Stochastische Lärmanwendung zur Beurteilung der medialen vestibulären Nukleus-Neuron-Empfindlichkeit in vitro

Zusammenfassung

Die galvanische vestibuläre Stimulation beim Menschen zeigt Verbesserungen in der vestibulären Funktion. Es ist jedoch nicht bekannt, wie diese Effekte auftreten. Hier beschreiben wir, wie man sinusförmiges und stochastisches elektrisches Rauschen aufträgt und geeignete Stimulusamplituden in einzelnen medialen vestibulären Nukleusneuronen in der C57BL/6-Maus auswertet.

Zusammenfassung

Es hat sich gezeigt, dass die galvanische vestibuläre Stimulation (GVS) die Gleichgewichtsmaße bei Personen mit Gleichgewichts- oder vestibulären Beeinträchtigungen verbessert. Dies wird aufgrund des Stochastischen Resonanzphänomens (SR) vorgeschlagen, das als Anwendung eines Low-Level-/Unterschwellenreizes auf ein nichtlineares System definiert ist, um die Erkennung schwächerer Signale zu erhöhen. Es ist jedoch noch nicht bekannt, wie SR seine positiven Auswirkungen auf das menschliche Gleichgewicht zeigt. Dies ist eine der ersten Demonstrationen der Auswirkungen von sinusförmigen und stochastischen Lärm auf einzelne Neuronen. Mit Hilfe der Ganzzell-Patchklemmenelektrophysiologie können sinusförmige und stochastische Geräusche direkt auf einzelne Neuronen im medialen vestibulären Kern (MVN) von C57BL/6-Mäusen angewendet werden. Hier zeigen wir, wie die Schwelle von MVN-Neuronen zu bestimmen, um sicherzustellen, dass die sinusförmigen und stochastischen Reize unterschwellig sind und daraus die Auswirkungen bestimmen, die jede Art von Rauschen auf den neuronalen Gewinn von MVN hat. Wir zeigen, dass unterschwelliges sinusförmiges und stochastisches Rauschen die Empfindlichkeit einzelner Neuronen im MVN modulieren kann, ohne die Basalfeuerraten zu beeinflussen.

Einleitung

Das vestibuläre (oder Gleichgewichts-)System steuert unseren Gleichgewichtssinn durch die Integration von auditiven, propriozeptiven, somatosensorischen und visuellen Informationen. Die Verschlechterung des vestibulären Systems hat sich als Funktion des Alters erwiesen und kann zu Gleichgewichtsdefiziten^1,2führen. Therapien, die auf das Funktionieren des vestibulären Systems abzielen, sind jedoch rar.

Galvanische Vestibuläre Stimulation (GVS) hat gezeigt, dass Balance-Maßnahmen zu verbessern, autonome Funktion und andere sensorische Modalitäten beim Menschen^3,4,5,6. Diese Verbesserungen sind angeblich auf das Phänomen der Stochastischen Resonanz (SR) zurückzuführen, das die Zunahme der Detektion schwächerer Signale in nichtlinearen Systemen durch die Anwendung von Unterschwellenrauschen^7,8ist. Diese Studien haben Verbesserungenbei statischen 9,¹⁰ und dynamischen^11,12 Balance- und vestibulären Ausgangstests wie Ocular Counter Roll (OCR)¹³gezeigt. Viele dieser Studien haben jedoch verschiedene Kombinationen von Stimulusparametern wie weißes Rauschen⁹, farbiges Rauschen¹³, verschiedene Stimulusfrequenzbereiche und Schwellenwerttechniken verwendet. Daher bleiben optimale Stimulusparameter unbekannt und dieses Protokoll kann bei der Bestimmung der effektivsten Parameter helfen. Neben Stimulusparametern ist die Art des Stimulus auch bei der therapeutischen und experimentellen Wirksamkeit wichtig. Die oben genannten Arbeiten beim Menschen wurden mit elektrischen Lärmreizen durchgeführt, während ein Großteil der in vivo Tierischen Arbeit mechanische^14,15 oder optogenetische¹⁶ Lärmreize verwendet hat. Dieses Protokoll wird elektrisches Rauschen verwenden, um die Auswirkungen auf vestibuläre Kerne zu untersuchen.

Zuvor wurde die Anwendung von GVS zur Stimulierung der primären vestibulären Afferents in vivo bei Eichhörnchenaffen¹⁷, Chinchillas¹⁸, Hühnerembryonen¹⁵ und Meerschweinchen¹⁴durchgeführt. Allerdings untersuchten nur zwei dieser Studien die Auswirkungen von GVS auf den Gewinn von primären vestibulären Afferents^14,15. Diese Experimente wurden in vivo durchgeführt, was bedeutet, dass die genauen Stimulationsmuster, die vestibulären Kernen auferlegt werden, nicht bestimmt werden können. Unserer Kenntnis nach hat nur eine andere Studie stochastisches Rauschen auf einzelne enzymatisch dissoziierte Neuronen im Zentralnervensystem angewendet¹⁹. Es wurden jedoch keine Experimente in den zentralen vestibulären Kernen durchgeführt, um geeignete Stimulusparameter und Schwellenwerttechniken zu bewerten, wodurch dieses Protokoll bei der Bestimmung der Stimuluseffekte auf einzelne Neuronen innerhalb der vestibulären Kerne.

Hier beschreiben wir, wie man sinusförmiges und stochastisches (elektrisches) Rauschen direkt auf einzelne Neuronen im medialen vestibulären Kern (MVN) aufträgt, die neuronale Schwelle bestimmt und Veränderungen der Gewinn-/Empfindlichkeit misst.

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Protokoll

Alle beschriebenen Experimentellen Protokolle wurden von der Animal Ethics Committee der University of Sydney genehmigt (genehmigte Protokollnummer: 2018/1308).

1. Tiere

HINWEIS: Mäuse wurden aus dem Australian Rodent Centre (ARC; Perth, Australien) und in der Medical Foundation Building Animal Facility der University of Sydney.

1. Halten Sie die Mäuse auf einem normalen 12 h Licht/Dunkel-Zyklus mit Umweltanreicherung.
2. Verwenden Sie männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse (3–5 Wochen alt) für alle Experimente.

2. Vorbereitung von Lösungen

1. Bereiten Sie 1 L künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) bestehend aus 29 mM NaHCO₃, 11 mM Glukose, 120 mM NaCl, 3,3 mM KCl, 1,4 mM NaH₂PO₄, 2,2 mM MgCl₂, 2,77 mM CaCl₂.
2. Bereiten Sie 200 ml Saccharose-ACSF (sACSF) mit 29 mM NaHCO₃, 11 mM Glukose, 241,5 mM Saccharose, 3,3 mM KCl, 1,4 mM NaH₂PO₄, 2,2 mM MgCl₂, 2,77 mM CaCl₂vor. Vor der Aufnahme von CaCl₂ in die ACSF und sACSF, Gas die Lösungen mit Carbogen (95 % O₂ und 5 % CO2 ), um einen pH-Wert von 7,4 zu etablieren und Kalziumfällung (Trübung) zu vermeiden.
3. Bereiten K⁺-basierte intrazelluläre Lösung bestehend aus 70 mM Kaliumgluconat, 70 mM KCl, 2 mM NaCl, 10 mM HEPES, 4 mM EGTA, 4 mM Mg₂-ATP, 0,3 mM Na₃-GTP; mit einem endgültigen pH-Wert von 7,3 (angepasst mit KOH).
   HINWEIS: Es wird empfohlen, intrazelluläre Lösungen mit 0,22 m Filtern zu filtern und 0,5 ml Aliquots der Lösung bei -20 °C zu speichern.

3. Vorbereitung des Brainstem

1. Vor der Hirnstammextraktion den sACSF mit Carbogen ausstatten und bei -80 °C 25 min abkühlen lassen, so dass eine Eisschlämme gebildet wird.
2. Anästhesisieren Sie die Maus mit Isofluran (3–5 %) sauerstoffgesättigt (3 ml/min). Sobald die Hinterpfotenreflexe fehlen, enthaupten Sie die Maus mit einer scharfen Edelstahlschere.
3. Setzen Sie den Schädel aus, indem Sie einen sagittalen Schnitt in der Haut mit einer Rasierklinge (#22 abgerundet) machen.
4. Mit dem spitzen Ende eines PaarStandard-Muster Schere machen einen kleinen Schnitt am Lambda und entlang der Längsspalte geschnitten.
5. Reflektieren Sie vorsichtig die gepaarten parietalen Knochen und die okzipitalen Knochen mit einem Paar flach-biegsamer Pearson-Rongeurs.
   HINWEIS: Während dieses gesamten Eingriffs wird das Gehirn kontinuierlich vor Ort mit der zuvor vorbereiteten eiskalten SACSF-Gülle gebadet.
6. Isolieren Sie den Hirnstamm aus dem Vorderhirn und seine knöcherne Ummantelung mit einer Rasierklinge (#11 gerade), um den parieto-okzipitalen Sulcus und an der kaudalen Medulla zu schneiden.
7. Montieren Sie das isolierte Brainstem ventrale Ende auf einem zuvor geschnittenen trapezförmigen Polystyrolblock. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit um das sezierte Gewebe mit einem Docht aus Gewebepapier, um eine gute Gewebehaftung an der Schneidstufe zu gewährleisten.
   HINWEIS: Der Polystyrolblock wird in trapezförmiger Form geschnitten, um sicherzustellen, dass das rostrale Ende des Mittelhirns in das Rückenmark passt und verjüngen.
8. Verwenden Sie Cyanoacrylatkleber, um den Polystyrolblock mit dem angeschlossenen Brainstem rostralen Ende bis zur Schnittstufe zu fixieren.
9. Bereiten Sie mit einer Vorgeschwindigkeit von 0,16 mm/s und einer Schwingungsamplitude von 3,00 mm 200 m Querscheiben des MVN vor.
   HINWEIS: Die Position des MVN wird mit dem Paxinos- und Franklin-Maus-Gehirnatlas (Abbildungen 79–89)²⁰bestimmt. Das MVN (im Atlas als MVe aufgeführt) liegt unmittelbar ventrolateral zum 4. Ventrikel und ist der größte direkt vor der Befestigung des Kleinhirns (zwischen dem minderwertigen Colliculi und dem Obex).
10. Verwenden Sie eine kunststoffbeschnittene Pipette, um Scheiben vor der Aufnahme mindestens 30 min lang in einem karbogenierten ACSF bei 25 °C zu übertragen.

4. Instrumente

1. Verwenden Sie ein elektrophysiologisches Standard-Setup, um ganzzellige Patchklemmen-Techniken durchzuführen²¹.
2. Bereiten Sie Mikropipetten mit einem zweistufigen Protokoll (Wärmeschritt 1: 70; Wärmeschritt 2: 45) auf einem Mikropipette-Puller vor (siehe Materialtabelle). Mikropipetten sollten einen Endwiderstand zwischen 3 und 5 M und interner Lösung aufweisen, wenn sie in das Bad gelegt werden.
   HINWEIS: Die verwendeten Einstellungen können je nach Temperatur im Raum variieren und können sich recht häufig ändern.

5. Ganzzellige Patchklemme Elektrophysiologie

1. Um Ganzzell-Patchklemmenaufnahmen von einzelnen Neuronen im MVN zu erhalten, wird innerhalb der Aufnahmepipette eine K +-basierte interne Lösung verwendet.
2. Übertragen Sie eine einzelne Gewebescheibe aus der Inkubationskammer in die Aufnahmekammer und sichern Sie die Scheibe mit einem Nylonfaden auf einem U-förmigen Gewicht. Kontinuierliche durchdringen die Aufnahmekammer mit Karbogenat-ACSF bei 25 °C bei einem Durchfluss von 3 ml/min.
3. Nachdem Sie eine Mikropipette mit interner Lösung gefüllt haben, lokalisieren Sie den MVN mit einer low power (10x) Objektivlinse. Mit einem Hochleistungsobjektiv (40x) können einzelne Neuronen innerhalb des MVN lokalisiert werden.
   HINWEIS: Die Zellqualität ist entscheidend, um die Qualität der Aufnahmen und die Haltbarkeit der Zelle zu gewährleisten, wenn sie versucht, die Ganzzellenkonfiguration zu erreichen. Eine gute Zelle zeigt sphärische Form, eine reflektierende Zellmembran und einen unsichtbaren Kern. Eine schlechte Zelle hat einen großen sichtbaren Kern (ei-like) und ein geschwollenes/geschrumpftes Aussehen.
4. Bevor Sie das Gewebe mit der Pipette durchbrechen, wenden Sie eine kleine Menge an positivem Druck an, um Schmutz von der Pipettenspitze wegzuschieben.
5. Bewegen Sie die Pipette mit dem Mikromanipulator in Richtung des gewählten Neurons und ein kleines Dimple sollte sich auf der neuronalen Membran bilden. Lassen Sie positiven Druck los und wenden Sie eine kleine Menge an Unterdruck an.
6. Sobald eine 1 G-Zoll-Dichtung erreicht ist, wenden Sie einen sanften kurzen und scharfen positiven Druck auf den Pipettenhalter durch den Sauganschluss an, um die Membran zu brechen und eine Ganzzellkonfiguration zu erstellen.
7. Machen Sie Ganzzellstromklemmenaufnahmen mit Standardtechniken^21,22.

6. Anwendung von sinusförmigem und stochastischem Rauschen auf einzelne mediale Vestibularnukleus Neuronen

1. Wenden Sie das stochastische und sinusförmige Rauschen bei einer Reihe von Amplituden von 3 bis 24 pA an, um die neuronale Schwelle und Die Feuerrate zu bestimmen.
2. Bestimmen Sie den sensorischen Schwellenwert, indem Sie niedrigere und höhere Stimulusintensitäten gruppieren, und führen Sie eine ANOVA durch, um Unterschiede zu beobachten (siehe Ergänzende Abbildung 1).
3. Berechnen Sie die durchschnittliche Abschussrate über den 10 s-Zeitraum, in dem der depolarisierende Stromschritt für jede einzelne aktuelle Stufe injiziert wurde/wird (d. h. 7 Gesamtepisoden; Abbildung 1).
4. Verwenden Sie die durchschnittlichen Brennrate-Werte, um eine Brennrate im Vergleich zum aktuellen Diagramm zu generieren, und führen Sie eine lineare Regressionsanalyse durch, um den Gradienten der Linie der besten Anpassung zu bestimmen. Der Gradient der Linie der besten Passung ist bezeichnend für den neuronalen Gewinn²².

Abbildung 1: Diagrammprofile von Steuerungs-, sinusförmigen und stochastischen Rauschprotokollen. (A) Kontrollprotokolle (kein Rauschen) werden auf MVN-Neuronen angewendet. (B) Sinusförmiges Rauschprotokoll mit einer Frequenz von 2 Hz. (C) Stochastische Rauschprotokolle, bei denen der größte Teil des Leistungsspektrums 2 Hz beträgt. Jedes hier vorgestellte Protokoll hat eine Amplitude von 6 pA mit einem Depolarisierungsstrom von 10 s, der um 10 pA bis zu 50 pA ansteigt. Der wahre Stimulus hat keinen depolarisierenden aktuellen Schritt und ist daher die erste Episode dieser Protokolle, um neuronale Gain-Änderungen zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Ergebnisse

Erste Aufnahmen können Informationen über die Auswirkungen liefern, die sinusförmiges und stochastisches Rauschen auf die Basalfeuerraten einzelner MVN-Neuronen haben und wie die Reize den Gewinn von Neuronen wirken. Abbildung 2 zeigt, dass weder sinusförmige noch stochastische Geräusche die Basalfeuerraten von MVN-Neuronen im Vergleich zu Kontrollaufzeichnungen (kein Rauschen) verändern. Diese Informationen sind entscheidend für die Bestimmung der Schwelle der ein...

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Diskussion

Die Auswirkungen der galvanischen vestibulären Stimulation (GVS) auf das vestibuläre System wurde in vivo beim Menschen hervorgehoben^3,13,23, Meerschweinchen¹⁴, Nagetiere¹⁸ und nicht-menschliche Primaten²⁴. Jedoch, keine dieser Studien haben die direkten Auswirkungen von elektrischem Rauschen auf die Empfindlichkeit der einzelnen Neuronen im vestibulären ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl	Scharlau	CA01951000	Used for ACSF and sACSF
D-(+)-Glucose	Sigma	G8270	Used for ACSF and sACSF
EGTA	Sigma	E0396-25G	Used for K-based intracellular solution
HEPES	Sigma	H3375-25G	Used for K-based intracellular solution
KCl	Chem-supply	PA054-500G	Used for ACSF, sACSF and intracellular solution
K-gluconate	Sigma	P1847-100G	Used for K-based intracellular solution
Mg-ATP	Sigma	A9187-500MG	Used for K-based intracellular solution
MgCl	Chem-supply	MA00360500	Used for ACSF and sACSF
Na3-GTP	Sigma	G8877-100MG	Used for K-based intracellular solution
NaCl	Chem-supply	SO02270500	Use for ACSF and intracellular solution
NaH2PO4•2H2O	Ajax	AJA471-500G	Used for ACSF and sACSF
NaHCO3	Sigma	S5761-1KG	Used for ACSF and sACSF
Sucrose	Chem-supply	SA030-500G	Used for sACSF
Isoflurane	Henry Schein	1169567762	Used for anaesthetising mice
EQUIPMENT
Borosilicate glass capillaries	Warner instruments	GC150T-7.5	1.5 mm OD, 1.16 mm ID, 7.5 cm length
Data acquisition software	Axograph		Used for electrophysiology and analysis
Friedmen-Pearson Rongeurs	World precision instruments	14089	Used for dissection
Micropipette puller	Narishige	PP-830	Used for micropipette
Multiclamp amplifier	Axon instruments	700B	Used for electrophysiology
pH meter	Sper scientific	860033	Used for internal solution
Standard pattern scissors	FST	14028-10	Used for dissection
Sutter micromanipulator	Sutter	MP-225/M	Used for electrophysiology
Upright microscope	Olympus	BX51WI	Used for electrophysiology
Vibratome	Leica	VT1200	Used for slicing brain tissue