Aplicação do ruído estocástico para avaliação da sensibilidade do Neuron do núcleo vestibular medial in vitro

Resumo

A estimulação vestibular Galvanic nos seres humanos exibe melhorias na função vestibular. No entanto, não se sabe como esses efeitos ocorrem. Aqui, nós descrevemos como aplicar o ruído elétrico sinusoidal e estocástico e avaliar amplitudes apropriadas do estímulo em neurônios vestibular medial individuais do núcleo no rato C57BL/6.

Resumo

A estimulação vestibular Galvanic (GVS) foi mostrada para melhorar medidas do contrapeso nos indivíduos com contrapeso ou prejuízos vestibulares. Este é proposto para ser devido ao fenômeno da ressonância estocástica (SR), que é definido como a aplicação de um estímulo de baixo nível/sublimiar a um sistema não-linear para aumentar a deteção de sinais mais fracos. No entanto, ainda é desconhecido como o SR apresenta seus efeitos positivos sobre o equilíbrio humano. Esta é uma das primeiras manifestações dos efeitos do ruído sinusoidal e estocástico em neurônios individuais. Usando a electrofisiologia da braçadeira de remendo da todo-pilha, o ruído sinusoidal e estocástico pode ser aplicado diretamente aos neurônios individuais no núcleo vestibular medial (MVN) de C57Bl/6 ratos. Aqui nós demonstramos como determinar o limiar dos neurônios MVN, a fim de garantir que os estímulos sinusoidais e estocásticos são sublimiares e, a partir disso, determinar os efeitos que cada tipo de ruído tem sobre o ganho neuronal MVN. Nós mostramos que o ruído sinusoidal e estocástico do subthreshold pode modular a sensibilidade de neurônios individuais no MVN sem afetar taxas de acendimento basais.

Introdução

O sistema vestibular (ou equilíbrio) controla nosso senso de equilíbrio integrando informações auditivas, proprioceptivas, somatossensoriais e visuais. A degradação do sistema vestibular tem demonstrado ocorrer em função da idade e pode resultar em déficits de equilíbrio^1,2. No entanto, as terapias direcionadas ao funcionamento do sistema vestibular são escassas.

A estimulação vestibular Galvanic (GVS) foi mostrada para melhorar medidas do contrapeso, funcionamento autonômico e outras modalidades sensoriais dentro dos seres humanos^3,4,5,6. Estas melhorias são ditas devido ao fenômeno da ressonância estocástica (Sr), que é o aumento na detecção de sinais mais fracos em sistemas não-lineares através da aplicação do ruído do sublimiar^7,8. Estes estudos mostraram melhorias nos testes estáticos de^9,10 e^11,12 dinâmicos e de saída vestibular, como o rolo de contador ocular (OCR)¹³. No entanto, muitos desses estudos utilizaram diferentes combinações de parâmetros de estímulo, como ruído branco⁹, ruído colorido¹³, diferentes faixas de frequência de estímulo e técnicas de limiarização. Conseqüentemente, os parâmetros óptimos do estímulo permanecem desconhecidos e este protocolo pode ajudar com determinar os parâmetros os mais eficazes. Além dos parâmetros de estímulo, o tipo de estímulo também é importante na eficácia terapêutica e experimental. O trabalho acima em humanos foi realizado por meio de estímulos de ruído elétrico, enquanto grande parte do trabalho animal in vivo utilizou estímulos de ruído mecânicos de^14,15 ou optogenéticos¹⁶ . Este protocolo usará o ruído elétrico para examinar os efeitos em núcleos vestibulares.

Anteriormente, a aplicação de GVS para estimular aferentes vestibulares primários foi realizada in vivo em macacos-esquilo¹⁷, chinchilas¹⁸, embriões de frango¹⁵ e cobaias¹⁴. Entretanto, apenas dois desses estudos examinaram o efeito que o GVS tem sobre o ganho de aferentes vestibulares primários^14,15. Esses experimentos foram realizados in vivo, o que significa que os padrões precisos de estimulação impostas aos núcleos vestibulares não podem ser determinados. A nosso conhecimento, somente um outro estudo aplicou o ruído estocástico aos neurônios enzymaticamente dissociados individuais no sistema nervoso central¹⁹. No entanto, não foram realizados experimentos nos núcleos vestibulares centrais para avaliar os parâmetros adequados de estímulo e as técnicas de limiarização, tornando este protocolo mais preciso na determinação dos efeitos do estímulo sobre os neurônios individuais dentro do vestibular Núcleos.

Aqui, nós descrevemos como aplicar o ruído sinusoidal e estocástico (elétrico) diretamente aos neurônios individuais no núcleo vestibular medial (MVN), determinar o limiar neuronal e medir mudanças no ganho/sensibilidade.

Protocolo

Todos os protocolos experimentais descritos foram aprovados pelo Comitê de ética animal da Universidade de Sidney (número de protocolo aprovado: 2018/1308).

1. os animais

Nota: Os camundongos foram obtidos do centro australiano de roedores (ARC; Perth, Austrália) e realizada na Fundação médica edifício animal Facility na Universidade de Sydney.

1. Mantenha os camundongos em um ciclo normal de luz/escuridão de 12 h com enriquecimento ambiental.
2. Use machos e fêmeas C57BL/6 camundongos (3 – 5 semanas de idade) para todos os experimentos.

2. preparação de soluções

1. Prepare 1 L de líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) composto por 29 mM NaHCO₃, 11 mm de glicose, 120 mm nacl, 3,3 mm kcl, 1,4 mm NaH₂po₄, 2,2 mM MgCl₂, 2,77 mm CAcl₂.
2. Prepare 200 mL de sacarose-ACSF (sACSF) contendo 29 mM de NaHCO₃, 11 mm de glicose, 241,5 mm de sacarose, 3,3 mm kcl, 1,4 mm NaH₂po₄, 2,2 mM MgCl₂, 2,77 mm CAcl₂. Antes da inclusão de CaCl₂ ao ACSF e ao sacsf, gás as soluções com Carbogen (95% o₂ e 5% co₂) para estabelecer um pH de 7,4 e para evitar a precipitação do cálcio (cloudiness).
3. Prepare a solução intracelular K⁺-based composta de 70 mm de gluconato de potássio, 70 mm KCl, 2 mm NaCl, 10 mm HEPES, 4 mm EGTA, 4 mm mg₂-ATP, 0,3 mm na₃-GTP; com um pH final de 7,3 (ajustado usando KOH).
   Nota: recomenda-se filtrar soluções intracelulares com filtros de 0,22 μm e armazenar alíquotas de 0,5 mL da solução a-20 ° c.

3. preparação do tronco cerebral

1. Antes da extração do tronco encefálico, equilibrar o sACSF com carbogénio e resfriar a-80 ° c por 25 min para que uma pasta de gelo seja formada.
2. Anestesiizar o rato com isoflurano (3 – 5%) saturado em oxigénio (3 mL/min). Uma vez que os reflexos patas traseiras estão ausentes, decapitar o mouse com tesouras de aço inoxidável afiada.
3. Expor o crânio, fazendo uma incisão sagital na pele usando uma lâmina de barbear (#22 arredondado).
4. Usando a ponta pontiaguda de um par de tesouras padrão fazer uma pequena incisão no lambda e cortar ao longo da fissura longitudinal.
5. Reflita cuidadosamente os ossos parietais emparelhados e os ossos occipitais usando um par de rongeurs de Pearson de curvatura rasa.
   Nota: Durante todo este procedimento, o cérebro é continuamente banhado in situ usando a pasta sACSF gelada previamente preparada.
6. Isole o tronco cerebral do prosencéfalo e sua carcaça óssea usando uma lâmina de barbear (#11 reto) para cortar o sulco parieto-occipital e na medula caudal.
7. Monte a extremidade ventral isolada do tronco encefálico para baixo em um bloco trapezoidal previamente cortado do poliestireno. Remova o excesso de fluido em torno do tecido dissecado com um pavio de papel tissue para garantir uma boa aderência do tecido ao estágio de corte.
   Nota: O bloco do poliestireno é cortado em uma forma trapezoidal, para assegurar a extremidade rostral dos ajustes e dos atarraxamentos do midbrain na medula espinal.
8. Use cola de cianoacrilato para fixar o bloco de poliestireno com a extremidade rostral anexado do tronco cerebral até o estágio de corte.
9. Usando uma velocidade de avanço de 0,16 mm/s e amplitude de vibração de 3, 0 mm, prepare as fatias transversais de 200 μm da MVN.
   Nota: A posição do MVN é determinada usando o Atlas do cérebro do rato de Paxinos e de Franklin (figuras 79 – 89)²⁰. O MVN (listado como MVE no Atlas) encontra-se imediatamente ventrolateral ao 4^º ventrículo e é o maior direito antes da fixação do cerebelo (entre o colículos inferior e o OBEX).
10. Use uma pipeta plástico-aparado para transferir fatias em um disco do papel de filtro que senta-se no ACSF carbogenated em 25 ° c por pelo menos 30 minutos antes da gravação.

4. instrumentos de

1. Use uma instalação electrofisiológica padrão para executar técnicas da braçadeira de remendo da todo-pilha²¹.
2. Prepare micropipetas usando um protocolo de duas etapas (etapa de calor 1:70; etapa de calor 2:45) em um extrator de micropipeta (consulte a tabela de materiais). As micropipetas devem ter uma resistência final variando de 3 – 5 MΩ com solução interna quando colocadas no banho.
   Nota: Os ajustes usados podem variar dependendo da temperatura dentro do quarto e podem mudar completamente freqüentemente.

5. electrofisiologia da braçadeira de remendo da inteiro-pilha

1. Para obter gravações de grampo de remendo de células inteiras de neurônios individuais na MVN, uma solução interna baseada em K⁺é usada dentro da pipeta de gravação.
2. Transfira uma única fatia de tecido da câmara de incubação para a câmara de gravação e fixe a fatia usando uma rosca de nylon em um peso em forma de U. Perfuse continuamente a câmara de gravação com carbogenated-ACSF em 25 ° c em uma taxa de fluxo de 3 mL/min.
3. Depois de encher uma micropipeta com solução interna, localize o MVN usando uma lente objetiva de baixa potência (10x). Usando um objetivo de alta potência (40x), os neurônios individuais dentro do MVN podem ser localizados.
   Nota: A qualidade da célula é essencial para garantir gravações de qualidade e durabilidade da célula ao tentar alcançar a configuração de célula inteira. Uma boa célula demonstrará forma esférica, uma membrana celular reflexiva e um núcleo invisível. Uma célula ruim terá um grande núcleo visível (ovo-like) e uma aparência inchada/encolhida.
4. Antes de violar o tecido com a pipeta, aplique uma pequena quantidade de pressão positiva para empurrar detritos para longe da ponta da pipeta.
5. Mova a pipeta usando o micromanipulador para o neurônio escolhido e uma pequena covinha deve formar-se na membrana neuronal. Libere a pressão positiva e aplique uma pequena quantidade de pressão negativa.
6. Uma vez que um selo de 1 GΩ é conseguido, aplique a pressão positiva curta e afiada delicada ao suporte da pipeta através da porta da sucção para romper a membrana e para criar uma configuração da todo-pilha.
7. Faça gravações da braçadeira da corrente da inteiro-pilha usando técnicas padrão^21,22.

6. aplicando ruído sinusoidal e estocástico a neurônios do núcleo vestibular medial individual

1. Aplique o ruído estocástico e sinusoidal em uma escala das amplitudes de 3 a 24 pA para determinar o limiar neuronal e a taxa de disparo.
2. Determine o limiar sensorial agrupando as intensidades de estímulo inferiores e maiores e realize uma ANOVA para observar quaisquer diferenças (como mostrado na Figura 1 suplementar).
3. Calcule a taxa média de disparo durante o período de 10 s em que a etapa de despolarização atual foi/será injetada para cada nível de corrente individual (ou seja, 7 episódios totais; Figura 1).
4. Use os valores médios de taxa de disparo para gerar uma taxa de disparo versus plotagem atual e executar uma análise de regressão linear para determinar o gradiente da linha de melhor ajuste. O gradiente da linha de melhor ajuste é indicativo do ganho neuronal²².

Figura 1: perfis diagramáticos de protocolos de controle, sinusoidal e ruído estocástico. (A) protocolos de controle (sem ruído) aplicados aos neurônios MVN. (B) protocolo de ruído sinusoidal com uma frequência de 2 Hz. (C) protocolos de ruído estocástico em que a maioria do espectro de potência é ≤ 2 Hz. Cada protocolo aqui apresentado tem uma amplitude de ± 6 pA com uma corrente de 10 s despolarizante aumentando em 10 pA até 50 pA. O verdadeiro estímulo não tem um passo de corrente despolarizante e, portanto, é o primeiro episódio desses protocolos para determinar as mudanças de ganho neuronal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

As gravações iniciais podem fornecer informações sobre os efeitos que o ruído sinusoidal e estocástico tem sobre as taxas de queima basal de neurônios MVN individuais e como os estímulos efetuam o ganho de neurônios. A Figura 2 mostra que nem sinusoidal nem ruído estocástico alteram as taxas de queima basal dos neurônios MVN quando comparadas às gravações de controle (sem ruído). Esta informação é crucial para determinar o limiar dos neurônios individu...

Discussão

Os efeitos da estimulação vestibular Galvanica (GVS) no sistema vestibular têm sido destacados in vivo em humanos^3,13,23, cobaias¹⁴, roedores¹⁸ e primatas não humanos²⁴. Entretanto, nenhum desses estudos avaliou o impacto direto do ruído elétrico na sensibilidade dos neurônios individuais no sistema vestibular. Aqui nós Demonstramos a primeira aplica...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl	Scharlau	CA01951000	Used for ACSF and sACSF
D-(+)-Glucose	Sigma	G8270	Used for ACSF and sACSF
EGTA	Sigma	E0396-25G	Used for K-based intracellular solution
HEPES	Sigma	H3375-25G	Used for K-based intracellular solution
KCl	Chem-supply	PA054-500G	Used for ACSF, sACSF and intracellular solution
K-gluconate	Sigma	P1847-100G	Used for K-based intracellular solution
Mg-ATP	Sigma	A9187-500MG	Used for K-based intracellular solution
MgCl	Chem-supply	MA00360500	Used for ACSF and sACSF
Na3-GTP	Sigma	G8877-100MG	Used for K-based intracellular solution
NaCl	Chem-supply	SO02270500	Use for ACSF and intracellular solution
NaH2PO4•2H2O	Ajax	AJA471-500G	Used for ACSF and sACSF
NaHCO3	Sigma	S5761-1KG	Used for ACSF and sACSF
Sucrose	Chem-supply	SA030-500G	Used for sACSF
Isoflurane	Henry Schein	1169567762	Used for anaesthetising mice
EQUIPMENT
Borosilicate glass capillaries	Warner instruments	GC150T-7.5	1.5 mm OD, 1.16 mm ID, 7.5 cm length
Data acquisition software	Axograph		Used for electrophysiology and analysis
Friedmen-Pearson Rongeurs	World precision instruments	14089	Used for dissection
Micropipette puller	Narishige	PP-830	Used for micropipette
Multiclamp amplifier	Axon instruments	700B	Used for electrophysiology
pH meter	Sper scientific	860033	Used for internal solution
Standard pattern scissors	FST	14028-10	Used for dissection
Sutter micromanipulator	Sutter	MP-225/M	Used for electrophysiology
Upright microscope	Olympus	BX51WI	Used for electrophysiology
Vibratome	Leica	VT1200	Used for slicing brain tissue