Applicazione di rumore stocastico per la valutazione della sensibilità mediale del neurone del nucleo in vitro

Riepilogo

La stimolazione vestibolare galvanica nell'uomo presenta miglioramenti nella funzione vestibolare. Tuttavia, non è noto come si verificano questi effetti. Qui, descriviamo come applicare il rumore elettrico sinusoidale e stocastico e valutare le appropriate ampiezze di stimolo nei singoli neuroni del nucleo vestibolare mediale nel topo C57BL/6.

Abstract

La stimolazione vestibolare galvanica (GVS) ha dimostrato di migliorare le misure di equilibrio negli individui con deficit di equilibrio o vestibolare. Ciò è stato proposto per essere dovuto al fenomeno di risonanza stocastica (SR), che è definito come l'applicazione di uno stimolo di basso livello / sottosoglia a un sistema non lineare per aumentare il rilevamento dei segnali più deboli. Tuttavia, non è ancora noto come la SR mostri i suoi effetti positivi sull'equilibrio umano. Questa è una delle prime dimostrazioni degli effetti del rumore sinusoidale e stocastico sui singoli neuroni. L'utilizzo di elettrofisiologia a morsetto a morsetto a tutta cellula, il rumore sinusoidale e stocastico può essere applicato direttamente ai singoli neuroni nel nucleo vestibolare mediale (MVN) dei topi C57BL/6. Qui dimostriamo come determinare la soglia dei neuroni MVN al fine di garantire che gli stimoli sinusoidali e stocastici siano sottosoglia e da questo, determinare gli effetti che ogni tipo di rumore ha sul guadagno neuronale MVN. Mostriamo che il rumore sinusoidale e stocastico sottosoglia può modulare la sensibilità dei singoli neuroni nel MVN senza influenzare i tassi di cottura basale.

Introduzione

Il sistema vestibolare (o equilibrio) controlla il nostro senso dell'equilibrio integrando informazioni uditive, propriocettive, somatosensoriali e visive. È stato dimostrato che la degradazione del sistema vestibolare si verifica in funzione dell'età e può comportare disavanzi di bilancio^1,2. Tuttavia, le terapie che mirano al funzionamento del sistema vestibolare sono scarse.

Galvanic Vestibular Stimulation (GVS) ha dimostrato di migliorare le misure di equilibrio, il funzionamento autonomo e altre modalità sensoriali all'interno di esseri umani^3,4,5,6. Si dice che questi miglioramenti siano dovuti al fenomeno risonanza stocastica (SR), che è l'aumento del rilevamento di segnali più deboli nei sistemi non lineari attraverso l'applicazione di rumore sottosoglia^7,8. Questi studi hanno mostrato miglioramenti nei test statici^9,10 e dinamici^11,12 di bilanciamento e nei test di output vestibolare come Ocular Counter Roll (OCR)¹³. Tuttavia, molti di questi studi hanno utilizzato diverse combinazioni di parametri di stimolo come il rumore bianco⁹, rumore colorato¹³, diverse gamme di frequenza di stimolo e tecniche di soglia. Pertanto, i parametri di stimolo ottimali rimangono sconosciuti e questo protocollo può aiutare a determinare i parametri più efficaci. Oltre ai parametri di stimolo, il tipo di stimolo è importante anche nell'efficacia terapeutica e sperimentale. Il lavoro di cui sopra negli esseri umani è stato eseguito utilizzando stimoli di rumore elettrico, mentre gran parte del lavoro animale in vivo ha utilizzato stimoli meccanici^14,15 o optogenetici¹⁶ rumore. Questo protocollo utilizzerà il rumore elettrico per esaminare gli effetti sui nuclei vestiboli.

In precedenza, l'applicazione di GVS per stimolare gli afferenti vestiboli primari era stata eseguita in vivo nelle scimmie scoiattolo¹⁷, cincillà¹⁸, embrioni di pollo¹⁵ e porcellini d'India¹⁴. Tuttavia, solo due di questi studi hanno esaminato l'effetto che GVS ha sul guadagno degli afferenti vestiboliprimari primari^14,15. Questi esperimenti sono stati eseguiti in vivo, il che significa che non è possibile determinare i modelli precisi di stimolazione imposti ai nuclei vestibolici. A nostra conoscenza, solo un altro studio ha applicato il rumore stocastico ai singoli neuroni enzimaticamente dissociati nel sistema nervoso centrale¹⁹. Tuttavia, non sono stati effettuati esperimenti nei nuclei vestiboliri centrali per valutare i parametri di stimolo appropriati e le tecniche di soglia, rendendo questo protocollo più preciso nel determinare gli effetti di stimolo sui singoli neuroni all'interno del vestibolare Nuclei.

Qui, descriviamo come applicare il rumore sinusoidale e stocastico (elettrico) direttamente ai singoli neuroni nel nucleo vestibolare mediale (MVN), determinare la soglia neuronale e misurare i cambiamenti nel guadagno/sensibilità.

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Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali descritti sono stati approvati dal Comitato Etico Animale dell'Università di Sydney (numero di protocollo approvato: 2018/1308).

1. Animali

NOT: I topi sono stati ottenuti dall'Australian Rodent Centre (ARC; Perth, Australia) e si è tenuto presso la Medical Foundation Building Animal Facility presso l'Università di Sydney.

1. Mantenere i topi su un normale ciclo di luce/buio da 12 h con arricchimento ambientale.
2. Utilizzare topi C57BL/6 maschi e femmine (3-5 settimane) per tutti gli esperimenti.

2. Preparazione delle soluzioni

1. Preparare 1 L di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) composto da 29 mM NaHCO₃, 11 mM di glucosio, 120 mM NaCl, 3,3 mM KCl, 1,4 mM NaH₂PO₄, 2,2 mM MgCl₂, 2,77 mM CaCl₂.
2. Preparare 200 mL di saccarosio-ACSF (sACSF) contenente 29 mM NaHCO₃, glucosio di 241,5 mM, 3,3 mM di KCl, 1,4 mM NaH₂PO₄, 2,2 mM MgCl₂, 2,77 mM CaCl₂. Prima dell'inclusione di CaCl₂ nell'ACSF e nella sACSF, gas aree di macchina con carbogeno (95 % O₂ e 5 % CO₂₎per stabilire un pH di 7,4 ed evitare la precipitazione di calcio (nuvolosità).
3. Preparare la soluzione intracellulare basata su^K,composta da glucona di potassio da 70 mM, 70 mM KCl, 2 mM NaCl, 10 mM HEPES, 4 mM EGTA, 4 mM Mg₂-ATP, 0,3 mM Na₃-GTP; con un pH finale di 7,3 (regolato utilizzando KOH).
   NOTA: Si consiglia di filtrare le soluzioni intracellulari con filtri da 0,22 m e di conservare 0,5 mL della soluzione a -20 gradi centigradi.

3. Preparazione del tronco encefalico

1. Prima dell'estrazione del tronco encefalico, ecloclabisci la sACSF con carbogen e raffredda a -80 gradi centigradi per 25 minuti in modo da formare un liquame di ghiaccio.
2. Anestesizzare il topo con isoflurane (3-5 %) saturi di ossigeno (3 mL/min). Una volta assenti i riflessi della zampa posteriore, decapitare il topo con forbici affilate in acciaio inossidabile.
3. Esporre il cranio facendo un'incisione sagittale nella pelle utilizzando una lama di rasoio (#22 arrotondata).
4. Utilizzando l'estremità appuntita di una coppia di forbici modello standard fare una piccola incisione alla lambda e tagliare lungo la fessura longitudinale.
5. Riflettere accuratamente le ossa parietali accoppiate e le ossa occipitali utilizzando un paio di Pearson rongeurs poco profondi.
   NOT: Durante tutta questa procedura il cervello viene continuamente bagnato in situ utilizzando il liquame sACSF ghiacciato precedentemente preparato.
6. Isolare il tronco encefalico dal prosencefalo e la sua incasso osseo utilizzando una lama di rasoio (#11 dritto) per tagliare il solco parieto-occipitale e alla medulla caudale.
7. Montare il ventrale del tronco encefalico isolato terminare su un blocco di polistirolo trapezoidale precedentemente tagliato. Rimuovere il liquido in eccesso intorno al tessuto sezionato con uno stoppino di carta velina per garantire una buona adesione del tessuto alla fase di taglio.
   NOT: Il blocco di polistirolo viene tagliato in una forma trapezoidale, per garantire l'estremità rostrale del midbrain si adatta e si assottiglia nel midollo spinale.
8. Utilizzare colla cianoacrilata per fissare il blocco di polistirolo con il tronco encefalico attaccato fine rostrale fino alla fase di taglio.
9. Utilizzando una velocità di avanzamento di 0,16 mm/s e un'ampiezza di vibrazione di 3,00 mm, preparate 200 m di sezione trasversale del MVN.
   NOT: La posizione del MVN viene determinata utilizzando l'atlante del cervello di paxinos e Franklin (Figura 79-89)²⁰. L'MVN (elencato come MVe in atlante) si trova immediatamente ventrolaterale al ventricolo 4^th ed è più grande proprio prima dell'attaccamento del cervelletto (tra colliculi inferiori e obex).
10. Utilizzare una pipetta tagliata in plastica per trasferire le fette su un disco di carta filtrante seduto in ACSF carbogenato a 25 gradi centigradi per almeno 30 minuti prima della registrazione.

4. Strumenti

1. Utilizzare una configurazione elettrofisiologica standard per eseguire tecniche di morsetto delle patch intercellulari²¹.
2. Preparare le micropipette utilizzando un protocollo in due fasi (passaggio di calore 1: 70; passaggio di calore 2: 45) su un eseguitore a micropipette (vedere la tabella dei materiali). Le micropipette devono avere una resistenza finale che va da 3 a 5 M, con soluzione interna quando vengono collocate nella vasca da bagno.
   NOT: Le impostazioni utilizzate possono variare a seconda della temperatura all'interno della stanza e possono cambiare abbastanza frequentemente.

5. Elettrofisiologia del Mordo patch a cellule intere

1. Per ottenere registrazioni di morsetti a tutta cell da singoli neuroni nel MVN, all'interno della pipetta di registrazione viene utilizzata una soluzione interna basata su^K.
2. Trasferire una singola fetta di tessuto dalla camera di incubazione alla camera di registrazione e fissarla utilizzando un filo di nylon su un peso a forma di U. Perfecane continuamente la camera di registrazione con carbogenated-ACSF a 25 gradi centigradi ad una portata di 3 mL/min.
3. Dopo aver riempito una micropipetta con soluzione interna, individuare l'MVN utilizzando un obiettivo a bassa potenza (10x). Utilizzando un obiettivo ad alta potenza (40x), singoli neuroni all'interno del MVN possono essere localizzati.
   NOT: La qualità delle celle è essenziale per garantire registrazioni di qualità e durata della cella quando si tenta di ottenere la configurazione dell'intera cella. Una buona cellula dimostrerà la forma sferica, una membrana cellulare riflettente e un nucleo invisibile. Una cellula cattiva avrà un grande nucleo visibile (uovo-come) e un aspetto gonfio / ridotto.
4. Prima di rompere il tessuto con la pipetta, applicare una piccola quantità di pressione positiva per spingere i detriti lontano dalla punta della pipetta.
5. Spostare la pipetta utilizzando il micromanipolatore verso il neurone scelto e una piccola fossetta dovrebbe formarsi sulla membrana neuronale. Rilasciare una pressione positiva e applicare una piccola quantità di pressione negativa.
6. Una volta raggiunta una leggera guargonza da 1 G, applicare una leggera pressione positiva corta e tagliente al supporto della pipetta attraverso la porta di aspirazione per far risaltare la membrana e creare una configurazione a celle intere.
7. Effettuare registrazioni di morsetti di corrente a tutta cell utilizzando tecniche standard^21,22.

6. Applicazione del rumore sinusoidale e stocastico ai singoli neuroni del nucleo commerciale mediale

1. Applicare il rumore stocastico e sinusoidale a una gamma di ampiezza da 3 a 24 pA per determinare la soglia neuronale e la velocità di cottura.
2. Determinare la soglia sensoriale raggruppando intensità di stimolo sempre più in alto ed eseguire un ANOVA per osservare eventuali differenze (come mostrato nella figura supplementare 1).
3. Calcolare il tasso medio di cottura nel periodo di 10 s in cui il passo corrente depolarizzante è stato / sarà iniettato per ogni singolo livello attuale (cioè, 7 episodi totali; Figura 1).
4. Utilizzare i valori della velocità di attivazione media per generare una velocità di attivazione rispetto al grafico corrente ed eseguire un'analisi di regressione lineare per determinare la sfumatura della linea di adattamento migliore. Il gradiente della linea di migliore vestibilità è indicativo del guadagno neuronale²².

Figura 1: profili di controllo, protocolli di rumore sinusoidale e stocastico. (A) Protocolli di controllo (nessun rumore) applicati ai neuroni MVN. (B) Protocollo di rumore sinusoidale con una frequenza di 2 Hz. (C) Protocolli di rumore stocastico in cui la maggior parte dello spettro di potenza è di 2 Hz. Ogni protocollo qui presentato ha un'ampiezza di 6 pA con una corrente depolarizzante di 10 s aumentando di 10 pA fino a 50 pA. Il vero stimolo non ha un passo corrente depolarizzante ed è quindi il primo episodio di questi protocolli per determinare i cambiamenti di guadagno neuronale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Risultati

Le registrazioni iniziali possono fornire informazioni sugli effetti che il rumore sinusoidale e stocastico hanno sui tassi di cottura basali dei singoli neuroni MVN e su come gli stimoli effetto il guadagno dei neuroni. La figura 2 mostra che né il rumore sinusoidale né quello stocastico cambiano i tassi di cottura basale dei neuroni MVN rispetto alle registrazioni di controllo (senza rumore). Queste informazioni sono cruciali per determinare la soglia dei singoli neur...

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Discussione

Gli effetti della stimolazione vestibolare galvanica (GVS) sul sistema vestibolare sono stati evidenziati in vivo in esseri umani^3,13,23, cavie¹⁴, roditori¹⁸ e primati non umani²⁴. Tuttavia, nessuno di questi studi ha valutato l'impatto diretto del rumore elettrico sulla sensibilità dei singoli neuroni nel sistema vestibolare. Qui dimostriamo la prima appli...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl	Scharlau	CA01951000	Used for ACSF and sACSF
D-(+)-Glucose	Sigma	G8270	Used for ACSF and sACSF
EGTA	Sigma	E0396-25G	Used for K-based intracellular solution
HEPES	Sigma	H3375-25G	Used for K-based intracellular solution
KCl	Chem-supply	PA054-500G	Used for ACSF, sACSF and intracellular solution
K-gluconate	Sigma	P1847-100G	Used for K-based intracellular solution
Mg-ATP	Sigma	A9187-500MG	Used for K-based intracellular solution
MgCl	Chem-supply	MA00360500	Used for ACSF and sACSF
Na3-GTP	Sigma	G8877-100MG	Used for K-based intracellular solution
NaCl	Chem-supply	SO02270500	Use for ACSF and intracellular solution
NaH2PO4•2H2O	Ajax	AJA471-500G	Used for ACSF and sACSF
NaHCO3	Sigma	S5761-1KG	Used for ACSF and sACSF
Sucrose	Chem-supply	SA030-500G	Used for sACSF
Isoflurane	Henry Schein	1169567762	Used for anaesthetising mice
EQUIPMENT
Borosilicate glass capillaries	Warner instruments	GC150T-7.5	1.5 mm OD, 1.16 mm ID, 7.5 cm length
Data acquisition software	Axograph		Used for electrophysiology and analysis
Friedmen-Pearson Rongeurs	World precision instruments	14089	Used for dissection
Micropipette puller	Narishige	PP-830	Used for micropipette
Multiclamp amplifier	Axon instruments	700B	Used for electrophysiology
pH meter	Sper scientific	860033	Used for internal solution
Standard pattern scissors	FST	14028-10	Used for dissection
Sutter micromanipulator	Sutter	MP-225/M	Used for electrophysiology
Upright microscope	Olympus	BX51WI	Used for electrophysiology
Vibratome	Leica	VT1200	Used for slicing brain tissue