JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يحدد هذا البروتوكول طريقة لعزل السلف الليفية الدهنية (FAPs) والذريات العضلية المنشأ (أعضاء البرلمان) من عضلات الهيكل العظمي للفئران. استخدام الفئران في نماذج إصابة العضلات يوفر زيادة توافر الأنسجة من العضلات الضمرة للتحليل وذخيرة أكبر من الأساليب المعتمدة لتقييم قوة العضلات ومشية في الحيوانات الحرة الحركة.

Abstract

البروبونات الدهنية الليفية (FAPs) هي خلايا الخلالي المقيم في العضلات الهيكلية التي، جنبا إلى جنب مع السلف العضلية (أعضاء البرلمان)، تلعب دورا رئيسيا في التوازن العضلي، والإصابة، وإصلاح. وقد أجريت البروتوكولات الحالية لتحديد ال FAPs وعزل استخدام قياس التدفق الخلوي / تفرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS) والدراسات التي تقيم وظيفتها في الجسم الحي حتى الآن حصريا في الفئران. يسمح الحجم المتأصل الأكبر للفئران بإجراء تحليل أكثر شمولا ل FAPs في نماذج إصابات العضلات الهيكلية ، خاصة في العضلات الضمورية الشديدة أو عندما يحتاج المحققون إلى كتلة أنسجة كبيرة لإجراء فحوصات متعددة في المصب. يوفر الجرذ بالإضافة إلى ذلك مجموعة أكبر من المقايسات الوظيفية العضلية التي لا تتطلب التخدير الحيواني أو التضحية ، وبالتالي تقليل المراضة واستخدام الحيوانات من خلال تمكين التقييمات التسلسلية. وبروتوكولات قياس التدفق الخلوي/مركبات الكربون الهيدروفلورية المحسنة للفئران هي أنواع محددة، يحد منها بشكل خاص خصائص الأجسام المضادة المتاحة تجاريا. لم يتم تحسينها لفصل FAPs من الفئران أو العضلات الليفية للغاية. تم تطوير بروتوكول قياس التدفق الخلوي / FACS لتحديد وعزل FAPs و أعضاء البرلمان من كل من العضلات الهيكلية للفئران الصحية وإزالة النرفع ، بالاعتماد على التعبير التفاضلي للعلامات السطحية CD31 و CD45 و Sca-1 و VCAM-1. كما الفئران محددة، تدفق الأجسام المضادة الأولية التحقق من صحة قياس الخلايا محدودة للغاية، تم إجراء اقتران في المنزل من الأجسام المضادة التي تستهدف Sca-1. وباستخدام هذا البروتوكول، تأكد نجاح اقتران Sca-1، وتم التحقق من صحة تحديد التدفق الخلوي ل FAPs و أعضاء البرلمان من خلال زراعة الخلايا والتلطخ المناعي ل FACS المعزولة من أعضاء البرلمان. وأخيرا ، فإننا تقرير رواية FAPs الوقت بالطبع في فترة طويلة (14 أسبوعا) نموذج denervation الفئران. توفر هذه الطريقة للمحققين القدرة على دراسة FAPs في نموذج حيواني جديد.

Introduction

خلايا السلف الليفية الدهنية (FAPs) هي مجموعة من الخلايا السلف المقيمة متعددة القدرات في العضلات الهيكلية التي تلعب دورا حاسما في التوازن العضلي والإصلاح والتجديد ، وعلى العكس من ذلك ، تتوسط أيضا الاستجابات المرضية لإصابة العضلات. وكما يوحي الاسم، تم تحديد FAPs في الأصل كجهاز ذري مع إمكانية التفريق إلى الخلايا الليفية والخلايا الدهنية1 وكان يزعم أنها الوسيط الرئيسي لتسلل العضلات الدهنية الليفية في الإصابات المزمنة والمرض. وكشفت دراسة أخرى أن FAPs هي بالإضافة إلى ذلك قادرة على تكوين العظام وchondrogenesis2,3,4. وهكذا ، فهي أكثر على نطاق واسع في الأدب كما mesenchymal أو السلف سترومال3،5،6،7،8. في إصابة العضلات الهيكل العظمي الحادة, FAPs المساعدات بشكل غير مباشر في تكوين عضلي التجديدية من خلال الانتشار عابر لتوفيربيئةمواتية لخلايا الأقمار الصناعية العضلات المنشطة وسلفهم المصب myogenic (أعضاء البرلمان) نظرائهم 1,9,10. بالتوازي مع التجديد الناجح ، تخضع FAPs لداء الخلايا المبرمج ، مع إعادة أعدادها إلى مستويات خط الأساس1و9و10و11. في المقابل، في إصابة العضلات المزمنة، FAPs تجاوز إشارات الموالية أبوتوبوتيك، مما يؤدي إلى استمرارها9،10،11 وإصلاح العضلات غير طبيعية.

في دراسات الجسم الحي تقييم الآليات الخلوية والجزيئية التي FAPs التوسط استجابات العضلات استخدمت نماذج مورين حتى الآن1،7،9،10،11،12،13،14. في حين أن الفئران المعدلة وراثيا هي أدوات قوية للاستخدام في هذه التحليلات ، فإن صغر حجم الحيوان يحد من توافر الأنسجة للدراسة في نماذج الإصابات المترجمة على المدى الطويل حيث يمكن أن يكون ضمور العضلات عميقا ، مثل الحرمان الرضي. وعلاوة على ذلك، يتطلب قياس قوة العضلات والوظيفة البدنية قياسات الجسم الحي السابق أو في الموقع التي تتطلب إنهاء الماوس، أو في أساليب الجسم الحي التي تتطلب عملية جراحية و / أو مخدر عام للسماح بتقييم أداء العضلات تقلص15،16،17،18،19،20 . في الفئران، والتحقق من صحة جيدا وتستخدم عالميا التحليلات الوظيفية العضلات، بالإضافة إلى تحليلات للسلوكيات الحركية أكثر تعقيدا مثل تحليل مشية (على سبيل المثال، مؤشر وظيفة الوركي، تحليل CatWalk) موجودة ويتم تنفيذها في الحيوانات مستيقظا وتتحرك تلقائيا21،22،23،24 . هذا بالإضافة إلى ذلك يحسن مبادئ الحد الأدنى من المراضة في التجارب على الحيوانات، وأعداد الحيوانات البحثية المستخدمة. وبالتالي يوفر الجرذ المحقق FAPs المرونة المضافة من حجم العضلات المصابة أكبر لتحليل البروتين والخلوية والقدرة على إجراء تقييمات تسلسلية للنشاط الوظيفي الثابت والديناميكية المعقدة العضلات والسلوكيات، في الحيوان التنبيه.

وقد تم تحديد FAPs في المقام الأول وعزلها عن عينات العضلات الكاملة باستخدام قياس التدفق الخلوي وفرز الخلايا المنشطة بالفلورسينس (FACS) على التوالي. هذه هي المقايسات المستندة إلى الليزر التي هي قادرة على تحديد مجموعات خلايا محددة متعددة على أساس ميزات مميزة مثل الحجم، والحبيبة، ومزيج معين من سطح الخلية أو علامات داخل الخلايا25. هذا مفيد للغاية في دراسة نظام الأعضاء مثل العضلات الهيكلية ، حيث أن التوازن والتجديد معقدان ، وعمليات متعددة العوامل ينسقها عدد كبير من أنواع الخلايا. حددت دراسة أساسية FAPs، فضلا عن أعضاء البرلمان، وذلك باستخدام أساليب تدفق القياسات الخلوية في العضلات الهيكل العظمي الماوس1. وأظهروا أن FAPs هي mesenchymal في الطبيعة، لأنها تفتقر إلى مستضدات سطحية خاصة بالخلايا من أصول البطانية (CD31)، والهيماتوبوليتيك (CD45)، أو الميوجينيك (Integrin-α7 [ITGA7])، ولكنها أعربت عن علامة الخلايا الجذعية المتوسطة Sca-1 (مستضد الخلايا الجذعية1) 1 وتباينت في الخلايا الليفية والخلاعية في الثقافة. وأظهرت دراسات أخرى العزلة الناجحة من السلف المتوسطة في العضلات على أساس التعبير عن علامة الخلايا الجذعية البديلة, مستقبلات عامل النمو المستمدة من الصفائح الدموية ألفا (PDGFRα)2,7,8 وكشف مزيد من التحليل هذه من المرجح أن تكون نفس مجموعة الخلايا كما FAPs3. يتم تحديد FAPs الآن بشكل شائع في قياس التدفق الخلوي باستخدام Sca-1 أو PDGFRα كعلامة اختيارإيجابية 1و9و10و11و12و13و14و26و27و28و29و30و31 . استخدام PDGFRα هو تفضيلي للأنسجة البشرية ومع ذلك، كما هواة الإنسان المباشر من مورين سكا-1 لم يتم تحديد32. وبالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن بروتينات سطح الخلية الأخرى كعلامات لأعضاء البرلمان (على سبيل المثال، VCAM-1)، وتوفير بديل محتمل ل ITGA7 كمؤشر على خلايا النسب الميوجيني خلال عزلة FAPs33.

في حين تدفق قياس الخلايا / FACS هو منهجية قوية لدراسة دور والإمكانات المسببة للأمراض من FAPs في العضلات الهيكل العظمي1،9،10،11،13،29، فإنه يقتصر من الناحية الفنية من خلال خصوصية والتحسين من الكواشف المطلوبة. منذ تحديد تدفق الخلايا والعزلة من ال FAPs وقد وضعت وأجريت في نماذج الماوس1،9،10،11،29، وهذا يطرح تحديات للباحثين الذين يرغبون في دراسة FAPs في الكائنات الحية نموذج آخر. تختلف العديد من العوامل - مثل الحجم الأمثل للأنسجة التي سيتم معالجتها ، وكذلك خصوصية و / أو خصوصية الأجسام المضادة وتوافرها - اعتمادا على الأنواع المستخدمة.

بالإضافة إلى الحواجز التقنية لدراسة FAPs في نموذج حيواني جديد ، فقد تمت دراستها إلى حد كبير في بيئة حادة وسامة - عادة عن طريق الحقن الكيميائي العضلي أو سم القلب. يقتصر تقييم الديناميكيات طويلة الأجل ل FAPs في المقام الأول على التقييم في ضمور العضلات في دوشين ، باستخدام نموذج الماوس mdx9،10،11، ونماذج من إصابة العضلات المركبة مثل تمزق الكفة الدوارة الضخم حيث يتم إجراء تحويل الوتر المتزامن واستئصال النرجيل على عضلات الكتف26،27،28 . استجابة FAPs للإهانة الوحيدة من الحرمان من الصدمة المزمنة ، وهو أمر شائع في حوادث مكان العمل في الصناعة الثقيلة والزراعة ، وفي صدمات الولادة (إصابة الضفيرة العضدية)34،35،36،37 مع اعتلال كبير ، لم تكن مميزة بشكل جيد ، وغالبا ما تقتصر على إطار زمني قصير الأجل11،38.

نحن نصف طريقة لتحديد وعزل FAPs والنواب من العضلات الهيكلية الصحية وكذلك الضمورة والليفية بشدة في الفئران. أولا، يتم إثبات تحديد CD31-/CD45-/SCA-1+/VCAM-1- FAPs وCD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ أعضاء البرلمان باستخدام هضم الأنسجة وتدفق بروتوكول تلطيخ قياس الخلايا ويتم التحقق اللاحق من النتائج التي توصلنا إليها من خلال الثقافة والتلوين الكيميائي المناعي للخلايا المعزولة من FACS. باستخدام هذه الطريقة ، ونحن أيضا تقرير رواية FAPs الوقت بالطبع في نموذج إصابة denervation معزولة على المدى الطويل في الفئران.

Protocol

يجب أن يحصل المحققون الذين يجرون هذا البروتوكول على إذن من مجلس أخلاقيات الحيوان المحلي / لجنة الرعاية. تمت الموافقة على جميع الأعمال الحيوانية من قبل لجنة رعاية الحيوان في مستشفى سانت مايكل يونيتي تورونتو (ACC # 918) وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعها المجلس الكندي لرعاية الحيوان (CCAC). يظهر مخطط بروتوكول قياس التدفق الخلوي في الشكل 1. إذا كان التطبيق المتلقى للمعلومات هو FACS وثقافة الخلية اللاحقة، يجب إكمال كافة الخطوات باستخدام تقنية aseptic المناسبة.

1. حصاد العضلات

  1. تخدير الفئران باستخدام مخدر مناسب والتضحية وفقا لvivirium المحلية والمبادئ التوجيهية لمجلس أخلاقيات الحيوان. هذا البروتوكول يحصد عضلة المعدة والأمعاء من الفئران لويس الإناث البالغة (200-250 غرام)، كمثال. تم تخدير الفئران باستخدام 2-3٪ Isoflurane وتم التضحية بها عن طريق الحقن داخل القلب من T61.
  2. بمجرد التضحية بالحيوان ، حلق الجزء الخلفي بأكمله لتسهيل موقع العضلات وتقليل تلوث الفراء في الأنسجة المحصودة.
  3. باستخدام مشرط معقم، قم بعمل شقين في الجلد: الأول حول محيط مفصل الكاحل والثاني حتى خط الوسط للجانب الوسطي من المفصل الخلفي من الكاحل إلى الورك.
  4. قشر الظهر الجلد وطبقات العضلات السطحية للكشف عن gastrocnemius الكامنة، والتي تنشأ في condyles المتوسطة والظرفية من عظم الفخذ ويدخل في وتر أخيل.
  5. استخدام تشريح حاد لفصل gastrocnemius من الأنسجة المحيطة بها، والتعامل مع العضلات فقط عن طريق الوتر لتجنب إصابة سحق.
  6. فصل gastrocnemius من إدراجها عن طريق تحويل وتر أخيل كما distally ممكن مع مقص حاد. قطع مرة واحدة، وفهم وتر أخيل مع ملقط وقشر بلطف gastrocnemius قبالة العظام تحت. لا يزال عقد العضلات مع ملقط في يد واحدة، وتحديد موقع أصول gastrocnemius 'اثنين وقطع في condyles الفخذية المتوسطة والظروية.
  7. لطخة gastrocnemius المقتطعة بلطف ضد قطعة معقمة من الشاش لإزالة أكبر قدر ممكن من الدم. تقليم العضلات على سطح معقم وإزالة أي النسيج الضام الزائد، فضلا عن وتر أخيل.
  8. ضع العضلات في قارب وزن ووزن باستخدام مقياس دقيق. هذا البروتوكول هو الأمثل لهضم العضلات مع وزن الرطب تتراوح بين 200-600 ملغ. قد يقوم المشغلون تقسيم الأنسجة المحصودة الزائدة إلى أجزاء فرعية لإجراء فحوصات أخرى في المصب، إذا رغبت في ذلك.
  9. بلطف مزيد من تقسيم العضلات حصادها لاستخدامها لتدفق قياس الخلايا إلى 3-4 قطع أصغر (حوالي 1-2 سم3)وتغمر في الجليد الباردة 1x PBS. حافظ على البرودة على الجليد حتى يتم حصاد جميع العينات.

2. هضم العضلات

  1. إزالة العضلات من برنامج تلفزيوني ومكان في طبق زراعة الخلية 10 سم معقمة. المسيل للدموع بلطف والأنسجة المفروم مع ملقط حتى قطع هي ما يقرب من 3-4 ملم3،وإزالة أكبر قدر ممكن من النسيج الضام. مرة واحدة مفرومة جيدا, نقل إلى أنبوب مخروطي معقم 50 مل تحتوي على 6 مل DMEM + 1٪ البنسلين / العقدية (P / S).
  2. إضافة 10 ميكرولتر من 300 م م م CaCl2 حل إلى 365 ميكرولتر من كولاجيناز الثاني حل (تركيز المخزون 4800 U/mL) لتنشيط انزيم الكولاجينز. أضف محلول الكولاجيناز II المنشط إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على ملاط الأنسجة سعة 50 مل. تركيز كولاجيناز الثاني النهائي هو 250 U/mL.
  3. احتضان الأنابيب في شاكر ل 1 ساعة في 37 درجة مئوية، 240 × ز،مع التأكد من دوامة يدويا كل 15 دقيقة لطرد أي الأنسجة التي انضمت إلى جانب الأنبوب.
  4. بعد 1 ساعة، قم بإزالة الأنابيب من شاكر وأضف ما يلي لكل عينة: 100 ميكرولتر من كولاجيناز II (4,800 U/mL) و50 ميكرولتر من ديسباس (4.8 U/mL).
  5. عينات ماصة باستخدام ماصة المصلية 15-20 مرة حتى الحل هو متجانسة. إذا كان تجهيز عينات متعددة، استخدم ماصة معقمة منفصلة لكل عينة لتجنب التلوث العرضي للعينة.
  6. احتضان مرة أخرى في شاكر لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية و 240 × ز. بعد 15 دقيقة، يهز العينات باليد لطرد الأنسجة الملتصقة قبالة جانب الأنبوب.

3. توليد تعليق خلية واحدة

  1. قم بقص العينات ببطء من خلال حقنة 10 مل مع إبرة 20 G لمدة 10 دورات.
    ملاحظة: دورة واحدة ينطوي على تناول حل العضلات في حقنة, وحقنها مرة أخرى في أنبوب. ضمان لتقليل أي فقاعات عن طريق استكمال القص ببطء، كما زبد المفرط يمكن أن يسبب موت خلية إضافية39.
  2. ضع مصفاة خلايا 40 ميكرومتر على أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل ورطب عن طريق أنابيب 5 مل DMEM + 10٪ FBS و 1٪ P/S.
  3. ماصة 1 مل من العينة في وقت واحد من خلال مصفاة الخلية.
  4. غسل مصفاة الخلية عن طريق الأنابيب DMEM مع 10٪ FBS و 1٪ P / S من خلال مصفاة ليصل إجمالي حجم في الأنبوب إلى 25 مل.
  5. تقسيم 25 مل من العينة بالتساوي إلى أنبوبين مخروطيتين سعة كل منهما 15 مل وطارد مركزي عند درجة حرارة 15 درجة مئوية، و400 × ز لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: تقسيم حل العضلات إلى أنبوبين مخروطيين سعة كل منهما 15 مل يضمن استعادة أفضل للخلايا بعد الطرد المركزي مقارنة بأنبوب واحد.
  6. أسبيرات supernatant وإعادة تعليق بيليه في 1 مل 1x RBC Lysis العازلة (انظر ملف التكميلية)في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق للقضاء على كريات الدم الحمراء.
  7. رفع مستوى الصوت إلى 10 مل مع 9 مل من العازلة غسل (انظر ملف التكميلية)وأنابيب تدور في 400 × ز، 15 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  8. يستنشق الكريات الفائقة والتكميل عن طريق إعادة تعليق في 1 مل غسل العازلة.
  9. نقل حجم مناسب من الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي صغير منفصل سعة 1.5 مل واخلطه مع صبغة زرقاء تريبان. عد الخلايا الحية على المجهر الخفيف باستخدام مقياس الدم.

4. تلطيخ الأجسام المضادة لتدفق قياس الخلايا

ملاحظة: يجب أن يكون الجسم المضاد SCA-1 مترافقا مع APC قبل إجراء تجارب قياس الخلايا/FACS، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يجب التحقق من صحة الأداء لكل دفعة من الموازات(الشكل 2). يمكن تخزين التوازج النهائي في 20 ميكرولتر aliquots في -20 درجة مئوية ومستقرة لمدة ثلاثة أسابيع. راجع الملف التكميلي للحصول على بروتوكول اقتران كامل.

  1. لقياس التدفق الخلوي، قم بنقل 1-2 × 106 خلايا لكل عينة تجريبية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل. جلب حجم يصل إلى 1 مل مع عازلة غسل ومكان على الجليد.
  2. لكل تجربة، قم بإعداد عناصر التحكم المطلوبة التالية: '1' عناصر التحكم في البقاء غير الملطخة و'2' لتحديد مجموعة الخلايا الحية بدقة؛ '2' الضوابط التي يمكن أن تكون ذات مقومات البقاء؛ '2' الضوابط التي يمكن أن تكون ذات مقومات البقاء؛ '2' الضوابط التي يمكن أن تكون على قيد الحياة؛ '2' الضوابط التي يمكن أن تكون ذات مقومات البقاء iii) الفلورسينس ناقص واحد (FMO) ضوابط على تعليق خلية واحدة لتعيين بوابات دقيقة للCD31-/CD45- كسور, FAPs, والنواب; و4) حبات تعويض واحد ملطخ لتصحيح لامتداد الفلورية بين القنوات.
    1. لجميع عناصر التحكم في الخلايا، aliquot 5 × 105 - 1 × 106 خلايا في 1 مل من العازلة غسل في أنبوب 1.5 مل جهاز الطرد المركزي الدقيق ومكان على الجليد.
    2. بالنسبة لعناصر التحكم في الخرز، أضف قطرة واحدة من حبات التعويض الإيجابية (~ 1.5 × 10حبات 5 لكل قطرة) إلى كل أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل. ويرد في الجدول 1كامل عناصر التحكم.
      ملاحظة: إذا كان يتم إجراء التجربة لأول مرة، قم بتشغيل عناصر تحكم ذات لون واحد لكل جهاز مضاد مترافق على تعليق خلية واحدة (بالإضافة إلى حبة التعويض غير الملطخة والجدوى وضوابط FMO) لتقييم السكان الملونين الإيجابيين في الخلايا والتحقق من صحة التلطيخ الملاحظ على حبات التعويض. التحقق من صحة كل Sca-1:: APC إعداد حديثا عن طريق تنفيذ تلطيخ واحد على حبات التعويض وتعليق خلية واحدة. راجع الجدول 1 للحصول على قائمة كاملة بعناصر التحكم في التلطيخ.
  3. لإعداد التحكم في الجدوى، قم بنقل نصف حجم الخلايا من أنبوب "البقاء" إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد سعة 1.5 مل. تسمية هذا الأنبوب "الميت".
  4. احتضان "الميت" أنبوب في 65 درجة مئوية لمدة 2-3 دقائق لقتل الخلايا، ثم وضعها على الجليد. بعد 2-3 دقائق، إعادة الجمع بين الخلايا الميتة مع الخلايا الحية المتبقية في أنبوب التحكم في الجدوى. سيتم استخدام هذه المجموعة من الخلايا لتعيين قيم التعويض (إذا لزم الأمر) وتعيين بوابات لصبغة الجدوى بشكل صحيح.
  5. الطرد المركزي تعليق خلية واحدة (عينات تجريبية والضوابط) في 500 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  6. يستنشق الكريات الخلية الفائقة وإعادة تعليق في 100 ميكرولتر غسل العازلة.
  7. إضافة أجسام مضادة، اعتمادا على عينة تجريبية أو السيطرة. راجع مصفوفة التلطيخ(الجدول 2)للحصول على معلومات حول تركيبات الأجسام المضادة ومبالغها.
  8. نفض الغبار بلطف كل عينة لضمان الاختلاط الكامل واحتضان على الجليد في الظلام لمدة 15 دقيقة. للحصول على تعويض الخرز، واحتضان في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 15 دقيقة.
  9. بالنسبة للعينات التجريبية وعينات التحكم في تعليق الخلية الواحدة، قم بإحضار الحجم إلى 1 مل بإضافة مخزن مؤقت للغسيل سعة 900 ميكرولتر. للحصول على عناصر تحكم حبة التعويض، رفع مستوى الصوت إلى 1 مل مع 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1x.
  10. أجهزة الطرد المركزي عينات تعليق خلية واحدة في 500 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. مراقبة حبة تعويض الطرد المركزي عند 300 × ز، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  11. لجميع عينات تعليق الخلية الواحدة، يستنشق ويتخلص من الكريات الخلوية الفائقة وإعادة تعليقها في مخزن غسيل 300 ميكرولتر. للحصول على تعويض الخرز الضوابط، أسبيرات والتخلص من supernatant، وإعادة تعليق بيليه في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1x، ثم إضافة 1 قطرة (~ 1.5 × 105) من الخرز التعويض السلبي.
  12. الحفاظ على جميع عينات تعليق خلية واحدة على الجليد تحت رقائق الألومنيوم والمضي قدما في تدفق اكتساب القياسات الخلوية. يجب أيضا حماية ضوابط حبة التعويض من الضوء ولكن يمكن الاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: إذا كانت نقطة النهاية التجريبية هي تعريف FAPs بواسطة قياس التدفق الخلوي، يرجى اتباع الخطوات 5.1.1-5.1.11. إذا كانت نقطة النهاية عزل الخلية عبر FACS للثقافة والتلوين، يرجى اتباع الخطوات 5.2.1-5.2.9 والأقسام 6-7.

5. تدفق قياس الخلايا وفلورسينس تنشيط فرز الخلايا (FACS)

  1. قياس التدفق الخلوي
    ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول مقياس تدفق الخلايا على سطح المقعد مجهزا بأشعة ليزر 405 نانومتر و488 نانومتر و640 نانومتر قادرة على تمييز 10 ألوان مختلفة في نفس الوقت. مرشحات باندباس والفلوروشرومات المرتبطة بها المستخدمة في هذا البروتوكول هي على النحو التالي: 450/50 (SYTOX Blue)، 530/30 (FITC)، 575/25 (PE)، و 670/30 (APC). الفولتية لكل كاشف هي على النحو التالي: FSC 700; SSC 475; FITC 360; PE 460; PE-Cy7 600; SYTOX الأزرق 360; APC 570. تأكد من تدريبك على التشغيل السليم لقياس التدفق الخلوي أو فرز الخلايا قبل الاستخدام.
    1. تأكد من تشغيل مقياس الخلايا لمدة 10-20 دقيقة قبل الاستخدام وتم تجهيزه بالتنظيف بالتسلسل باستخدام حلول سائل التنظيف والشطف والغماد لمدة 30-45 ق لكل منهما. الانتهاء مع شطف مع DH2O. تأكد من أن تم إضافة كمية كافية من السائل غمد إلى حاوية التخزين للحفاظ على تدفق العينة المناسبة في جميع أنحاء الاستحواذ.
    2. وضع استراتيجية الصياغة لتحديد أعضاء البرلمان والنواب على النحو المحدد في الشكل 3.
      ملاحظة: يتم تحديد أعضاء البرلمان والشخصيات من خلال استراتيجية التنغيز الهرمية التالية: '1' SSC-A مقابل FSC-A (منطقة مبعثر الخلية الجانبية مقابل منطقة مبعثر الخلية الأمامية لفصل الخلايا مقابل الحطام)، '2' FSC-W vs FSC-H (عرض مبعثر الخلية الأمامية مقابل ارتفاع مبعثر الخلية الأمامية للتمييز بين المفردات من doublets في معلمة FSC)، iii) SSC-W مقابل SSC-H (عرض مبعثر الخلية الجانبية مقابل ارتفاع مبعثر الخلية الجانبية للتمييز بين المفردات من doublets في معلمة SSC)، 4) SSC-A مقابل SYTOX الأزرق (للتمييز بين العيش مقابل الميت الفردي)، v) SSC-A مقابل CD31/45::FITC (لاستبعاد خلايا CD31+ و CD45+ من مزيد من التحليل)، و السادس) SCA-1::APC مقابل VCAM-1::P E من CD31-/CD45- (النسب؛ Lin-) السكان (تحديد هوية أعضاء البرلمان والنواب). يتم تعريف FAPs ك أحداث CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- ويتم تحديد أعضاء البرلمان على أنهم أحداث CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ .
    3. تشغيل أولا كل حبة تعويض ملطخة واحدة التحكم من خلال السيتومتر على سرعة منخفضة لتوليد قيم التعويض المستخدمة لتصحيح أي امتداد مضان بين القنوات. تقييم التعويض عن طريق مقارنة إشارة الفلورسنت لكل عنصر تحكم في جهاز الكشف الخاص به (على سبيل المثال، SSC-A مقابل APC لSCA-1::APC حبات واحدة ملطخة) وكذلك جميع أجهزة الكشف الأخرى. وينبغي أن يكون هناك مجموعتان متميزتان (واحدة مع سلبية وواحدة مع إشارة إيجابية) في الكاشف المناسب وسوى مجموعة سلبية في جميع أجهزة الكشف الأخرى. تعيين بوابة الإيقاف إلى أحداث حبة التعويض 10,000 وتسجيل البيانات.
      ملاحظة: بين الحصول على كل عينة، تأكد من تشغيل dH2O من خلال السيتومتر لمدة 10-20 ثانية لتجنب التلوث عينة إلى عينة.
    4. العملية التالية عينات التحكم غير الملطخة وقابلية البقاء لبوابة بشكل صحيح على الخلايا الفردية الحية. تعيين بوابة إيقاف إلى أحداث مفردة 10,000 وتسجيل البيانات.
      ملاحظة: ما يقرب من 5 دقائق قبل الحصول على كل عينة تعليق خلية واحدة باستثناء العينة غير الملطخة، إضافة 1 ميكرولتر من صبغة قابلية البقاء الأزرق SYTOX (تركيز العمل 300 ميكرومتر المخفف من محلول مخزون 1 mM) إلى كل عينة ونفض الغبار بلطف لخلط (التركيز النهائي 1 ميكرومتر).
    5. ثم الحصول على عينات التحكم تعليق خلية واحدة المتبقية. تقييم كل مراقبة FMO مع مؤامرة المناسبة في استراتيجية gating (الشكل 3). على سبيل المثال، قم بتقييم إشارة FITC لبوابة CD31+CD45 FMO لضمان بوابة CD31-/CD45 دقيقة. يظهر مثال الأمثل في الشكل 3G. إذا كان البروتوكول يتم تنفيذه لأول مرة، يجب تشغيل عناصر تحكم ذات لون واحد على الخلايا قبل الحصول على عناصر تحكم FMO.
    6. تقييم إشارة الفلورسنت لكل عينة خلية واحدة ملطخة في كاشفها المناسب وكذلك في جميع أجهزة الكشف الأخرى للتحقق من التعويض المناسب. تعيين بوابة التوقف إلى 10،000 الأحداث الفردية الحية وسجل على البرنامج.
    7. وبمجرد تجهيز جميع عناصر التحكم (تعليق الخلايا الواحدة والخرز)، أعد جميع العينات التجريبية عن طريق قياس وتسجيل حجم كل عينة أولا. وستستخدم هذه القياسات لتحديد عدد أعضاء البرلمان ونوابه بدقة، على النحو المبين في الخطوة 5-1-11. ثم، إضافة 50 ميكرولتر من الخرز العد الدقيق ومزيج بلطف عن طريق pipetting صعودا وهبوطا 2-3 مرات.
    8. قم بتشغيل العينة التجريبية الأولى لفترة وجيزة للتحقق من صحة تحديد مجموعة حبات العد. يظهر هذا السكان ككتلة صغيرة منفصلة عن مجموعة الخلايا العامة على مؤامرة FSC-A مقابل SSC-A(الشكل 3A، المربع الأحمر). إنشاء بوابة حول السكان حبة العد. ثم الحصول على بيانات لكل عينة تجريبية عن طريق المعالجة من خلال السيتومتر على سرعة منخفضة. تعيين بوابة التوقف إلى 10،000 عد أحداث حبة وسجل.
      ملاحظة: يمكن للمحققين بدلا من ذلك تحديد الخرز العد عن طريق إعداد مؤامرة إضافية تقييم SSC-A مقابل أي من أجهزة الكشف، والخرز العد هي الفلورسنت في جميع أجهزة الكشف.
    9. بعد أن تتم معالجة جميع العينات، قم بتنظيف مقياس الخلايا باستخدام البروتوكولات المناسبة. تصدير كافة البيانات للتحليل.
    10. افتح كافة ملفات البيانات على برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي المناسب. تعيين استراتيجية gating كما هو مستخدم للحصول على البيانات كما هو موضح في الخطوة 5.1.2. فحص عناصر التحكم بنفس الترتيب كما هو الحال في الحصول على البيانات (على سبيل المثال، غير ملطخة، وقابلية البقاء، وصمة عار واحدة، ثم ضوابط FMO) لإعادة التحقق من صحة استراتيجية gating. بمجرد تعيين بوابات دقيقة باستخدام ضوابط FMO ، وتطبيق البوابات على جميع العينات التجريبية. تصدير البيانات الأولية كجداول بيانات للقياس الكمي.
    11. حساب عدد أعضاء البرلمان والنواب في كل عينة تجريبية باستخدام الخرز العد:
      figure-protocol-14597
      حيث، عدد الخلايا المكتسبة هو عدد الأحداث المسجلة من السكان الخلية ذات الصلة (مثل FAPs أو أعضاء البرلمان) على البرمجيات اقتناء؛ عدد الخرز المكتسب هو عدد الأحداث المسجلة لحساب الخرز على برنامج الاستحواذ؛ يعد حجم الخرز هو حجم حل حبة العد المضاف في الخطوة 5.1.7؛ حجم العينة هو حجم كل عينة تجريبية ملطخة قبل إضافة الخرز العد.; تركيز الخرز هو عدد الخرز لكل محلول ميكرولتر؛ تم العثور على هذه القيمة في ورقة بيانات المنتج.
  2. FACS - الفرز لثقافة الخلية
    ملاحظة: ينفذ هذا البروتوكول FACS على فرز الخلايا مجهزة 4 أشعة الليزر (الأشعة فوق البنفسجية، البنفسجي، الأزرق، الأحمر) التي هي قادرة على التمييز في وقت واحد 11-14 لونا. اتبع تلطيخ العينة التجريبية (القسم 4) وبروتوكول قياس التدفق الخلوي، باستثناء الخطوات من 1 إلى 3 المحددة أدناه، لتحسين سير عمل FACS:
    1. زيادة تركيز الخلايا في العينات التجريبية ليتم فرزها إلى 7 × 106 خلايا / مل لتوليد غلة قوية من FAPs والنواب.
    2. ولحصر هذه الزيادة الكبيرة في تركيز الخلية، تضاعف تركيزات الأجسام المضادة في العينات التجريبية التي سيتم فرزها.
    3. معالجة عينات الخلية الملونة النهائية من خلال 40 ميكرومتر خلية مصفاة سقف الملصقة على أنبوب البوليسترين 5 مل مباشرة قبل الفرز للحد من تكتل الخلية وزيادة غلة الفرز.
    4. جمع واحد، ويعيش FAPs الفئران والنواب مباشرة من مفرز الخلية في أنبوب جمع البولي بروبلين 5 مل تحتوي على 1 مل من المصل البقري الجنيني المعقمة، 100٪ (FBS). إبقاء الخلايا على الجليد حتى اكتمال الفرز.
      ملاحظة: إذا كان إجراء FACS في موقع خارج الموقع، نقل جميع الخلايا المفرزة على الجليد وفي حاوية آمنة مغطاة.
    5. العمل في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة (BSC) ، وجلب حجم الخلايا المفرزة تصل إلى 7 مل مع وسائل الإعلام النمو المناسبة (على سبيل المثال ، وسائل الإعلام نمو FAP (FAP GM) ل FAPs فرزها ، ووسائط نمو MP (MP GM) لأعضاء البرلمان فرزها ؛ انظر الملف التكميلي لوصفات) والطرد المركزي في 500 × ز ، 4 درجة مئوية لمدة 7 دقائق لإزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت المتبقية غسل ممكن.
    6. الكريات ريسوسبند في 1 مل من وسائل الإعلام النمو المناسبة ولوحة في لوحة 12 جيدا تحتوي على معقمة، المغلفة بالكولاجين 12 مم الزجاج coverslip / جيدا لstaining المناعية اللاحقة (انظر القسم 6).
      ملاحظة: إذا تلطيخ الكيمياء المناعية للكولاجين، لوحة فرز الخلايا إلى لوحة بئر 12 تحتوي على معقمة، مغلفة بالليمينين 12 مم الزجاج coverslip / جيدا، بدلا من الكولاجين المغلفة. إذا كانت هناك حاجة لتجارب الكيمياء المناعية للذريين المعزولين على الفور ، فإن أعضاء البرلمان والبذور بكثافة 15000 خلية لكل سم2 والمضي قدما مباشرة إلى الخطوة 6.1. بالنسبة للثقافات طويلة الأجل للحث على تمايز السلف ، فإن البذور FAPs بكثافة 5000 خلية لكل سم2، والنواب بكثافة 7500 خلية لكل سم2.
    7. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في حاضنة زراعة الخلايا. بعد 72 ساعة في الثقافة، تغيير نصف وسائل الإعلام. تغيير الوسائط بالكامل كل 2-4 d بعد.
    8. للحث على تطوير الخلايا العضلية ، وتحويل ثقافات أعضاء البرلمان إلى النائب التمايز (MD) المتوسطة في اليوم 9 من الثقافة. للحث على الخلايا الدهنية، قم بتبديل ثقافات FAPs إلى وسيط التمايز الدهني FAP (AD) في اليوم العاشر من الثقافة.
    9. للحث على تكوين ليفي، يمكن تحويل FAPs إلى وسائط التمايز الليفي (FD) في أوقات متغيرة أثناء الثقافة، أو بدلا من ذلك، يمكن زرعها مباشرة في وسائط FD بعد العزل (الخطوة 5.2.6) (انظر الملف التكميلي لجميع وصفات الوسائط).

6. الكيمياء المناعية لأعضاء البرلمان والشخصيات المثقفة

  1. للتحقق من صحة فرز الخلايا وإظهار نقاء ثقافات أعضاء البرلمان والنواب، immunostain مع علامات محددة من نوع الخلية بما في ذلك PDGFRα (علامة FAPs) ، باكس - 7 (جذع العضلات [الأقمار الصناعية] علامة الخلية) ، البروتين الليفي محددة (FSP - 1 ، علامة الخلايا الليفية) ، Perilipin - 1 (Plin - 1 ، علامة الخلايا الدهنية) ، نوع الكولاجين 1 (Col1a1 ، مؤشر التليف) ، سلسلة ميوزين الثقيلة (MHC ، علامة الخلايا الصباغية الناضجة).
    1. لاحتواء المناعة من الخلايا الطازجة فرزها، والطرد المركزي لوحة 12 جيدا في 200 × ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتسهيل الالتزام الخلايا إلى coverslip / جيدا. هذه الخطوة ليست ضرورية للثقافات طويلة الأجل. إزالة الوسائط الثقافية.
    2. لاحتواء المناعة باستخدام FSP-1، قم بإصلاح الخلايا باستخدام الميثانول 1 مل 100٪ (MeOH) لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. إذا كان مناعة لPDGFRα، بلين-1، Pax7 أو Col1a1، إصلاح ثقافات الخلايا مع 1 مل 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تتسامح التثبيط المناعي MHC مع أي من المثبتات.
      ملاحظة: بالنسبة للخلايا الثابتة الميثانول تخطي الخطوة 6.2 ثم انتقل إلى الخطوة 6.3.
  2. اسبيرات 4٪ PFA وغسل بسرعة ثقافات الخلايا 3-4 مرات مع برنامج تلفزيوني 1x. إضافة 1 مل من 100 مل الجليسين في برنامج تلفزيوني 1x واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتثبيط PFA المتبقية. أسبيرات وغسل 1-2 مرات مع برنامج تلفزيوني 1x.
    ملاحظة: يمكن ترك الخلايا في هذه المرحلة في 2 مل من برنامج تلفزيوني 1x، ملفوفة في فيلم التشبث وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 7-10 أيام كحد أقصى.
  3. بعد الغسيل، إضافة 1 مل من 0.1٪ تريتون-X في برنامج تلفزيوني 1x واحتضان لمدة 20 دقيقة لبيرمابيليز أغشية الخلايا.
  4. غسل الآبار 2-3 مرات مع 1-2 مل من 1x PBS ثم كتلة الخلايا مع 1 مل من 1x PBS + 3٪ BSA لكل بئر لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  5. ماصة 80 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة في 1x PBS + 3٪ BSA (PDGFRα 1:100، Pax7 أنيق، FSP-1 1:50، بلين-1 1:400، Col1a1 1:250، MHC 3 ميكروغرام / مل) على قطعة من البارافيلم مسجلة على حاوية متنقلة. باستخدام ملقط غرامة معقمة، ورفع بعناية coverslip من البئر وعكس على قطرة من محلول الأجسام المضادة. احتضان غطاء مع قطعتين مبللتين من منشفة ورقية وحاوية تغطية في فيلم بلاستيكي لتجنب تبخر محلول الأجسام المضادة. حضانة بين عشية وضحاها في 4 °C.
    ملاحظة: تلطيخ الأغطية من البئر يستخدم الأجسام المضادة أقل (~ 80 ميكرولتر) من تلطيخ داخل البئر (500 ميكرولتر الحد الأدنى).
  6. في اليوم الثاني، اترك الأغطية في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة حتى تدفئ. باستخدام ملقط الحق بعناية ونقل coverlips العودة إلى الآبار الخاصة بهم (الخلايا التي تواجه) وغسل 2-3 مرات مع 1-2 مل من برنامج تلفزيوني 1x لمدة 2 دقيقة لكل لإزالة أكبر قدر ممكن من الأجسام المضادة الأولية.
  7. باستخدام نفس تقنية تلطيخ كما هو الحال مع تلطيخ الأجسام المضادة الأولية ، وصمة عار الخلايا مع الماعز المضادة للأرانب اليكسا فلور 488 الأجسام المضادة الثانوية (1:400) للكشف عن FSP - 1 ، بلين - 1 ، Col1a1 ، أو PDGFRα والماعز المضادة للفأرة اليكسا فلور 555 الأجسام المضادة الثانوية (1:300) للكشف عن MHC أو باكس - 7. احتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة والحفاظ على الخلايا المحمية من الضوء.
  8. عودة الخلايا إلى البئر واحتضان الخلايا مع Hoechst (1:10،000) لمدة 2-4 دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا مرة أخرى 2-3 مع برنامج تلفزيوني 1x لمدة 2 دقيقة لكل لإزالة Hoechst الزائدة.
  9. جبل coverlips على الشرائح الزجاجية باستخدام المتوسطة تصاعد الفلورسنت المضادة للتلاشي وترك الشرائح لتجف بين عشية وضحاها في الظلام في درجة حرارة الغرفة. مخزن الأغطية التي شنت في 4 درجة مئوية في الظلام.

7. النفط الأحمر O (ORO) تلطيخ من نواب الثقافات ونواب

  1. إجراء تلطيخ ORO على الخلايا غير permeabilized، كما permeabilization من غشاء الخلية يمكن أن يؤدي إلى تلطيخ غير محددة / غير مرغوب فيها من أنواع الخلايا غير الدهنية. قبل البدء في تلطيخ، وإعداد مخزون العمل ORO (انظر الملف التكميلي للوصفة) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
  2. بعد 20 دقيقة، قم بتصفية الحل باستخدام فلتر 0.2 ميكرومتر لإزالة أي مجاميع غير محلولة.
  3. أسبيرات وسائل الإعلام من جيدا وإضافة 1 مل من 10٪ محايدة العازلة الفورمالين (10٪ NBF). حضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي التقاء الخلايا إلى الرفع من البئر/الغطاء. الحرص عند القرصنة / إضافة الحلول.
  4. أسبيرات وإضافة 1 مل من الطازجة 10٪ NBF واحتضان لمدة 1 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول عند هذه النقطة، كما يمكن ترك الخلايا في 10٪ NBF بين عشية وضحاها.
  5. غسل الآبار بسرعة مرة واحدة مع 1 مل من 60٪ isopropanol، ثم يستنشق والسماح لل آبار لتجف تماما (حوالي 2 دقيقة).
  6. إضافة 400 ميكرولتر النفط الأحمر O المخزون العامل لكل بئر واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع التأكد من تجنب الأنابيب أي ORO على جدران لوحة.
  7. إزالة كل من النفط الأحمر O وغسل الآبار بسرعة 4 مرات مع DH2O.
    ملاحظة: إذا كانت الآبار الملطخة تحتوي على أغطية، قم بتركيبها باستخدام نفس التقنية كما هو موضح في الخطوة 6.9.
  8. صورة إما الأغطية التي شنت أو البئر الملطخة باستخدام المجهر brightfield.

8. تلطيخ الأنسجة من المقاطع المعدية الجرذ المزيلة والغذاء

  1. بيكروسيريوس الأحمر (PSR)
    1. أداء PSR تلطيخ على 5 ميكرومتر سميكة، البارافين الفورمولين الثابتة جزءا لا يتجزأ (FFPE) الفئران أقسام المعدة والأمعاء كما هو موضح سابقا40.
  2. O الأحمر النفط (ORO)
    1. إصلاح 5 ميكرومتر سميكة isopentane المجمدة الجرذ أقسام المعدة والهلوسة في 4٪ PFA لمدة 10 دقيقة، واحتضان في الكحول isopropyl 60٪ لمدة 1 دقيقة.
    2. وصمة عار مع الأسهم العاملة ORO لمدة 12 دقيقة. احتضان الكحول isopropyl 60٪ لمدة دقيقة واحدة، وغسل لمدة 10 دقيقة في DH2O. جبل على coverlips باستخدام وسائل الإعلام تصاعد للذوبان في الماء.
  3. Sca-1 والأنسجة اللامينين الكيمياء المناعية الفلورية (IHC)
    1. إجراء IHC الفلورسنت على 5 ميكرومتر سميكة isopentane المجمدة الجرذ أقسام المعدة والهلوسة الفئران.
    2. عينات هيدرات في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 5 دقائق، وإصلاح في 4٪ PFA لمدة 10 دقيقة ثم احتضان العينات في محلول حجب الأنسجة IF (انظر الملف التكميلي)لمدة 90 دقيقة.
    3. احتضان مع المضادة للSCA-1 الأجسام المضادة الأولية (1:500) المخفف في برنامج تلفزيوني 1x + 0.05٪ توين في 4 °C بين عشية وضحاها.
    4. في اليوم 2، يغسل ثلاث مرات في 1x PBS + 0.05٪ توين لمدة 5 دقائق لكل منهما، ثم احتضان في الماعز المضادة للأرنب اليكسا فلور 555 (1:500) لمدة 1 ساعة.
    5. غسل مرة أخرى (كما كان من قبل)، واحتضان مع حل حجب ل1 ساعة، ثم إضافة الأجسام المضادة لللامينين الأولية (1:500) المخفف في برنامج تلفزيوني 1x + 0.05٪ توين لمدة 1 ساعة.
    6. يغسل مرة أخرى (كما كان من قبل)، ثم احتضان في الماعز المضادة للأرنب اليكسا فلور 488 (1:500) لمدة 1 ساعة (لللحنين).
    7. يغسل مرة أخرى (كما كان من قبل) ثم احتضان في DAPI (1:10،000) لمدة 4 دقائق. غسل وجبل على coverlips باستخدام المضادة تتلاشى تصاعد المتوسطة.

النتائج

تحديد FAPs والنواب عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام لوحة الأجسام المضادة الجديدة بما في ذلك Sca-1 و VCAM-1
وتستند استراتيجية gating لتحديد FAPs في عضلة الفئران على بروتوكولات قياس التدفق الخلوي في الماوس29، والتي بوابة على CD31 (البطانية) وCD45 (الهيم...

Discussion

يعد بروتوكول عزل FAPs الأمثل والمعتمد لعضلات الفئران ضروريا للباحثين الذين يرغبون في دراسة نماذج الإصابات غير الممكنة في الماوس لأسباب بيولوجية أو تقنية. على سبيل المثال، الفئران ليست نموذجا حيوانيا أمثل لدراسة الإصابات المحلية المزمنة، أو العصبية مثل إزالة النرجيل على المدى الطويل. بيول...

Disclosures

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ أي تضارب في الكشف عن المعلومات.

Acknowledgements

نود أن نشكر المرافق الأساسية لقياس التدفق الخلوي في جامعة أوتاوا ومركز كينان للأبحاث للعلوم الطبية الحيوية (KRC) ومستشفى سانت مايكلز يونيتي هيلث تورونتو على خبرتهم وتوجيهاتهم في تحسين بروتوكول قياس التدفق الخلوي / FACS المقدم في هذه المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من قبل صندوق الأدوية من قبل صندوق تصميم الأفكار الجديدة 2018 (MbDNI-2018-01) إلى JB.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL Polypropylene Round-Bottom TubeFalcon352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer CapFalcon352235
10 cm cell culture dishesSarstedt83.3902
12-well cell culture plateThermoFisher130185
12 mm glass coverslips, No.2VWR89015-724
10 mL SyringeBeckton Dickenson302995
15 mL centrifuge tubesFroggaBio91014
20 gauge needleBeckton Dickenson305176
25mL Serological pipetteSarstedt86.1685.001
40µm cell strainerFisher Scientific22363547
50mL centrifuge tubesFroggaBioTB50
AbC Total Antibody Compensation Beads ThermoFisherA10497
Ammonium Chloride, Reagent GradeBioshopAMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µgBiotium92307
Aquatex Aqueous Mounting MediumMerck108562
Biolaminin 411 LNBiolaminaLN411
Bovine Serum Albumin (BSA)BioshopALB001
Calcium ChlorideBioshopCCL444.500
Collagenase Type IIGibco17101015
CountBright Plus Absolute Counting BeadsThermoFisherC36995
DexamethasoneMillipore SigmaD4902
DispaseGibco17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Gibco11995-065(+)4.5 g/L D-Glucose
(+)L-Glutamine
(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTAFisherScientificS311
FACSClean SolutionBeckton Dickenson340345
FACSDiva SoftwareBeckton Dickenson--
FACSRinse SolutionBeckton Dickenson340346
Fetal Bovine SerumSigmaF1051
Flow Cytometry Sheath FluidBeckton Dickenson342003
FlowJo SoftwareBeckton Dickenson--
Fluorescent Mounting MediumDakoS302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibodyInvitrogenA21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibodyInvitrogenA11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibodyInvitrogenA21429
Goat SerumGibco16210-064
Ham's F10 MediaThermoFisher 11550043(+) Phenol Red
(+) L-Glutamine
(-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)Multicell311-513-CL
Heat Inactivated Horse SerumGibco26050-088
HemocytometerReichertN/A
HEPES, minimum 99.5% titrationSigmaH3375
Horse SerumThermoFisher16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1)Cell Signaling8915LF
Humulin RLillyHI0210
IBMXMillipore SigmaI5879Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
IsopropanolSigmaI9516Also known as 2-propanol
Lewis Rat, FemaleCharles River Kingston004 (Strain Code)200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop CytometerBeckton Dickenson--
MicrocentrifugeEppendorfEP-5417R
MoFlo XDP Cell SorterBeckman Coulter--
Mouse Anti-CD31::FITC AntibodyAbcamab33858Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC AntibodyBiolegend202205Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE AntibodyBiolegend200403Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/AAlso known as MF20
Mouse Anti-Pax7 AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 %SigmaHT501128
Oil Red OMillipore SigmaO0625
PE-Cy7 Conjugation KitAbcamab102903
Penicillin-StreptomycinSigma P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)Gibco10010-023(-)Calcium Chloride
(-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent GradeBioshopPBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) AntibodyInvitrogenMA5-32347FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 AntibodyAbcamab203254
Rabbit Anti-Laminin AntibodySigmaL9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 AntibodyAbcamab3526
Rabbit Anti-Sca-1 AntibodyMillipore SigmaAB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I AntibodyAbcamab260043Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha AntibodyAbcamab203491
Recombinant Human FGF-basicGibcoPHG0266
Sodium AzideSigmaS2002
Triton-X-100Fisher ScientificBP151
TroglitazoneMillipore SigmaT2573
Tween-20BioshopTWN510

References

  1. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12, 153-163 (2010).
  2. Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
  3. Uezumi, A., Ikemoto-Uezumi, M., Tsuchida, K. Roles of nonmyogenic mesenchymal progenitors in pathogenesis and regeneration of skeletal muscle. Frontiers in Physiology. 5, 1-11 (2014).
  4. Biswas, A. A., Goldhamer, D. J. FACS fractionation and differentiation of skeletal-muscle resident multipotent Tie2+ progenitors. Methods in Molecular Biology. 1460, 255-267 (2016).
  5. Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1-10 (2019).
  6. Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46 (2), 135-143 (2018).
  7. Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
  8. Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. Journal of Cell Science. 124 (21), 3654-3664 (2011).
  9. Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
  10. Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  11. Madaro, L., et al. Denervation-activated STAT3-IL-6 signalling in fibro-adipogenic progenitors promotes myofibres atrophy and fibrosis. Nature Cell Biology. 20 (8), 917-927 (2018).
  12. Heredia, J. E., et al. Type 2 innate signals stimulate fibro/adipogenic progenitors to facilitate muscle regeneration. Cell. 153 (2), 376-388 (2013).
  13. Fiore, D., et al. Pharmacological blockage of fibro/adipogenic progenitor expansion and suppression of regenerative fibrogenesis is associated with impaired skeletal muscle regeneration. Stem Cell Research. 17 (1), 161-169 (2016).
  14. Kang, X., et al. Interleukin-15 facilitates muscle regeneration through modulation of fibro/adipogenic progenitors. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 1-11 (2018).
  15. Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., Mcmillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e2782 (2011).
  16. Iyer, S. R., Valencia, A. P., Hernández-Ochoa, E. O., Lovering, R. M. In vivo assessment of muscle contractility in animal studies. Methods in Molecular Biology. 1460, 293-307 (2016).
  17. Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487 (2016).
  18. Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50183 (2013).
  19. Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. (71), e50036 (2013).
  20. Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696 (2019).
  21. Iohom, G., et al. Long-term evaluation of motor function following intraneural injection of ropivacaine using walking track analysis in rats. British Journal of Anaesthesia. 94 (4), 524-529 (2005).
  22. Brown, C. J., et al. Self-evaluation of walking-track measurement using a sciatic function index. Microsurgery. 10 (3), 226-235 (1989).
  23. Bozkurt, A., et al. CatWalk gait analysis in assessment of functional recovery after sciatic nerve injury. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 91-98 (2008).
  24. Deumens, R., Jaken, R. J. P., Marcus, M. A. E., Joosten, E. A. J. The CatWalk gait analysis in assessment of both dynamic and static gait changes after adult rat sciatic nerve resection. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 120-130 (2007).
  25. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 2018, 1-11 (2018).
  26. Jensen, A. R., et al. Neer Award 2018: Platelet-derived growth factor receptor α co-expression typifies a subset of platelet-derived growth factor receptor β-positive progenitor cells that contribute to fatty degeneration and fibrosis of the murine rotator cuff. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 27 (7), 1149-1161 (2018).
  27. Mosich, G. M., et al. Non-fibro-adipogenic pericytes from human embryonic stem cells attenuate degeneration of the chronically injured mouse muscle. JCI Insight. 4 (24), (2019).
  28. Lee, D., et al. HMGB2 is a novel adipogenic factor that regulates ectopic fat infiltration in skeletal muscles. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  29. Low, M., Eisner, C., Rossi, F. Fibro/Adipogenic Progenitors (FAPs): Isolation by FACS and Culture. Muscle Stem Cells: Methods and Protocols. , 179-189 (2017).
  30. Giuliani, G., et al. SCA-1 micro-heterogeneity in the fate decision of dystrophic fibro/adipogenic progenitors. Cell Death and Disease. 12 (1), 1-24 (2021).
  31. Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
  32. Upadhyay, G. Emerging role of lymphocyte antigen-6 family of genes in cancer and immune cells. Frontiers in Immunology. 10, 819 (2019).
  33. Boscolo Sesillo, F., Wong, M., Cortez, A., Alperin, M. Isolation of muscle stem cells from rat skeletal muscles. Stem Cell Research. 43, 101684 (2020).
  34. Ciaramitaro, P., et al. Traumatic peripheral nerve injuries: Epidemiological findings, neuropathic pain and quality of life in 158 patients. Journal of the Peripheral Nervous System. 15 (2), 120-127 (2010).
  35. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of upper and lower extremity peripheral nerve injuries in a population of patients with multiple injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45 (1), (1998).
  36. Malik, S. Traumatic peripheral neuropraxias in neonates: A case series. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (10), 10-12 (2014).
  37. Smith, B. W., Daunter, A. K., Yang, L. J. S., Wilson, T. J. An update on the management of neonatal brachial plexus palsy-replacing old paradigms a review. JAMA Pediatrics. 172 (6), 585-591 (2018).
  38. Rebolledo, D. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle fibrosis is mediated by CTGF/CCN2 independently of TGF-β. Matrix Biology. 82, 20-37 (2019).
  39. Walls, P. L. L., McRae, O., Natarajan, V., Johnson, C., Antoniou, C., Bird, J. C. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  40. Yuen, D. A., et al. Culture-modified bone marrow cells attenuate cardiac and renal injury in a chronic kidney disease rat model via a novel antifibrotic mechanism. PLOS One. 5 (3), 9543 (2010).
  41. Fukada, S. I. The roles of muscle stem cells in muscle injury, atrophy and hypertrophy. Journal of Biochemistry. 163 (5), 353-358 (2018).
  42. Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 1-11 (2017).
  43. Chapman, M. A., Mukund, K., Subramaniam, S., Brenner, D., Lieber, R. L. Three distinct cell populations express extracellular matrix proteins and increase in number during skeletal muscle fibrosis. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 312 (2), 131-143 (2016).
  44. Hillege, M., Galli Caro, R., Offringa, C., de Wit, G., Jaspers, R., Hoogaars, W. TGF-β regulates Collagen Type I expression in myoblasts and myotubes via transient Ctgf and Fgf-2 Expression. Cells. 9 (2), 375 (2020).
  45. Kafadar, K. A., Yi, L., Ahmad, Y., So, L., Rossi, F., Pavlath, G. K. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
  46. Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50657 (2013).
  47. Carlson, B. M. The biology of long-term denervated skeletal muscle. European Journal of Translational Myology. 24 (1), (2014).
  48. Kennedy, E., et al. Embryonic rat vascular smooth muscle cells revisited - A model for neonatal, neointimal SMC or differentiated vascular stem cells. Vascular Cell. 6 (1), 1-13 (2014).
  49. Pannérec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development (Cambridge). 140 (14), 2879-2891 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

172 FACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved