בקשת הרעש סטוכסטי להערכת המין המדיאלי שיווי מערכת הרגישות לנוירונים בחוץ

Summary

גירוי בפרוזדור הגלווני בבני אדם מציג שיפורים בתפקוד השייווי. עם זאת, לא ידוע כיצד מתרחשות תופעות אלה. כאן, אנו מתארים כיצד להחיל רעש חשמלי sinusoidal וסטוכסטי ולהעריך הגברה גירוי מתאים המוני בתוך הC57BL האמצעי המדילי בפרוזדור הבין-שיווי של הנוירונים בתוך העכבר.

Abstract

גירוי בפרוזדור הגלווני (GVS) הוכח לשפר את צעדי האיזון אצל אנשים עם איזון או ליקויי שיווי משקל. זה מוצע בגלל תופעת התהודה הסטוכסטית (SR), המוגדרת כיישום של גירוי ברמה נמוכה/תת-הסף למערכת לא-לינארית כדי להגביר את הזיהוי של אותות חלשים. עם זאת, עדיין לא ידוע כיצד SR מציג את ההשפעות החיוביות שלו על איזון האדם. זוהי אחת ההפגנות הראשונות של ההשפעות של רעש sinusoidal וסטוכסטי על נוירונים בודדים. שימוש בתאים כולו מהדק התיקון האלקטרופיזיולוגיה, sinusoidal והרעש סטוכסטי ניתן להחיל ישירות על נוירונים בודדים בגרעין הפרוזדור המדיאלי (MVN) של C57BL/6 עכברים. כאן אנו מדגימים כיצד לקבוע את הסף של נוירונים MVN על מנת להבטיח את הגירוי sinusoidal ו סטוכסטי הם תת הסף ומכאן, לקבוע את ההשפעות כי כל סוג של רעש יש על הרווח העצבי MVN. אנו מראים כי sinusoidal הסף ואת הרעש סטוכסטי יכול לווסת את הרגישות של נוירונים בודדים ב MVN מבלי להשפיע על שיעורי ירי בסיס.

Introduction

מערכת שיווי המאזניים (או איזון) שולטת בתחושת האיזון שלנו על-ידי שילוב של מידע שמיעתי, בעלי מראה מסוחושי וחזותי. השפלה של מערכת שיווי המאזניים הוצגה כפונקציה של הגיל והיא עלולה לגרום לשיווי משקל^1,2. עם זאת, טיפולים המכוונים לתפקוד מערכת השמיעה הם נדירים.

גירוי באוזן הגלותי (gvs) הוכח לשפר את צעדי האיזון, התפקוד האוטונומי ושיטות החישה האחרות בתוך בני אדם^3,4,5,6. שיפורים אלה אמורים להיות בשל תופעת התהודה הסטוכסטית (SR), שהיא העלייה בזיהוי אותות חלשים יותר במערכות שאינן לינאריות דרך היישום של רעש תת-הסף^7,8. מחקרים אלה הראו שיפורים^{סטטי 9,10} ו^{דינמי 11,12} איזון, ובדיקות פלט שיווי משקל כגון גליל הדלפק (OCR)¹³. עם זאת, רבים של מחקרים אלה השתמשו צירופים שונים של פרמטרים הגירוי כגון רעש לבן⁹, רעש צבעוני¹³, שונים תדירות הגירוי טווחים וטכניקות סף. לכן, פרמטרי גירוי אופטימליים נשארים בלתי ידועים ופרוטוקול זה יכול לסייע בקביעת הפרמטרים היעילים ביותר. מלבד הגירוי פרמטרים, סוג של גירוי חשוב גם ביעילות טיפולית וניסויית. העבודה לעיל בבני אדם בוצעה באמצעות גירויים רעש חשמלי, בעוד הרבה של vivo בעלי חיים בעבודה השתמשו מכני^14,15 או אלקטרואופטיקה¹⁶ גירויים רעש. פרוטוקול זה ישתמש ברעש חשמלי כדי לבחון את ההשפעות על גרעיני השמיעה.

בעבר, היישום של gvs לעורר שיווי מעיים העיקרי afferents בוצעה ב vivo בקופי סנאי¹⁷, שינשילות¹⁸, עוברי עוף¹⁵ ושרקנים¹⁴. עם זאת, רק שניים ממחקרים אלה בדק את האפקט gvs יש על הרווח של שיווי המשקל הראשי afferents^14,15. ניסויים אלו בוצעו בvivo כלומר, לא ניתן לקבוע את דפוסי הגירוי המדויקים המוטלים על גרעיני השמיעה. לידיעתך, רק מחקר אחד נוסף החלה רעש סטוכסטי לנוירונים בודדים אנזימטי הפרעות במערכת העצבים המרכזית¹⁹. עם זאת, ניסויים לא בוצעו בתוך הגרעין המרכזי שיווי הבמה כדי להעריך את הפרמטרים המתאימים גירוי וטכניקות סף, מה שהופך את הפרוטוקול הזה מדויק יותר בקביעת השפעות גירוי על נוירונים בודדים בתוך הפרוזדור גרעינים.

כאן, אנו מתארים כיצד להחיל sinusoidal ו סטוכסטי (חשמל) רעש ישירות לנוירונים בודדים בגרעין הפרוזדור המדיאלי (MVN), לקבוע סף עצבי ולמדוד שינויים רווח/רגישות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הפרוטוקולים הניסיוניים שתוארו אושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של אוניברסיטת סידני (מספר פרוטוקול שאושר: 2018/1308).

1. בעלי חיים

הערה: עכברים הושגו ממרכז המכרסמים האוסטרלי (ARC; פרת ', אוסטרליה) והתקיימה בבניין הקרן הרפואי בניין בעלי חיים באוניברסיטת סידני.

1. לשמור על העכברים על מחזור רגיל 12 שעות אור/כהה עם העשרה סביבתית.
2. השימוש זכר ונקבה C57BL/6 עכברים (3 – 5 שבועות בן) עבור כל הניסויים.

2. הכנת פתרונות

1. להכין 1 L של נוזל שדרתי מלאכותי (ACSF) מורכב 29 מ"מ נחקו₃, 11 מ"מ גלוקוז, 120 מ"מ הנאל, 3.3 Mm kcl, 1.4 mm נה₂PO₄, 2.2 mm Mgcl₂, 2.77 mm cacl₂.
2. להכין 200 mL של סוכרוז-ACSF (sACSF) המכיל 29 מ"מ נחקו₃, 11 מ"מ גלוקוז, 241.5 mm סוכרוז, 3.3 Mm kcl, 1.4 mm נה₂PO₄, 2.2 mm Mgcl₂, 2.77 mm cacl₂. לפני הכללת CaCl₂ כדי acsf ו sacsf, גז את הפתרונות עם קרבוסג'ן (95% O₂ ו 5% CO₂) כדי להקים pH של 7.4 ולהימנע משקעים בסידן (בעכירות).
3. הכנת K⁺מבוססי פתרון תאיים מורכב מ70 מילימטר אשלגן, 70 Mm kcl, 2 מ"מ היאl, 10 מ"מ hepes, 4 מ"מ egta, 4 מ ג Mg₂-ATP, 0.3 mM Na₃-gtp; עם pH הסופי של 7.3 (מותאם באמצעות KOH).
   הערה: מומלץ לסנן פתרונות תאיים עם מסנני 0.22 יקרומטר ולאחסן 0.5 mL התשובה של הפתרון ב-20 ° c.

3. הכנת גזע המוח

1. לפני החילוץ המוח, באמצעות המחקר באמצעות קרבוגן וקריר ב-80 ° c עבור 25 דקות, כך בנוי קרח.
2. הרדים את העכבר עם isofלוריאן (3 – 5%) רווי חמצן (3 מ ל לדקה). לאחר הרפלקסים האחוריים האחוריות נעדרים, ערוף את ראשו של העכבר עם מספריים חד נירוסטה חדה.
3. לחשוף את הגולגולת על ידי ביצוע חתך משונן בעור באמצעות להב תער (#22 מעוגל).
4. באמצעות הקצה המחודד של זוג מספריים סטנדרטיים דפוס לעשות חתך קטן על למדא ולחתוך לאורך הקרע האורך.
5. בזהירות לשקף את העצמות הקודקודית ואת עצמות העורף באמצעות זוג העיקול הרדוד פירסון.
   הערה: במהלך כל ההליך הזה המוח הוא התרחץ באופן רציף באתרו באמצעות בעבר הכין קרח קר מאוד-sACSF.
6. לבודד את גזע המוח מהמוח הקדמי ואת מעטפת הגרמית שלו באמצעות להב תער (#11 ישר) כדי לחתוך את העורף parieto-ובתוך לשד caudal.
7. הר המוח מבודד גזע הקצה למטה על בלוק בעבר בלוקים פוליסטירן מוקצף. הסרת נוזל עודף סביב רקמת ביתור עם פתיל של נייר טישו כדי להבטיח הדבקה טובה רקמת לשלב החיתוך.
   הערה: בלוק הפוליסטירן נחתך בצורה של טרפז, על מנת להבטיח את הrostral של קצה המוח האמצעי ומתאים לחוט השדרה.
8. השתמש דבק ציאנואקרילי לתקן את בלוק פוליסטירן עם גזע המוח המצורפת rostral end עד לשלב חיתוך.
9. באמצעות מהירות מראש של 0.16 מ"מ/s ורטט משרעת של 3.00 מ"מ, להכין 200 יקרומטר פרוסות רוחבי של mvn.
   הערה: מיקום ה-MVN נקבע על ידי שימוש באטלס המוח העכבר Paxinos ופרנקלין (דמויות 79 – 89)²⁰. MVN (המפורטים בתור Mvn ב אטלס) שוכנת מיד ונטה אל חדר החדר^הרביעי והוא הגדול ביותר לפני ההחזקה של המוח הקצר (בין הקוליקולאני הנחות ו-obex).
10. השתמש בפיפטה פלסטיק גזוז כדי להעביר פרוסות אל דיסק נייר סינון בישיבה ב-ACSF ב-25 ° c לפחות 30 דקות לפני ההקלטה.

4. כלי נגינה

1. השתמש בכיוונון אלקטרולוגי סטנדרטי כדי לבצע שיטות מלחציים לתיקון תאים שלמים²¹.
2. הכנת מיקרופיפטות באמצעות פרוטוקול בן שני שלבים (מחממים שלב 1:70; חום שלב 2:45) על פולר מיקרופיפטה (ראו טבלת חומרים). מיקרופיפטות צריכות להיות התנגדות סופית של 3 – 5 MΩ עם פתרון פנימי כאשר מניחים באמבטיה.
   הערה: הגדרות שנעשה בהן שימוש עשויות להשתנות בהתאם לטמפרטורה בתוך החדר ויכולות להשתנות לעתים תכופות.

5. התיקון השלם תא מהדק אלקטרופיזיולוגיה

1. כדי להשיג הקלטות מהדק התיקון השלם מפני נוירונים בודדים ב-MVN, פתרון פנימי מבוסס K⁺משמש בתוך ההקלטה.
2. להעביר פרוסת רקמה אחת מחדר הדגירה אל חדר ההקלטה ולאבטח את הפרוסה באמצעות חוט ניילון על משקל בצורת U. מטפל באופן רציף בחדר ההקלטה עם קרבוגנated-ACSF ב -25 ° c בקצב זרימה של 3 מ ל/דקה.
3. לאחר מילוי מיקרופיפטה עם פתרון פנימי, אתר את MVN באמצעות עדשת מטרה נמוכה (10x). שימוש במטרה גבוהה (40x) מטרה, נוירונים בודדים בתוך MVN ניתן לאתר.
   הערה: איכות התא חיונית להבטחת הקלטות ועמידות האיכות של התא בעת ניסיון להשיג את תצורת התאים השלמה. תא טוב יהיה להפגין צורה כדורית, קרום התא רפלקטיבי וגרעין בלתי נראה. תא רע יהיה גרעין גלוי גדול (כמו ביצה) ומראה נפוח/צומק.
4. לפני הפרת הרקמה עם הפיפטה, יש למרוח כמות קטנה של לחץ חיובי כדי לדחוף את הפסולת מקצה הפיפטה.
5. הזיזו את הפיפטה בעזרת המיקרומניפולציה לכיוון תא העצב הנבחר וגומת הקטן צריכים להיווצר על הקרום העצבי. שחררו לחץ חיובי והפעילו כמות קטנה של לחץ שלילי.
6. לאחר השגת GΩ 1, הפעילו לחץ חיובי קצר ועדין למחזיק הפיפטה דרך יציאת היניקה כדי לקרוע את הקרום וליצור תצורה של תא שלם.
7. לעשות הקלטות קלאמפ הנוכחי שלמות באמצעות טכניקות סטנדרטיות^21,22.

6. החלת Sinusoidal ורעש סטוכסטי כדי הפרט האמצעי המדילי השיווי גרעין נוירונים

1. החל את הרעש הסטוכסטי והsinusoidal במגוון רחב של המוני מ -3 עד 24 שעות לקביעת הסף העצבי וקצב הירי.
2. קבעו את סף החישה באמצעות קיבוץ עוצמות הגירוי הנמוכות והגבוהות יותר ובצעו ANOVA להתבונן בכל הבדלים (כפי שמוצג באיור המשלים 1).
3. לחשב את שיעור הירי הממוצע במהלך 10 s שבו את הצעד הנוכחי ביטול הקיטוב היה/יהיה מוזרק עבור כל הרמה הנוכחית בודדת (כלומר, 7 פרקים סה כ; איור 1).
4. השתמש בערכי קצב הירי הממוצעים כדי ליצור שיעור ירי לעומת ההתוויה הנוכחית ולבצע ניתוח רגרסיה ליניארית כדי לקבוע את הדרגה של קו ההתאמה המיטבית. הדרגה של קו ההתאמה הטובה ביותר מעידה על הרווח העצבי²².

איור 1: פרופילים של שליטה, מsinusoidal ופרוטוקולי רעש סטוכסטיים. (א) שליטה (לא רעש) פרוטוקולים להחיל על mvn נוירונים. (ב) Sinusoidal בפרוטוקול רעש עם תדר של 2 hz. (ג) הפרוטוקולים סטוכסטיים שבהם רוב ספקטרום הכוח הוא ≤ 2 hz. כל פרוטוקול המוצג כאן יש משרעת של ± 6 pA עם 10 s הקטפולזציה הנוכחית גדל על ידי 10 pA עד 50 pA. הגירוי האמיתי אין הצעד הנוכחי הקיטוב ולכן הפרק הראשון של פרוטוקולים אלה כדי לקבוע שינויים עצביים לצבור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הקלטות ראשוניות יכול לספק מידע על ההשפעות שsinusoidal והרעש סטוכסטי יש על שיעורי ירי בסיס של נוירונים MVN בודדים וכיצד גירויים אפקט הרווח של נוירונים. איור 2 מראה כי לא רעש sinusoidal או סטוכסטי שינוי שיעורי ירי בסיס של נוירונים mvn כאשר לעומת שליטה (אין רעש) הקלטות. מידע זה חי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ההשפעות של גירוי שיווי הגוף הגלווני (gvs) על מערכת השמיעה היתה מודגשת בשנת vivo בבני אדם^3,13,23, שרקנים¹⁴, מכרסמים¹⁸ ו פרימטים לא אנושיים²⁴. עם זאת, אף אחד ממחקרים אלה העריכו את ההשפעה הישירה של רעש חשמלי על הרג...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl	Scharlau	CA01951000	Used for ACSF and sACSF
D-(+)-Glucose	Sigma	G8270	Used for ACSF and sACSF
EGTA	Sigma	E0396-25G	Used for K-based intracellular solution
HEPES	Sigma	H3375-25G	Used for K-based intracellular solution
KCl	Chem-supply	PA054-500G	Used for ACSF, sACSF and intracellular solution
K-gluconate	Sigma	P1847-100G	Used for K-based intracellular solution
Mg-ATP	Sigma	A9187-500MG	Used for K-based intracellular solution
MgCl	Chem-supply	MA00360500	Used for ACSF and sACSF
Na3-GTP	Sigma	G8877-100MG	Used for K-based intracellular solution
NaCl	Chem-supply	SO02270500	Use for ACSF and intracellular solution
NaH2PO4•2H2O	Ajax	AJA471-500G	Used for ACSF and sACSF
NaHCO3	Sigma	S5761-1KG	Used for ACSF and sACSF
Sucrose	Chem-supply	SA030-500G	Used for sACSF
Isoflurane	Henry Schein	1169567762	Used for anaesthetising mice
EQUIPMENT
Borosilicate glass capillaries	Warner instruments	GC150T-7.5	1.5 mm OD, 1.16 mm ID, 7.5 cm length
Data acquisition software	Axograph		Used for electrophysiology and analysis
Friedmen-Pearson Rongeurs	World precision instruments	14089	Used for dissection
Micropipette puller	Narishige	PP-830	Used for micropipette
Multiclamp amplifier	Axon instruments	700B	Used for electrophysiology
pH meter	Sper scientific	860033	Used for internal solution
Standard pattern scissors	FST	14028-10	Used for dissection
Sutter micromanipulator	Sutter	MP-225/M	Used for electrophysiology
Upright microscope	Olympus	BX51WI	Used for electrophysiology
Vibratome	Leica	VT1200	Used for slicing brain tissue