تطبيق الضوضاء العشوائية لتقييم حساسية الخلايا العصبية النواة الدهليزية الوسيطة في المختبر

Summary

التحفيز الدهليزي الكلفاني في البشر يعرض تحسينات في وظيفة دهليزية. ومع ذلك، فمن غير المعروف كيف تحدث هذه التأثيرات. هنا، ونحن نصف كيفية تطبيق الضوضاء الكهربائية الجيوب الأنفية والعشوائية وتقييم السعة التحفيزية المناسبة في الخلايا العصبية الأساسية الأساسية الأساسية في الماوس C57BL/6.

Abstract

وقد ثبت التحفيز الدهليزي الكلفاني (GVS) لتحسين مقاييس التوازن في الأفراد الذين يعانون من التوازن أو العاهات الدهليزية. ويُقترح أن يعزى ذلك إلى ظاهرة الرنين العشوائي (SR)، التي تُعرَّف بأنها تطبيق حافز منخفض المستوى/دون عتبة على نظام غير خطي لزيادة الكشف عن الإشارات الأضعف. ومع ذلك، لا يزال من غير المعروف كيف يظهر SR آثاره الإيجابية على التوازن البشري. هذا هو واحد من المظاهرات الأولى لآثار الضوضاء الجيوب الأنفية والعشوائية على الخلايا العصبية الفردية. باستخدام كامل الخلية التصحيح المشبك الفيزيولوجيا الكهربائية، يمكن تطبيق الضوضاء الزعنفة والعشوائية مباشرة على الخلايا العصبية الفردية في النواة الدهليزية الوسيطة (MVN) من الفئران C57BL/6. هنا نبين كيفية تحديد عتبة الخلايا العصبية MVN من أجل ضمان المحفزات الزفية والعشوائية هي عتبة فرعية ومن هذا، تحديد الآثار التي كل نوع من الضوضاء على كسب الخلايا العصبية MVN. نبين أن الضوضاء السينوسية والعشوائية تحت العتبة يمكن أن تعدل حساسية الخلايا العصبية الفردية في MVN دون التأثير على معدلات إطلاق النار القاعدية.

Introduction

يتحكم النظام الدهليزي (أو التوازن) في إحساسنا بالتوازن من خلال دمج المعلومات السمعية، والحسية، والحسية الجسدية والبصرية. وقد ثبت أن تدهور النظام الدهليزي يحدث كدالة للعمر ويمكنأن يؤدي إلى عجز في التوازن 1،². ومع ذلك، فإن العلاجات التي تستهدف أداء النظام الدهليزي نادرة.

وقد ثبت التحفيز الدهليزي الكلفاني (GVS) لتحسين مقاييس التوازن، والأداء اللاإرادي وغيرها من الطرائق الحسية داخل البشر^3،4،^5،6. ويقال أن هذه التحسينات تعود إلى ظاهرة الرنين العشوائي (SR)، وهي الزيادة في الكشف عن إشارات أضعف في الأنظمة غير الخطية عن طريق تطبيق الضوضاء تحت العتبة^7،8. وقد أظهرت هذه الدراساتتحسينات في ثابت 9،¹⁰ ودينامية^11،12 التوازن، واختبارات الإخراج الدهليزيمثل لفة عداد العين (OCR)^13. ومع ذلك، استخدمت العديد من هذه الدراسات مجموعات مختلفة من المعلمات التحفيز مثل الضوضاء البيضاء⁹، الضوضاء الملونة¹³، نطاقات تردد التحفيز المختلفة وتقنيات العتبات. ولذلك، فإن بارامترات التحفيز المثلى لا تزال غير معروفة ويمكن أن يساعد هذا البروتوكول في تحديد البارامترات الأكثر فعالية. وإلى جانب معايير التحفيز، فإن نوع التحفيز مهم أيضاً في الفعالية العلاجية والتجريبية. تم تنفيذ العمل أعلاه في البشر باستخدام محفزات الضوضاء الكهربائية، في حين أن الكثير من العمل الحيواني في الجسم الحي قد استخدمت الميكانيكية^14،15 أو البصريات¹⁶ محفزات الضوضاء. سيستخدم هذا البروتوكول الضوضاء الكهربائية لفحص الآثار على النوى الدهليزية.

في السابق، تم تنفيذ تطبيق GVS لتحفيز afferents الدهليزية الأولية في الجسم الحي في الخنازير السنجاب¹⁷، chinchillas¹⁸، أجنة الدجاج¹⁵ والخنازير غينيا¹⁴. ومع ذلك، درست اثنتان فقط من هذه الدراسات تأثير GVS على كسب afferents الدهليزية الأولية^14،15. وقد أجريت هذه التجارب في الجسم الحي مما يعني أنه لا يمكن تحديد الأنماط الدقيقة للتحفيز المفروضة على النوى الدهليزية. على حد علمنا، وقد طبقت دراسة واحدة فقط الضوضاء العشوائية على الخلايا العصبية الفردية الأنزيمية المنفصلة في الجهاز العصبي المركزي¹⁹. ومع ذلك، لم يتم إجراء أي تجارب في النوى الدهليزية المركزية لتقييم المعلمات التحفيزية المناسبة وتقنيات العتبات، مما يجعل هذا البروتوكول أكثر دقة في تحديد آثار التحفيز على الخلايا العصبية الفردية داخل الدهليزية النوي.

هنا، ونحن نصف كيفية تطبيق الضوضاء الزعنفة والعشوائية (الكهربائية) مباشرة على الخلايا العصبية الفردية في النواة الدهليزية الوسيطة (MVN)، وتحديد عتبة الخلايا العصبية وقياس التغيرات في كسب / حساسية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية الموصوفة من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة سيدني (رقم البروتوكول المعتمد: 2018/1308).

1- الحيوانات

ملاحظة: تم الحصول على الفئران من المركز الأسترالي للقوارض (ARC; بيرث، أستراليا) وعقد في بناء المؤسسة الطبية مرفق الحيوان في جامعة سيدني.

1. الحفاظ على الفئران على دورة طبيعية 12 ساعة ضوء / الظلام مع الإثراء البيئي.
2. استخدم الفئران C57BL/6 من الذكور والإناث (3-5 أسابيع) لجميع التجارب.

2. إعداد الحلول

1. إعداد 1 لتر من السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي (ACSF) يتكون من29 M NaHCO 3، 11 Mالجلوكوز، 120 مل كلونس، 3.3 مليون متر كلك، 1.4 مليون متر شمال شرق 2_بو4،2.2 مليون متر مكل_2،2.77 م م ككل_2.
2. إعداد 200 مل من السكروز-ACSF (sACSF) التي تحتوي على 29 مل NaHCO_3،11 مل الجلوكوز، 241.5 مليون متر السكروز، 3.3 مليون متر قدم مربع، 1.4مليون متر شمال شرق الولايات المتحدة₂PO_4،2.2 مليون متر مغكل_2،2.77 م م. قبل إدراج CaCl₂ إلى ACSF وsACSF، الغاز الحلول مع كاربوجين (95٪ O₂ و 5٪ CO₂₎لإنشاء رقم الهيدروجيني من 7.4 وتجنب هطول الأمطار الكالسيوم (غائم).
3. إعداد K⁺القائم على حل داخل الخلايا يتكون من غلوكونات البوتاسيوم 70 M، 70 مل ككل، 2 مليون متر كلوريد لكل، 10 م هيبس، 4 MM EGTA، 4 m M ملغ₂-ATP، 0.3 mM Na₃-GTP؛ مع رقم الهيدروجيني النهائي من 7.3 (تعديل باستخدام KOH).
   ملاحظة: من المستحسن تصفية الحلول داخل الخلايا مع مرشحات 0.22 ميكرومتر وتخزين aliquots 0.5 مل من الحل في -20 درجة مئوية.

3. إعداد جذع الدماغ

1. قبل استخراج جذع الدماغ، معادلة sACSF مع كاربوجين وبارد في -80 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة بحيث يتم تشكيل الطين الجليد.
2. التخدير الماوس مع isoflurane (3-5 %) المشبعة في الأكسجين (3 مل / دقيقة). مرة واحدة ردود الفعل مخلب الخلفية غائبة، وقطع رأس الماوس مع مقص حاد الفولاذ المقاوم للصدأ.
3. كشف الجمجمة عن طريق إجراء شق المترهل في الجلد باستخدام شفرة الحلاقة (#22 تقريب).
4. باستخدام نهاية مدببة من زوج من مقص نمط القياسية جعل شق صغير في لامدا وقطع على طول الشق الطولي.
5. تعكس بعناية بعيدا العظام الجدارية المقترنة والعظام القذالي باستخدام زوج من الضحلة بينة بيرسون rongeurs.
   ملاحظة: خلال هذا الإجراء كله يتم الاستحمام باستمرار الدماغ في الموقع باستخدام الطين sACSF الجليد الباردة التي أعدت سابقا.
6. عزل جذع الدماغ من الدماغ الأمامي وغلافه العظمي باستخدام شفرة حلاقة (#11 مستقيمة) لخفض sulcus باريتو-occipital وفي النخاع الصدغي.
7. قم بتركيب نهاية البطينية المنعزلة على كتلة البوليستيرين شبه المنحرفة التي كانت مقطوعة من قبل. إزالة السوائل الزائدة حول الأنسجة تشريح مع الفتيل من ورقة الأنسجة لضمان التصاق الأنسجة جيدة إلى مرحلة القطع.
   ملاحظة: يتم قطع كتلة البوليسترين في شكل شبه منحرف، لضمان نهاية rostral من يناسب منتصف الدماغ والصنابير في الحبل الشوكي.
8. استخدام الغراء سيانواكريلات لإصلاح كتلة البوليسترين مع نهاية rostral جذع الدماغ المرفقة وصولا الى مرحلة القطع.
9. باستخدام سرعة متقدمة من 0.16 مم / ثانية واتساع الاهتزاز من 3.00 مم، وإعداد 200 درجة مئوية شرائح عرضية من MVN.
   ملاحظة: يتم تحديد موقع MVN باستخدام أطلس الدماغ الماوس Paxinos وفرانكلين (الأشكال 79-89)²⁰. ال [مفن] (يعدّد بما أنّ [مف] في أطلس) يكذب فورا [فنتريولتر] إلى ال^[4] [ث] بطين وكبيرة حق قبل التعلق من المخيخ (بين ال [كلّيكولي] سفليّة وال [أوبكس]).
10. استخدم ماصة مكسوة بالبلاستيك لنقل الشرائح على قرص ورق مرشح يجلس في ACSF كاربوجينات في 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التسجيل.

4- الصكوك

1. استخدام الإعداد الكهربائي الفسيولوجي القياسية لتنفيذ كامل الخلية التصحيح تقنيات المشبك^21.
2. إعداد micropipettes باستخدام بروتوكول من خطوتين (الخطوة الحرارية 1: 70؛ الخطوة الحرارية 2: 45) على بكرة micropipette (انظر جدولالمواد). يجب أن يكون Micropipettes مقاومة نهائية تتراوح بين 3-5 MΩ مع الحل الداخلي عند وضعها في الحمام.
   ملاحظة: قد تختلف الإعدادات المستخدمة حسب درجة الحرارة داخل الغرفة ويمكن أن تتغير بشكل متكرر.

5. كامل الخلية التصحيح المشبك الفيزيولوجيا الكهربائية

1. للحصول على كامل الخلية التصحيح المشبك التسجيلات من الخلايا العصبية الفردية في MVN، يتم استخدام K⁺القائم على الحل الداخلي داخل ماصة التسجيل.
2. نقل شريحة نسيج واحد من غرفة الحضانة إلى غرفة التسجيل وتأمين شريحة باستخدام خيط النايلون على وزن على شكل حرف U. يتغلغل باستمرار غرفة التسجيل مع كاربوجينات-ACSF في 25 درجة مئوية بمعدل تدفق 3 مل / دقيقة.
3. بعد ملء micropipette مع الحل الداخلي، حدد موقع MVN باستخدام عدسة موضوعية منخفضة الطاقة (10X). باستخدام هدف عالي الطاقة (40x)، يمكن تحديد موقع الخلايا العصبية الفردية داخل MVN.
   ملاحظة: جودة الخلية ضرورية في ضمان جودة التسجيلات ومتانة الخلية عند محاولة تحقيق تكوين الخلية بأكملها. سوف تظهر الخلية الجيدة شكل كروي، غشاء خلية عاكسون ونواة غير مرئية. الخلية السيئة سيكون لها نواة مرئية كبيرة (مثل البيض) ومظهر منتفخ / تقلص.
4. قبل اختراق الأنسجة مع ماصة، وتطبيق كمية صغيرة من الضغط الإيجابي لدفع الحطام بعيدا عن طرف ماصة.
5. نقل الماصة باستخدام micromanipulator نحو الخلايا العصبية المختارة وديمبل الصغيرة يجب أن تشكل على الغشاء العصبي. الإفراج عن الضغط الإيجابي وتطبيق كمية صغيرة من الضغط السلبي.
6. بمجرد تحقيق ختم GΩ 1، وتطبيق لطيف ضغط إيجابي قصير وحاد على حامل ماصة من خلال منفذ الشفط لتمزق الغشاء وخلق تكوين خلية كاملة.
7. جعل كامل الخلية التسجيلات المشبك الحالي باستخدام التقنيات القياسية^21،22.

6. تطبيق الضوضاء الالجيبية والعشوائية على الخلايا العصبية الفدية الفدية الفردية

1. تطبيق الضوضاء العشوائية والجيوب الأنفية في مجموعة من السعة من 3 إلى 24 درجة اما pA لتحديد عتبة الخلايا العصبية ومعدل إطلاق النار.
2. تحديد العتبة الحسية عن طريق تجميع كثافات التحفيز ية المنخفضة والأعلى وإجراء ANOVA لمراقبة أي اختلافات (كما هو مبين في الشكل التكميلي1).
3. حساب متوسط معدل إطلاق النار على مدى فترة 10 ثوان حيث تم / سيتم حقن الخطوة الحالية إزالة الاستقطاب لكل مستوى الحالي الفردية (أي، 7 الحلقات الإجمالية؛ الشكل1).
4. استخدم قيم معدل الإطلاق المتوسط لإنشاء معدل إطلاق مقابل الرسم الحالي وإجراء تحليل انحدار خطي لتحديد تدرج خط الملاءمة الأنسب. التدرج من خط من تناسب أفضل يدل على كسب الخلايا العصبية²².

الشكل 1: الملامح التخطيطية للتحكم وبروتوكولات الضوضاء العشوائية والجيوب الأنفية. (أ) بروتوكولات التحكم (بدون ضوضاء) المطبقة على الخلايا العصبية MVN. (B) بروتوكول الضوضاء السينوسية مع تردد 2 هرتز (C)بروتوكولات الضوضاء العشوائية حيث غالبية الطيف الطاقة ≤ 2 هرتز. كل بروتوكول المعروضة هنا لديه سعة ± 6 pA مع 10 ق إلغاء الاستقطاب الحالي زيادة بنسبة 10 pA تصل إلى 50 pA. التحفيز الحقيقي ليس لديه خطوة الحالية إزالة الاستقطاب، وبالتالي هي الحلقة الأولى من هذه البروتوكولات لتحديد التغييرات مكاسب الخلايا العصبية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

النتائج

التسجيلات الأولية يمكن أن توفر معلومات عن الآثار التي الضوضاء الزفية والعشوائية لها على معدلات إطلاق القاعدية من الخلايا العصبية MVN الفردية وكيف تؤثر المحفزات على كسب الخلايا العصبية. ويبين الشكل 2 أنه لا الضجيج السينوسي ولا العشوائي يغير معدلات إطلاق الخلايا ?...

Discussion

وقد تم تسليط الضوء على آثار التحفيز الدهليزي الكلفاني (GVS) على النظام الدهليزي في الجسم الحي في البشر^3،13،23، خنازير غينيا¹⁴، القوارض¹⁸ والرئيسيات غير البشرية²⁴. ومع ذلك، لم يتم تقييم أي من هذه الدراسات ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl	Scharlau	CA01951000	Used for ACSF and sACSF
D-(+)-Glucose	Sigma	G8270	Used for ACSF and sACSF
EGTA	Sigma	E0396-25G	Used for K-based intracellular solution
HEPES	Sigma	H3375-25G	Used for K-based intracellular solution
KCl	Chem-supply	PA054-500G	Used for ACSF, sACSF and intracellular solution
K-gluconate	Sigma	P1847-100G	Used for K-based intracellular solution
Mg-ATP	Sigma	A9187-500MG	Used for K-based intracellular solution
MgCl	Chem-supply	MA00360500	Used for ACSF and sACSF
Na3-GTP	Sigma	G8877-100MG	Used for K-based intracellular solution
NaCl	Chem-supply	SO02270500	Use for ACSF and intracellular solution
NaH2PO4•2H2O	Ajax	AJA471-500G	Used for ACSF and sACSF
NaHCO3	Sigma	S5761-1KG	Used for ACSF and sACSF
Sucrose	Chem-supply	SA030-500G	Used for sACSF
Isoflurane	Henry Schein	1169567762	Used for anaesthetising mice
EQUIPMENT
Borosilicate glass capillaries	Warner instruments	GC150T-7.5	1.5 mm OD, 1.16 mm ID, 7.5 cm length
Data acquisition software	Axograph		Used for electrophysiology and analysis
Friedmen-Pearson Rongeurs	World precision instruments	14089	Used for dissection
Micropipette puller	Narishige	PP-830	Used for micropipette
Multiclamp amplifier	Axon instruments	700B	Used for electrophysiology
pH meter	Sper scientific	860033	Used for internal solution
Standard pattern scissors	FST	14028-10	Used for dissection
Sutter micromanipulator	Sutter	MP-225/M	Used for electrophysiology
Upright microscope	Olympus	BX51WI	Used for electrophysiology
Vibratome	Leica	VT1200	Used for slicing brain tissue