체외내 내측 전정 핵 신경 감도 평가를 위한 경상 시잡한 소음 응용 프로그램

요약

인간에 있는 갈바닉 전정 자극은 전정 기능에 있는 개선을 전시합니다. 그러나, 그것은 이러한 효과 발생 하는 방법을 알 수 없습니다. 여기서, 우리는 정현파 및 경위 전기 노이즈를 적용하는 방법을 설명하고 C57BL/6 마우스에서 개별 내측 전정 핵 뉴런에서 적절한 자극 진폭을 평가합니다.

초록

갈바닉 전정 자극 (GVS)는 균형 또는 전정 장애를 가진 개인의 균형 측정을 개선하는 것으로 나타났습니다. 이는 약한 신호의 검출을 증가시키기 위해 비선형 시스템에 낮은 레벨/서브임계값 자극의 적용으로 정의되는 sR(sR) 현상에 기인하는 것으로 제안된다. 그러나, 그것은 여전히 알 수 없는 어떻게 SR 인간의 균형에 그것의 긍정적인 효과 전시. 이것은 개별 뉴런에 대한 정현제 및 경층 잡음의 효과의 첫 번째 데모 중 하나입니다. 전체 세포 패치 클램프 전기 생리학을 사용하여, 정현파 및 경위 잡음은 C57BL/6 마우스의 내측 전정 핵(MVN)의 개별 뉴런에 직접 적용될 수 있다. 여기서 우리는 정현부 및 경위 자극이 서브 임계값임을 보장하기 위해 MVN 뉴런의 임계값을 결정하는 방법을 설명하고, 이로부터, 각 유형의 노이즈가 MVN 뉴런 이득에 미치는 영향을 결정합니다. 우리는 서브 임계값 정현부 및 경위 잡음이 기저 발사 속도에 영향을 미치지 않고 MVN에서 개별 뉴런의 민감도를 조절할 수 있음을 보여줍니다.

서문

전정 (또는 균형) 시스템은 청각, proprioceptive, 체감각 및 시각 정보를 통합하여 균형의 감각을 제어합니다. 전정 시스템의 열화는 연령의 함수로 발생하는 것으로 나타났으며 균형 적자^1,2. 그러나, 전정 시스템의 기능을 표적으로 하는 치료는 부족합니다.

갈바닉 전정 자극 (GVS)은 인간 3,^4,5,6내의 균형 측정, 자율 기능 및 기타 감각 적 양상을 개선하는 것으로 나타났습니다. 이러한 개선은 서브임계값 노이즈^7,8의적용을 통해 비선형 시스템에서 약한 신호의 검출이 증가하는 SR(SR) 현상에 기인한다고 한다. 이러한 연구는 정적^9,10 및 동적^11,12 균형, 및 안구 카운터 롤 (OCR)^13과같은 전정 출력 테스트에서 개선을 보여 주었다. 그러나, 이러한 연구의 대부분은 백색 잡음 9, 착색된 잡음^13,다른 자극 주파수 범위 및 임계 값 기술과 같은 자극 매개 변수의 다른 조합을 사용했다. 따라서 최적의 자극 파라미터는 알 수 없으며 이 프로토콜은 가장 효과적인 파라미터를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 자극 매개 변수 외에도 자극의 유형은 치료 및 실험 효능에도 중요합니다. 인간에서 위의 작업은 전기 소음 자극을 사용하여 수행되었으며, 생체 내 동물 작업의 대부분은 기계적^14,15 또는 광유전학¹⁶ 노이즈 자극을 사용했습니다. 이 프로토콜은 전기 노이즈를 사용하여 전정 핵에 미치는 영향을 검사합니다.

이전에는 1차 전정구를 자극하는 GVS를 다람쥐 원숭이^17,친칠라스^18,닭배아¹⁵ 및 기니피그^14에서생체 내에서 실시하였습니다. 그러나, 이 연구 결과의 단지 2개는 GVS가 1차 전정 구심점^14,15의이득에 있는 효력을 검토했습니다. 이러한 실험은 전정 핵에 부과된 정확한 자극 패턴을 결정할 수 없다는 것을 의미하는 생체 내에서 수행되었다. 우리의 지식에, 단 하나의 다른 연구는 중추 신 경계에 개별 효소 해리 뉴런에 경위 잡음을 적용^{했다 19.} 그러나, 적절한 자극 파라미터 및 임계값 기술을 평가하기 위해 중앙 전정 핵에서 실험이 수행되지 않았으며, 전정 내의 개별 뉴런에 대한 자극 효과를 결정하는 데 있어 이 프로토콜을 보다 정확하게 만듭니다. 핵.

여기에서는 내측 전정 핵(MVN)의 개별 뉴런에 정현부 및 경위(전기) 노이즈를 직접 적용하고, 뉴런 임계값을 결정하고, 게인/감도의 변화를 측정하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

설명된 모든 실험 프로토콜은 시드니 동물 윤리 위원회(승인된 프로토콜 번호: 2018/1308)에 의해 승인되었습니다.

1. 동물

참고: 마우스는 오스트레일리아 설치류 센터(ARC;;) 퍼스, 오스트레일리아) 시드니 대학의 의료 재단 건물 동물 시설에서 개최.

1. 환경 농축과 정상적인 12 시간 빛 / 어두운 주기에 마우스를 유지합니다.
2. 모든 실험에 남성 및 여성 C57BL/6 마우스(3-5주)를 사용하십시오.

2. 솔루션 준비

1. 29 mM NaHCO_3,11 mM 포도당, 120 mM NaCl, 3.3 mM KCl, 1.4 mM NaH₂PO_4,2.2 mM MgCl_2,2.77 mM CaCl_2로구성된 인공 뇌척수액 (ACSF) 1 L을 준비하십시오.
2. 29 mM NaHCO 3, 11 mM 포도당, 241.5mM KCl, 3.3 mM KCl, 1.4 mM NaH₂PO_4,2.2 mM MgCl_2,2.77 mM CaCl_2를포함하는 자당 ACSF (sACSF)의 200 mL를 준비하십시오. ACSF 및 sACSF에 CaCl_2를 포함하기 전에, 7.4의 pH를 확립하고 칼슘 침전 (흐림)을 피하기 위해 카보겐 (95 % O₂ 및 5 % CO2)으로 용액을 가스.
3. 70 mM 칼륨 글루코네이트, 70 mM KCl, 2 mM NaCl, 10 mM HEPES, 4 mM EGTA, 4 mM Mg₂-ATP, 0.3 mM Na₃-GTP로 구성된 K⁺기반 세포 내 용액을 준비; 최종 pH는 7.3(KOH를 사용하여 조정).
   참고: 0.22 μm 필터로 세포내 용액을 필터링하고 용액의 0.5mL aliquots를 -20°C에 저장하는 것이 좋습니다.

3. 뇌간 준비

1. 뇌간 추출 전에 sACSF를 카보겐과 평형화하고 얼음 슬러리가 형성되도록 -80 °C에서 25 분 동안 식힙니다.
2. 이소플루란으로 마우스를 마취 (3-5 %) 산소 (3 mL / 분)에서 포화. 뒷발 반사 신경이 없으면 날카로운 스테인레스 스틸 가위로 마우스를 참수하십시오.
3. 면도날(#22 둥근)을 사용하여 피부에 시상 절개를 하여 두개골을 노출시다.
4. 표준 패턴 가위 쌍의 뾰족한 끝을 사용하여 람다에서 작은 절개를하고 세로 균열을 따라 잘라냅니다.
5. 쌍이 짝을 이루는 정수리 뼈와 후두 뼈를 얕은 구부러진 피어슨 롱게르를 사용하여 조심스럽게 반사합니다.
   참고: 이 전체 절차 동안 뇌는 지속적으로 이전에 준비 된 얼음 차가운 sACSF 슬러리를 사용하여 자리에서 목욕된다.
6. 뇌간을 전뇌와 그 뼈에서 분리면도날(#11 스트레이트)를 사용하여 파리에토-문피탈 설커스를 잘라내고 꼬리 수질에서 분리합니다.
7. 이전에 절단 된 사다리꼴 폴리스티렌 블록에 고립 된 뇌간 복부 끝을 아래로 마운트합니다. 절단 단계에 좋은 조직 접착을 보장하기 위해 티슈 페이퍼의 심지로 해부 된 조직 주위의 과잉 유체를 제거하십시오.
   참고: 폴리스티렌 블록은 사다리꼴 모양으로 절단되어 중뇌의 로스트랄 끝이 척수에 맞고 테이퍼되도록합니다.
8. 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 부착된 뇌간 로스트랄 끝이 있는 폴리스티렌 블록을 절단 단계까지 고정합니다.
9. 0.16mm/s의 전진 속도와 3.00mm의 진동 진폭을 사용하여 MVN의 200 μm 횡단 슬라이스를 준비합니다.
   참고: MVN의 위치는 Paxinos 및 프랭클린 마우스 뇌 아틀라스 (도 79-89)^20을사용하여 결정된다. MVN (아틀라스에서 MVe로 나열)^즉시 4 심실에 뇌측에 놓여 있으며 소뇌의 부착 직전에 가장 큽니다 (열등한 콜리큘리와 obex 사이).
10. 플라스틱 트리밍 파이펫을 사용하여 25°C에서 25°C의 ACSF에 있는 필터 종이 디스크에 적어도 30분 동안 조각을 옮기자.

4. 악기

1. 표준 전기 생리학적 설정을 사용하여 전체 세포 패치클램프 기술(21)을 수행한다.
2. 마이크로파이펫 풀러에서 2단계 프로토콜(열 단계 1: 70; 열 단계 2:45)을 사용하여 마이크로파이펫을 준비합니다(재료 표참조). 마이크로파이펫은 욕조에 배치할 때 내부 용액으로 3-5MΩ에 이르는 최종 저항을 가져야 합니다.
   참고: 사용 설정은 실내 온도에 따라 다를 수 있으며 매우 자주 변경될 수 있습니다.

5. 전 세포 패치 클램프 전기 생리학

1. MVN의 개별 뉴런으로부터 전체 세포 패치 클램프 기록을 얻기 위해, K⁺기반 내부 용액은 기록 파이펫 내에서 사용된다.
2. 인큐베이션 챔버에서 단일 조직 슬라이스를 기록 챔버로 옮기고 U 자형 무게에 나일론 실을 사용하여 슬라이스를 고정합니다. 3 mL/min의 유량으로 25°C에서 카보겐화 ACSF로 기록 챔버를 지속적으로 정유합니다.
3. 마이크로파이펫을 내부 용액으로 채운 후 저전력(10x) 대물 렌즈를 사용하여 MVN을 찾습니다. 고전력(40x) 목표를 사용하여 MVN 내의 개별 뉴런을 위치시킬 수 있습니다.
   참고: 셀 품질은 전체 셀 구성을 달성하려고 할 때 셀의 품질 기록 및 내구성을 보장하는 데 필수적입니다. 좋은 세포는 구형 모양, 반사 세포막 및 보이지 않는 핵을 보여줍니다. 나쁜 세포는 큰 눈에 보이는 핵 (계란 같이) 및 부은/수축한 외관이 있을 것입니다.
4. 파이펫으로 조직을 위반하기 전에 소량의 양압을 가하여 파이펫 팁에서 이물질을 밀어 내보하십시오.
5. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피펫을 선택한 뉴런쪽으로 이동하고 작은 보조개가 뉴런 막에 형성되어야합니다. 양압을 해제하고 소량의 음압을 가합니다.
6. 1GΩ 씰이 달성되면 흡입 포트를 통해 피펫 홀더에 부드러운 짧고 날카로운 양압을 적용하여 멤브레인을 파열시키고 전체 셀 구성을 만듭니다.
7. 표준 기술^21,22를사용하여 전체 셀 전류 클램프 기록을 확인합니다.

6. 개별 내측 전정 핵 뉴런에 정현수 및 경위 노이즈 적용

1. 3에서 24 pA까지의 진폭 범위에서 경상 및 정현파 노이즈를 적용하여 뉴런 임계값과 발사 속도를 결정합니다.
2. 더 낮고 더 높은 자극 강도를 그룹화하여 감각 임계값을 결정하고 ANOVA를 수행하여 임의의 차이를 관찰합니다(보충 도1에 나타난 바와 같이).
3. 탈분극 전류 단계가 각 개별 전류 수준(즉, 총 7개 에피소드)에 대해 주입되는 10s 기간 동안의 평균 발사 속도를 계산합니다. 그림1).
4. 평균 발사 속도 값을 사용하여 현재 플롯과 비교하여 발사 속도를 생성하고 선형 회귀 해석을 수행하여 최적 맞춤 선의 그라데이션을 결정합니다. 가장 적합한 선의 그라데이션은 뉴런 게인^22를나타냅니다.

그림 1: 제어, 정현수 및 경위 노이즈 프로토콜의 도식 프로파일. (A) MVN 뉴런에 적용된 제어(노이즈 없음) 프로토콜. (B) 전력 스펙트럼의 대부분이 ≤2 Hz인 확률 노이즈 프로토콜은 2Hz의 주파수를 가진 정현파 노이즈 프로토콜입니다. 여기에 제시된 각 프로토콜은 ±6 pA의 진폭을 가지며 10s의 탈분극 전류는 최대 50 pA까지 10 pA씩 증가한다. 진정한 자극은 탈분극 전류 단계를 갖지 않으며 따라서 뉴런 이득 변화를 결정하기 위한 이러한 프로토콜의 첫 번째 에피소드이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

초기 기록은 정현부 및 경위 잡음이 개별 MVN 뉴런의 기저 발사 속도에 미치는 영향과 자극이 뉴런의 이득에 미치는 영향에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 도 2는 대조군(노이즈 없음) 기록과 비교할 때 Sinusoidal 또는 stochastic noise가 MVN 뉴런의 기저 발사 속도를 변화하지 않는다는 것을 보여줍니다. 이 정보는 개별 뉴런의 임계값을 결정하는 데 중요합니다. 인...

토론

전정 계에 대한 갈바닉 전정 자극(GVS)의 효과는 인간^3,13,23,기니피그^14,설치류¹⁸ 및 비인간 영장류(24)에서 생체 내에서 강조되었다. 그러나, 이러한 연구의 아무도 전정 시스템에 개별 뉴런의 감도전기 잡음의 직접적인 영향을 평가. 여기에서 우리는 개별 내측 전정 핵 (MVN) ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl	Scharlau	CA01951000	Used for ACSF and sACSF
D-(+)-Glucose	Sigma	G8270	Used for ACSF and sACSF
EGTA	Sigma	E0396-25G	Used for K-based intracellular solution
HEPES	Sigma	H3375-25G	Used for K-based intracellular solution
KCl	Chem-supply	PA054-500G	Used for ACSF, sACSF and intracellular solution
K-gluconate	Sigma	P1847-100G	Used for K-based intracellular solution
Mg-ATP	Sigma	A9187-500MG	Used for K-based intracellular solution
MgCl	Chem-supply	MA00360500	Used for ACSF and sACSF
Na3-GTP	Sigma	G8877-100MG	Used for K-based intracellular solution
NaCl	Chem-supply	SO02270500	Use for ACSF and intracellular solution
NaH2PO4•2H2O	Ajax	AJA471-500G	Used for ACSF and sACSF
NaHCO3	Sigma	S5761-1KG	Used for ACSF and sACSF
Sucrose	Chem-supply	SA030-500G	Used for sACSF
Isoflurane	Henry Schein	1169567762	Used for anaesthetising mice
EQUIPMENT
Borosilicate glass capillaries	Warner instruments	GC150T-7.5	1.5 mm OD, 1.16 mm ID, 7.5 cm length
Data acquisition software	Axograph		Used for electrophysiology and analysis
Friedmen-Pearson Rongeurs	World precision instruments	14089	Used for dissection
Micropipette puller	Narishige	PP-830	Used for micropipette
Multiclamp amplifier	Axon instruments	700B	Used for electrophysiology
pH meter	Sper scientific	860033	Used for internal solution
Standard pattern scissors	FST	14028-10	Used for dissection
Sutter micromanipulator	Sutter	MP-225/M	Used for electrophysiology
Upright microscope	Olympus	BX51WI	Used for electrophysiology
Vibratome	Leica	VT1200	Used for slicing brain tissue