 0.7 et p 'lt; 0.05 pour l'adhésion à un module qui a été identifié comme sensiblement corrélé avec la variable expérimentale d'intérêt, pour une utilisation à l'étape 4.3.1.
  3. Positive 'hits' et visualisation
    1. Pour chaque interaction dans la liste des « hits de 3/4 à 4 4 / 4 » dans le fichier de sortie de l'ANC (à partir de l'étape 4.1.4), identifiez si cette interaction est également un « coup cNA » en vérifiant le fichier de sortie de l'AIC (voir l'étape 4.2.6). Créez une nouvelle colonne qui indique si chaque coup ANC est également un coup CNA.
    2. Calculez la valeur de variation moyenne du journal2 pour chaque ANC MDC touché en faisant la moyenne des valeurs données dans la feuille de calcul de sortie de l'ANC « Hits.csv » à partir de l'étape 4.1.3. Convertir les valeurs pour enregistrer2 plis en évolution avant la moyenne. Pour les interactions qui étaient significatives dans seulement 3/4 répliques, supprimer la valeur aberrante.
    3. Effectuez une feuille de calcul avec chaque coup ANC MDC répertorié comme une adresse IP dans une colonne, une sonde dans la deuxième colonne et la valeur de changement de pli dans la troisième colonne. Utilisez cette feuille de calcul pour créer un diagramme de nœud dans Cytoscape en important le fichier comme un réseau.

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Résultats

Dépistage des anticorps
Figure 2 B montre les résultats d'un écran pour la protéine Connexin36. La plupart des combinaisons IP-probe ne produisent aucun signal sur les commandes IgG. Ip avec l'anticorps monoclonal 1E5 et sonde avec 1E5 ou l'anticorps polyclonal 6200 produit un décalage vers la droite dans la distribution de perles par rapport aux contrôles IgG. Ici, IP 1E5 et sonde 6200poly ont été sélectionnés pour éviter d'utiliser le même a...

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Discussion

L'analyse QMI exige des investissements substantiels dans le développement de panneaux d'anticorps, l'équipement et les réactifs, mais une fois l'analyse établie, on peut recueillir des données de haute dimension observant les réseaux d'interaction protéique lorsqu'ils répondent à des Stimuli. Techniquement, l'Agence QMI exige un tuyautage minutieux et un suivi des emplacements des puits d'échantillons et d'anticorps. L'étiquetage minutieux des plaques d'analyse est utile, tout comme la fabrication d'un modèl...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Tessa Davis pour ses contributions importantes au développement des tests de l'Agence QMI, ainsi que les membres actuels et anciens des laboratoires Smith et Schrum pour leurs conseils techniques et leur contribution intellectuelle. Ces travaux ont été financés par les subventions du NIMH R01 MH113545 et R00 MH 102244.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well flat bottomed platesBio Rad171025001
96-well PCR platesVWR82006-704
Bioplex 200 System with HTFBio Rad171000205modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash StationBio Rad30034376
BSASigma
CML beadsInvitrogenC37481
EDTASigmaE6758
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo ScientificA39256
MagPlex MicrospheresLuminexMC12xxx-01xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification KitThermo Scientific45206used for antibody purification
MESSigmaM3671
Microplate film, non-sterileUSA Scientific2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2SigmaP5726
Protease inhibitor cocktailSigmaP8340
Sandwich Prep RefrigeratorNorlakeSMP 36 15for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluorideSigma201154
Sodium orthovanadateSigma450243
Streptavidin-PEBioLegend405204
Sulfo NHSThermo ScientificA39269
TrisFisher ScientificBP152

Références

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