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Resumen

Este protocolo describe un método para aislar progenitores fibroadipogénicos (FAP) y progenitores miogénicos (MP) del músculo esquelético de rata. La utilización de la rata en modelos de lesión muscular proporciona una mayor disponibilidad de tejido del músculo atrófico para el análisis y un repertorio más amplio de métodos validados para evaluar la fuerza muscular y la marcha en animales que se mueven libremente.

Resumen

Los progenitores fibroadiogénicos (FAP) son células intersticiales residentes en el músculo esquelético que, junto con los progenitores miogénicos (MP), desempeñan un papel clave en la homeostasis, lesión y reparación muscular. Los protocolos actuales para la identificación y el aislamiento de LOS FAP utilizan citometría de flujo/clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y los estudios que evalúan su función in vivo hasta la fecha se han realizado exclusivamente en ratones. El mayor tamaño inherente de la rata permite un análisis más exhaustivo de los FAPs en modelos de lesión del músculo esquelético, especialmente en el músculo severamente atrófico o cuando los investigadores requieren una masa de tejido sustancial para realizar múltiples ensayos aguas abajo. La rata también proporciona una selección más amplia de ensayos funcionales musculares que no requieren sedación o sacrificio animal, minimizando así la morbilidad y el uso de animales al permitir evaluaciones en serie. Los protocolos de citometría de flujo/FACS optimizados para ratones son específicos de cada especie, especialmente restringidos por las características de los anticuerpos disponibles comercialmente. No se han optimizado para separar los FAP de la rata o el músculo altamente fibrótico. Se desarrolló un protocolo de citometría de flujo/FACS para la identificación y aislamiento de FAPs y MPs de músculo esquelético de rata sano y denervado, basándose en la expresión diferencial de los marcadores de superficie CD31, CD45, Sca-1 y VCAM-1. Como los anticuerpos primarios validados por citometría de flujo específicos de ratas están severamente limitados, se realizó la conjugación interna del anticuerpo dirigido a Sca-1. Utilizando este protocolo, se confirmó la conjugación exitosa de Sca-1, y la identificación citométrica de flujo de FAPs y MPs fue validada por cultivo celular e inmunotinción de FAPs y MPs aislados de FACS. Finalmente, informamos un nuevo curso de tiempo de FAPs en un modelo prolongado (14 semanas) de denervación de ratas. Este método proporciona a los investigadores la capacidad de estudiar FAPs en un nuevo modelo animal.

Introducción

Las células progenitoras fibroadipogénicas (FAP) son una población de células progenitoras multipotentes residentes en el músculo esquelético que desempeñan un papel crítico en la homeostasis, reparación y regeneración muscular y, por el contrario, también median las respuestas patológicas a la lesión muscular. Como su nombre indica, los FAP se identificaron originalmente como una población progenitora con el potencial de diferenciarse en fibroblastos y adipocitos1 y se pretendía que fueran los mediadores clave de la infiltración fibrograsa del músculo esquelético en lesiones y enfermedades crónicas. Estudios posteriores revelaron que los FAPs son adicionalmente capaces de osteogénesis y condrogénesis2,3,4. Por lo tanto, se anotan más ampliamente en la literatura como progenitores mesenquimales o estromales3,5,6,7,8. En la lesión aguda del músculo esquelético, los FAP ayudan indirectamente en la miogénesis regenerativa al proliferar transitoriamente para proporcionar un ambiente favorable para las células satélite musculares activadas y sus contrapartes progenitoras miogénicas (MP) aguasabajo 1,9,10. En paralelo con la regeneración exitosa, los FAP sufren apoptosis, devolviendo sus números a los niveles basales1,9,10,11. En contraste, en la lesión muscular crónica, los FAP anulan las señales pro-apoptóticas, lo que resulta en su persistencia9,10,11 y reparación muscular anormal.

Los estudios in vivo que evalúan los mecanismos celulares y moleculares por los cuales las FAPs median las respuestas musculares han utilizado modelos animales murinos hasta la fecha1,7,9,10, 11,12,13,14. Si bien los ratones genéticamente modificados son herramientas poderosas para su uso en estos análisis, el pequeño tamaño del animal limita la disponibilidad de tejido para el estudio en modelos de lesiones localizadas a largo plazo donde la atrofia muscular puede ser profunda, como la denervación traumática. Además, la medición de la fuerza muscular y la función física requiere mediciones ex vivo o in situ que requieren la terminación del ratón, o métodos in vivo que requieren cirugía y / o anestesia general para permitir la evaluación del rendimiento contráctil muscular15,16,17,18,19,20 . En ratas, existen análisis funcionales musculares bien validados y utilizados a nivel mundial, además de análisis para comportamientos motores más complejos, como el análisis de la marcha (por ejemplo, índice de función ciática, análisis catwalk) y se realizan en animales despiertos y que se mueven espontáneamente21,22,23,24 . Esto también optimiza los principios de morbilidad mínima en la experimentación con animales y el número de animales de investigación utilizados. De este modo, la rata proporciona al investigador de FAPs la flexibilidad adicional de un mayor volumen muscular lesionado para análisis de proteínas y celulares y la capacidad de realizar evaluaciones en serie de la actividad y los comportamientos funcionales estáticos y dinámicos complejos musculares, en el animal alerta.

Los FAP se han identificado y aislado principalmente de muestras de músculo entero utilizando citometría de flujo y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) respectivamente. Se trata de ensayos basados en láser que son capaces de identificar múltiples poblaciones celulares específicas en función de rasgos característicos como el tamaño, la granularidad y una combinación específica de marcadores intracelulares o de superficie celular25. Esto es muy ventajoso en el estudio de un sistema de órganos como el músculo esquelético, ya que la homeostasis y la regeneración son procesos complejos y multifactoriales coordinados por una gran cantidad de tipos de células. Un estudio seminal identificó FAPs, así como MPs, utilizando métodos citométricos de flujo en el músculo esquelético de ratón1. Demostraron que los FAP son de naturaleza mesenquimal, ya que carecían de antígenos de superficie específicos para las células de origen endotelial (CD31), hematopoyético (CD45) o miogénico (Integrin-α7 [ITGA7]), pero expresaron el marcador de células madre mesenquimales Sca-1 (antígeno de células madre 1)1 y se diferenciaron en células fibrogénicas y adipogénicas en cultivo. Otros estudios demostraron el aislamiento exitoso de progenitores mesenquimales en el músculo basado en la expresión de un marcador alternativo de células madre, el receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα)2,7,8 y un análisis posterior reveló que estos probablemente sean la misma población celular que los FAPs3. Los FAP ahora se identifican comúnmente en citometría de flujo utilizando Sca-1 o PDGFRα como un marcador de selección positivo1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . Sin embargo, el uso de PDGFRα es preferencial para el tejido humano, ya que aún no se ha identificado un homólogo humano directo de Sca-1 murino32. Además, otras proteínas de la superficie celular han sido reportadas como marcadores de MPs (por ejemplo, VCAM-1), proporcionando una alternativa potencial a ITGA7 como indicador de células de linaje miogénico durante el aislamiento de FAPs33.

Si bien la citometría de flujo/FACS es una metodología poderosa para estudiar el papel y el potencial patogénico de los FAPs en el músculo esquelético1,9,10,11, 13,29,está limitada técnicamente por la especificidad y optimización de sus reactivos requeridos. Dado que la identificación citométrica de flujo y el aislamiento de FAPs se ha desarrollado y llevado a cabo en modelos animalesde ratón 1,9,10, 11,29,esto plantea desafíos para los investigadores que desean estudiar FAPs en otros organismos modelo. Muchos factores, como el tamaño óptimo del tejido a procesar, así como la especificidad y disponibilidad de reactivos y / o anticuerpos, difieren según la especie utilizada.

Además de las barreras técnicas para estudiar los FAP en un nuevo modelo animal, se han estudiado en gran medida en un entorno agudo y tóxico, generalmente a través de una inyección química intramuscular o cardiotoxina. La evaluación de la dinámica a largo plazo de los FAPs se limita principalmente a la evaluación en la distrofia muscular de Duchenne, utilizando el modelo de ratón mdx9,10,11,y modelos de lesión muscular combinada como el desgarro masivo del manguito rotador donde se realiza transección y denervación concurrente del tendón en la musculatura del hombro26,27,28 . La respuesta de los FAP al único insulto de la denervación traumática crónica, una ocurrencia común en accidentes en el lugar de trabajo en la industria pesada, la agricultura y en traumas de nacimiento (lesión del plexo braquial)34,35,36,37 con morbilidad significativa, no se ha caracterizado tan bien, a menudo limitada a un marco de tiempo a corto plazo11,38.

Describimos un método para identificar y aislar FAPs y MPs de músculo esquelético sano, así como severamente atrófico y fibrótico en la rata. En primer lugar, se demuestra la identificación de CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs y CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ utilizando un protocolo de tinción de digestión tisular y citometría de flujo y posterior validación de nuestros hallazgos mediante cultivo y tinción inmunocitoquímica de células aisladas de FACS. Usando este método, también informamos un nuevo curso de tiempo de FAPs en un modelo de lesión por denervación aislada a largo plazo en la rata.

Protocolo

Los investigadores que llevan a cabo este protocolo deben recibir el permiso de su junta local de ética animal / comité de cuidado. Todo el trabajo con animales fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de St. Michael's Hospital Unity Health Toronto (ACC # 918) y se llevó a cabo de acuerdo con las pautas establecidas por el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales (CCAC). Un esquema del protocolo de citometría de flujo se muestra en la Figura 1. Si la aplicación posterior es FACS y el cultivo celular posterior, todos los pasos deben completarse con la técnica aséptica adecuada.

1. Cosecha muscular

  1. Anestesiar a las ratas usando un anestésico apropiado y sacrificar de acuerdo con el vivero local y las pautas de la junta de ética animal. Este protocolo cosecha el músculo gastrocnemio de ratas Lewis hembras adultas (200-250 g), como ejemplo. Las ratas fueron anestesiadas con isoflurano al 2-3% y fueron sacrificadas por inyección intracardíaca de T61.
  2. Una vez sacrificado el animal, afeitar toda la extremidad posterior para facilitar la localización del músculo y minimizar la contaminación del pelaje del tejido cosechado.
  3. Usando un bisturí estéril, haga dos incisiones en la piel: la primera alrededor de la circunferencia de la articulación del tobillo y la segunda en la línea media del aspecto medial de la extremidad posterior desde el tobillo hasta la cadera.
  4. Pelar hacia atrás la piel y las capas musculares superficiales para revelar el gastrocnemio subyacente, que se origina en los cóndilos medial y lateral del fémur y se inserta en el tendón de Aquiles.
  5. Use la disección contundente para separar el gastrocnemio del tejido circundante, manejando el músculo solo por el tendón para evitar lesiones por aplastamiento.
  6. Separe el gastrocnemio de su inserción transectando el tendón de Aquiles lo más distalmente posible con tijeras afiladas. Una vez cortado, agarre el tendón de Aquiles con fórceps y despegue suavemente el gastrocnemio del hueso subyacente. Aún sosteniendo el músculo con fórceps en una mano, localice los dos orígenes del gastrocnemio y corte en los cóndilos femoral medial y lateral.
  7. Seque el gastrocnemio extirpado suavemente contra un trozo estéril de gasa para extraer la mayor cantidad de sangre posible. Recorte el músculo en una superficie estéril y elimine cualquier exceso de tejido conectivo, así como el tendón de Aquiles.
  8. Coloque el músculo en un bote de pesaje y pese con una báscula de precisión. Este protocolo está optimizado para digerir el músculo con un peso húmedo que oscila entre 200-600 mg. Los operadores pueden subdividir el exceso de tejido cosechado para otros ensayos aguas abajo, si lo desean.
  9. Divida suavemente el músculo cosechado para usarlo para la citometría de flujo en 3-4 piezas más pequeñas (aproximadamente 1-2 cm3) y sumérjalo en 1x PBS helado. Mantener frío sobre hielo hasta que todas las muestras hayan sido cosechadas.

2. Digestión muscular

  1. Retire el músculo de PBS y colóquelo en un plato de cultivo celular estéril de 10 cm. Rasgar suavemente y picar el tejido con fórceps hasta que las piezas sean de aproximadamente 3-4 mm3,eliminando la mayor cantidad de tejido conectivo posible. Una vez picado completamente, transfiera a un tubo cónico estéril de 50 ml que contenga 6 ml de DMEM + 1% de penicilina/estreptomicina (P/S).
  2. Añadir 10 μL de solución de CaCl2 de 300 mM a 365 μL de solución de colagenasa II (concentración de stock 4800 U/mL) para activar la enzima colagenasa. Añadir la solución de colagenasa II activada al tubo cónico de 50 ml que contiene la suspensión tisular. La concentración final de colagenasa II es de 250 U/mL.
  3. Incubar los tubos en un agitador durante 1 h a 37 °C, 240 x g,asegurándose de girar manualmente cada 15 minutos para desalojar cualquier tejido que se haya adherido al lado del tubo.
  4. Después de 1 h, retire los tubos del agitador y agregue lo siguiente por muestra: 100 μL de Colagenasa II (4.800 U/mL) y 50 μL de Dispasa (4,8 U/mL).
  5. Muestras de pipeta utilizando una pipeta serológica 15-20 veces hasta que la solución sea homogénea. Si procesa varias muestras, use una pipeta estéril separada para cada muestra para evitar la contaminación cruzada de la muestra.
  6. Incubar de nuevo en un agitador durante 30 min a 37 °C y 240 x g. Después de 15 minutos, agite las muestras a mano para desalojar el tejido adherente del lado del tubo.

3. Generación de suspensión monocelular

  1. Corte lentamente las muestras a través de una jeringa de 10 ml con una aguja de 20 G durante 10 ciclos.
    NOTA: Un ciclo consiste en tomar la solución muscular en una jeringa e inyectarla de nuevo en el tubo. Asegúrese de minimizar cualquier burbuja completando el cizallamiento lentamente, ya que la espuma excesiva puede causar muerte celular adicional39.
  2. Coloque un colador de células de 40 μm en un tubo cónico estéril de 50 ml y moje mediante pipeteo de 5 ml DMEM + 10% FBS y 1% P / S.
  3. Pipetear 1 ml de la muestra a la vez a través del colador celular.
  4. Lave el colador celular pipeteando DMEM con 10% FBS y 1% P / S a través del colador para llevar el volumen total en el tubo a 25 ml.
  5. Dividir 25 ml de la muestra por igual en dos tubos cónicos de 15 ml y centrífuga a 15 °C, 400 x g durante 15 min.
    NOTA: Dividir la solución muscular en dos tubos cónicos de 15 ml garantiza una mejor recuperación celular después de la centrifugación en comparación con un solo tubo.
  6. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 1 mL 1x tampón de lisis de rbc (ver Archivo complementario)a temperatura ambiente durante 7 min para eliminar los eritrocitos.
  7. Suba el volumen a 10 ml con 9 ml de tampón de lavado (consulte el archivo complementario)y escinta los tubos a 400 x g,15 °C durante 15 min.
  8. Aspire el sobrenadante y recombine los gránulos volviendo a suspender en un tampón de lavado de 1 ml.
  9. Transfiera un volumen apropiado de células a un tubo de microcentrífuga separado de 1,5 ml y mézclelo con tinte azul tripano. Cuente las células vivas en un microscopio de luz utilizando un hemocitómetro.

4. Tinción de anticuerpos para citometría de flujo

NOTA: El anticuerpo Sca-1 debe conjugarse con APC antes de los experimentos de citometría de flujo / FACS, según las instrucciones del fabricante. El rendimiento debe validarse para cada lote de conjugados (Figura 2). Las conjugaciones finales se pueden almacenar en alícuotas de 20 μL a -20 °C y son estables durante tres semanas. Consulte el Archivo suplementario para obtener el protocolo de conjugación completo.

  1. Para la citometría de flujo, transfiera 1-2 x 106 células por muestra experimental a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml. Lleve el volumen hasta 1 ml con tampón de lavado y colóquelo sobre hielo.
  2. Para cada experimento, establezca los siguientes controles requeridos: i) no teñidos y ii) controles de viabilidad para seleccionar con precisión la población de células vivas; iii) controles de fluorescencia menos uno (FMO) en suspensiones de una sola célula para establecer puertas precisas para fracciones CD31- / CD45- , FAPs y MPs; y iv) cuentas de compensación de una sola mancha para corregir el derrame de fluorescencia entre canales.
    1. Para todos los controles celulares, alícuota 5 x10 5 - 1 x 106 celdas en 1 ml de tampón de lavado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y colóquela sobre hielo.
    2. Para los controles de perlas, agregue 1 gota de perlas de compensación positiva (~ 1.5 x 105 cuentas por gota) a cada tubo de microcentrífuga etiquetado de 1.5 ml. El complemento completo de controles se enumera en la Tabla 1.
      NOTA: Si el experimento se realiza por primera vez, ejecute controles de una sola teñida para cada anticuerpo conjugado en suspensiones de células individuales (además de los controles de perlas de compensación no teñidas, viabilidad, de una sola mancha y FMO) para evaluar la población teñida positiva en las células y validar la tinción observada en las perlas de compensación. Valide cada preparación Sca-1::APC recién conjugada realizando tinciones simples en perlas de compensación y suspensiones de una sola célula. Consulte la Tabla 1 para obtener una lista completa de los controles de tinción.
  3. Para preparar el control de viabilidad, transfiera la mitad del volumen de células del tubo de "viabilidad" a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Etiquete este tubo como "Muerto".
  4. Incubar el tubo "Muerto" a 65 ° C durante 2-3 minutos para matar las células, luego colocarlo en hielo. Después de 2-3 min, vuelva a combinar las células muertas con las células vivas que permanecen en el tubo de control de viabilidad. Esta población de células se utilizará para establecer valores de compensación (si es necesario) y establecer correctamente las puertas para el tinte de viabilidad.
  5. Centrifugar las suspensiones unicelulares (muestras experimentales y controles) a 500 x g,4 °C durante 5 min.
  6. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos celulares en un tampón de lavado de 100 μL.
  7. Añadir anticuerpos, dependiendo de la muestra experimental o control. Consulte la matriz de tinción (Tabla 2) para obtener información sobre combinaciones y cantidades de anticuerpos.
  8. Mueva suavemente cada muestra para asegurar una mezcla completa e incube en hielo en la oscuridad durante 15 minutos. Para las perlas de compensación, incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 minutos.
  9. Para muestras experimentales y de control de suspensión unicelular, eleve el volumen a 1 ml agregando un tampón de lavado de 900 μL. Para los controles de perlas de compensación, suba el volumen a 1 ml con 900 μL de 1x PBS.
  10. Muestras de suspensión unicelular centrífuga a 500 x g,4 °C durante 5 min. Controles de perlas de compensación de centrífugas a 300 x g,4 °C durante 5 min.
  11. Para todas las muestras de suspensión de una sola célula, aspire y deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de célula en un tampón de lavado de 300 μL. Para los controles de perlas de compensación, aspire y deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 300 μL de 1x PBS, luego agregue 1 gota (~ 1.5 x 105) de cuentas de compensación negativa.
  12. Mantenga todas las muestras de suspensión de una sola célula en hielo bajo papel de aluminio y proceda a la adquisición citométrica de flujo. Los controles de perlas de compensación también deben protegerse de la luz, pero se pueden mantener a temperatura ambiente.
    NOTA: Si el criterio de valoración experimental es la identificación de FAPs por citometría de flujo, siga los pasos 5.1.1-5.1.11. Si el criterio de valoración es el aislamiento celular a través de FACS para cultivo y tinción, siga los pasos 5.2.1-5.2.9 y las secciones 6-7.

5. Citometría de flujo y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)

  1. Citometría de flujo
    NOTA: Este protocolo emplea un citómetro de flujo de sobremesa equipado con láseres de 405 nm, 488 nm y 640 nm que son capaces de distinguir simultáneamente 10 colores diferentes. Los filtros de paso de banda y sus fluorocromos asociados utilizados en este protocolo son los siguientes: 450/50 (SYTOX Blue), 530/30 (FITC), 575/25 (PE) y 670/30 (APC). Los voltajes para cada detector son los siguientes: FSC 700; SSC 475; FITC 360; PE 460; PE-Cy7 600; SYTOX Azul 360; APC 570. Asegúrese de estar capacitado en el funcionamiento adecuado del citómetro de flujo o clasificador celular antes de su uso.
    1. Asegúrese de que el citómetro se haya encendido durante 10-20 minutos antes de su uso y se haya cebado limpiando secuencialmente con soluciones de líquido limpio, enjuague y vaina durante 30-45 s cada una. Termine con un enjuague con dH2O. Asegúrese de que se haya agregado un volumen adecuado de líquido de vaina al recipiente de almacenamiento para mantener el flujo de muestra adecuado durante toda la adquisición.
    2. Configure la estrategia de cierre para identificar los FAPs y los MPs como se delinea en la Figura 3.
      NOTA: Los FAPs y MPs se identifican mediante la siguiente estrategia de gating jerárquico: i) SSC-A vs FSC-A (área de dispersión de celdas laterales versus área de dispersión de celdas hacia adelante para separar celdas vs escombros), ii) FSC-W vs FSC-H (ancho de dispersión de celdas hacia adelante versus altura de dispersión de celdas hacia adelante para discriminar singletes de dobletes en el parámetro FSC), iii) SSC-W vs SSC-H (ancho de dispersión de celda lateral versus altura de dispersión de celda lateral para discriminar singletes de dobletes en el parámetro SSC), iv) SSC-A vs SYTOX Blue (para distinguir singletes vivos versus muertos), v) SSC-A vs CD31/45::FITC (para excluir las células CD31+ y CD45+ de análisis posteriores), y vi) Sca-1::APC vs VCAM-1::P E del CD31-/CD45- (Linaje; Lin-) población (identificación de FAPs y MPs). Los FAP se identifican como eventos CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- y los MPs se identifican como eventos CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+.
    3. Primero ejecute cada control de perla de compensación de una sola teñida a través del citómetro a baja velocidad para generar valores de compensación utilizados para corregir cualquier derrame de fluorescencia entre canales. Evalúe la compensación comparando la señal fluorescente de cada control en su propio detector (por ejemplo, SSC-A vs APC para Sca-1: : APC cuentas de una sola teñida), así como todos los demás detectores. Debe haber dos poblaciones distintas (una con señal negativa y otra con señal positiva) en el detector apropiado y solo una población negativa en todos los demás detectores. Establezca la puerta de parada en 10,000 eventos de cuentas de compensación y registre los datos.
      NOTA: Entre la adquisición de cada muestra, asegúrese de pasar dH2O a través del citómetro durante 10-20 segundos para evitar la contaminación de muestra a muestra.
    4. A continuación, procese las muestras de control no teñidas y de viabilidad para que se cierren correctamente en células individuales vivas. Establezca la puerta de parada en 10.000 eventos singlet y registre datos.
      NOTA: Aproximadamente 5 minutos antes de la adquisición de cada muestra de suspensión de una sola célula, con la excepción de la muestra no teñida, agregue 1 μL de colorante de viabilidad SYTOX Blue (concentración de trabajo de 300 μM diluida a partir de una solución madre de 1 mM) a cada muestra y mueva suavemente para mezclar (concentración final de 1 μM).
    5. A continuación, adquiera las muestras de control de suspensión de una sola celda restantes. Evaluar cada control FMO con su gráfica apropiada en la estrategia de gating (Figura 3). Por ejemplo, evalúe la señal FITC del FMO CD31+CD45 para garantizar una puerta CD31-/CD45- precisa. Un ejemplo óptimo se muestra en la Figura 3G. Si el protocolo se realiza por primera vez, los controles de una sola teñida en las células deben ejecutarse antes de la adquisición de los controles FMO.
    6. Evalúe la señal fluorescente de cada muestra de célula teñida individualmente en su detector apropiado, así como en todos los demás detectores para validar la compensación adecuada. Establezca la puerta de parada en 10,000 eventos singlet en vivo y grabe en el software.
    7. Una vez que se hayan procesado todos los controles (suspensiones y perlas de una sola célula), prepare todas las muestras experimentales midiendo y registrando primero el volumen de cada muestra. Estas mediciones se utilizarán para cuantificar con precisión los FAPs y MPs, como se describe en el paso 5.1.11. Luego, agregue 50 μL de cuentas de conteo de precisión y mezcle suavemente mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces.
    8. Ejecute brevemente la primera muestra experimental para validar la identificación de la población de cuentas de conteo. Esta población aparece como un pequeño grupo distinto separado de la población celular general en la gráfica FSC-A vs SSC-A(Figura 3A,cuadro rojo). Cree una puerta alrededor de la población de cuentas de conteo. Luego adquiera datos para cada muestra experimental procesando a través del citómetro a baja velocidad. Establezca la puerta de parada en 10,000 eventos de cuentas de conteo y registre.
      NOTA: Los investigadores pueden identificar alternativamente las cuentas de conteo mediante la configuración de una gráfica adicional que evalúe SSC-A frente a cualquiera de los detectores, ya que las cuentas de conteo son fluorescentes en todos los detectores.
    9. Después de que todas las muestras hayan sido procesadas, limpie el citómetro utilizando los protocolos apropiados. Exporte todos los datos para su análisis.
    10. Abra todos los archivos de datos en un software de análisis de citometría de flujo adecuado. Establezca la estrategia de cierre como se utiliza para la adquisición de datos como se describe en el paso 5.1.2. Examine los controles en el mismo orden que en la adquisición de datos (por ejemplo, sin manchar, viabilidad, tinción única, luego controles FMO) para volver a validar la estrategia de cierre. Una vez que se hayan establecido puertas precisas utilizando controles FMO, aplique las puertas a todas las muestras experimentales. Exporte datos sin procesar como una hoja de cálculo para la cuantificación.
    11. Calcule el número de FAPs y MPs en cada muestra experimental usando las cuentas de conteo:
      figure-protocol-18309
      donde, Recuento de células adquiridas es el número de eventos registrados de la población celular pertinente (por ejemplo, FAPs o MPs) en el software de adquisición; El recuento de cuentas adquiridas es el número de eventos registrados de conteo de cuentas en el software de adquisición; Counting Beads Volume es el volumen de solución de counting bead agregado en el paso 5.1.7; Volumen de muestra es el volumen de cada muestra experimental teñida antes de la adición de cuentas de conteo. Concentración de perlas es el número de perlas por μL de solución; este valor se encuentra en la hoja de datos del producto.
  2. FACS - clasificación para cultivo celular
    NOTA: Este protocolo realiza FACS en un clasificador celular equipado con 4 láseres (UV, Violeta, Azul, Rojo) que es capaz de distinguir simultáneamente 11-14 colores. Siga el protocolo experimental de tinción de muestras (sección 4) y citometría de flujo, con las excepciones de los pasos 1 a 3 que se describen a continuación, para optimizar el flujo de trabajo de FACS:
    1. Aumentar la concentración de células en las muestras experimentales a clasificar a 7 x 106 células/ml para generar rendimientos robustos de FAPs y MPs.
    2. Para explicar este aumento significativo en la concentración celular, duplique todas las concentraciones de anticuerpos en las muestras experimentales que se clasificarán.
    3. Procese las muestras finales de células teñidas a través de una tapa de filtro de células de 40 μM fijada a un tubo de poliestireno de 5 ml inmediatamente antes de la clasificación para reducir la aglomeración celular y aumentar los rendimientos de clasificación.
    4. Recolecte FAPs y MPs de ratas únicas y vivas directamente del clasificador celular en un tubo de recolección de polipropileno de 5 ml que contenga 1 ml de suero bovino estéril y 100% fetal (FBS). Mantenga las células en hielo hasta que se complete la clasificación.
      NOTA: Si realiza FACS en una ubicación fuera del sitio, transfiera todas las celdas clasificadas en hielo y en un contenedor seguro y cubierto.
    5. Trabajando en un gabinete de bioseguridad estéril (BSC), lleve el volumen de células clasificadas hasta 7 ml con medios de crecimiento apropiados (por ejemplo, medios de crecimiento FAP (FAP GM) para FAP clasificados y medios de crecimiento MP (MP GM) para MPs clasificados; consulte el Archivo complementario para recetas) y centrífuga a 500 x g, 4 ° C durante 7 minutos para eliminar la mayor cantidad posible de tampón de lavado residual.
    6. Resuspend pellets en 1 ml de medios de crecimiento apropiados y placa en una placa de 12 pocillos que contenga una cubierta/pocillo de vidrio estéril recubierto de colágeno de 12 mm para su posterior inmunotinción (ver sección 6).
      NOTA: Si la inmunocitoquímica tiñe para el colágeno, las células clasificadas en placa en una placa de 12 pocillos que contiene una cubierta de vidrio estéril, recubierta de laminina de 12 mm / pozo, en lugar de recubierta de colágeno. Si se requieren experimentos de inmunocitoquímica de progenitores aislados inmediatamente, sembra FAPs y MPs a una densidad de 15,000 células por cm2 y proceda directamente al paso 6.1. Para cultivos a largo plazo para inducir la diferenciación de progenitores, semillas FAPs a una densidad de 5.000 células por cm2, y MPs a una densidad de 7.500 células por cm2.
    7. Incubar células a 37 °C y 5% de CO2 en una incubadora de cultivo celular. Después de las 72 h en cultura, cambia la mitad de los medios de comunicación. Cambie completamente los medios cada 2-4 días después.
    8. Para inducir el desarrollo de miocitos, cambie las culturas de los MP al medio de diferenciación de MP (MD) en el Día 9 de la cultura. Para inducir adipocitos, cambie los cultivos de FAP al medio de diferenciación adipogénica (EA) faP en el día 10 del cultivo.
    9. Para inducir la fibrogénesis, los FAP pueden cambiarse a medios de diferenciación fibrogénica (DF) en momentos variables durante el cultivo o, alternativamente, pueden sembrarse directamente en medios FD después del aislamiento (paso 5.2.6) (Consulte el archivo complementario para todas las recetas de medios).

6. Inmunocitoquímica de FAPs y MPs cultivados

  1. Para validar la clasificación celular y demostrar la pureza de los cultivos DE FAPs y MPs, inmunotinta con marcadores específicos de tipo celular que incluyen PDGFRα (marcador de FAPs), Pax-7 (marcador de células madre muscular [satélite], proteína específica de fibroblastos (FSP-1, marcador de fibroblastos), perilipina-1 (Plin-1, marcador de adipocitos), colágeno tipo 1 (Col1a1, indicador de fibrosis), cadena pesada de miosina (MHC, marcador de miocitos maduros).
    1. Para la inmunotinción de células recién clasificadas, centrifugue la placa de 12 pocillos a 200 x g durante 3 min a temperatura ambiente para facilitar la adherencia de las células a la cubierta / pozo. Este paso no es necesario para las culturas a largo plazo. Quitar medios de cultivo.
    2. Para la inmunotinción con FSP-1, fije las células con 1 ml de metanol 100% (MeOH) durante 2 minutos a 4 °C. Si se inmunotinúa para PDGFRα, Plin-1, Pax7 o Col1a1, fije cultivos celulares con 1 ml de PFA al 4% en 1x PBS durante 15 min a temperatura ambiente. La inmunotinción MHC tolera cualquiera de los dos fijadores.
      NOTA: Para las celdas fijas con metanol, omita el paso 6.2 y continúe con el paso 6.3.
  2. Aspire 4% de PFA y lave rápidamente los cultivos celulares 3-4 veces con 1x PBS. Agregue 1 ml de glicina de 100 mM en 1x PBS e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente para inactivar el PFA residual. Aspire y lave 1-2 veces con 1x PBS.
    NOTA: Las células se pueden dejar en esta etapa en 2 ml de 1x PBS, envueltas en película adhesiva y almacenadas a 4 ° C durante 7-10 días como máximo.
  3. Después del lavado, agregue 1 ml de Triton-X al 0.1% en 1x PBS e incube durante 20 min para permeabilizar las membranas celulares.
  4. Lave los pocillos 2-3 veces con 1-2 ml de 1x PBS y luego bloquee las celdas con 1 mL de 1x PBS + 3% BSA por pozo durante 1 h a temperatura ambiente.
  5. Pipetear 80 μL de anticuerpo primario diluido en 1x PBS + 3% BSA (PDGFRα 1:100, Pax7 neat, FSP-1 1:50, Plin-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 μg/mL) sobre un trozo de parafilm pegado a un contenedor móvil. Usando fórceps finos estériles, levante cuidadosamente el cobertor del pozo e invierta en la gota de solución de anticuerpos. Incubar el cubrebocas con dos trozos húmedos de toalla de papel y cubrir el recipiente en película de plástico para evitar la evaporación de la solución de anticuerpos. Incubar durante la noche a 4 °C.
    NOTA: La tinción de los cubrebocas fuera del pozo utiliza menos anticuerpos (~ 80 μL) que la tinción dentro del pozo (mínimo de 500 μL).
  6. El día 2, deje los cubrehojas a temperatura ambiente durante 30 minutos para calentarse. Usar fórceps cuidadosamente a la derecha y transferir las hojas de cubierta a sus respectivos pocillos (células hacia arriba) y lavar 2-3 veces con 1-2 ml de 1x PBS durante 2 minutos cada uno para eliminar la mayor cantidad de anticuerpos primarios posible.
  7. Utilizando la misma técnica de tinción que con la tinción primaria de anticuerpos, tiñe las células con el anticuerpo secundario alexa Fluor 488 anti-conejo de cabra (1:400) para detectar FSP-1, Plin-1, Col1a1 o PDGFRα y el anticuerpo secundario anti-ratón de cabra Alexa Fluor 555 (1:300) para detectar MHC o Pax-7. Incubar las células durante 1 h a temperatura ambiente y mantener las células protegidas de la luz.
  8. Devuelva las células al pozo e incube las células con Hoechst (1:10.000) durante 2-4 min a temperatura ambiente. Lave las células otras 2-3 veces con 1x PBS durante 2 minutos cada una para eliminar el exceso de Hoechst.
  9. Monte las fundas en portaobjetos de vidrio utilizando un medio de montaje fluorescente antidesvanecimiento y deje que las diapositivas se sequen durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente. Guarde los cubrecolchas montados a 4 °C en la oscuridad.

7. Tinción de aceite rojo O (ORO) de FAPs y MPs cultivados

  1. Realizar tinción ORO en células no permeabilizadas, ya que la permeabilización de la membrana celular puede resultar en tinción no específica / no deseada de tipos de células no adipogénicas. Antes de comenzar la tinción, prepare un caldo de trabajo ORO (consulte el archivo complementario para la receta) e incube a temperatura ambiente durante 20 min.
  2. Después de 20 min, filtre la solución con un filtro de 0,2 μm para eliminar los agregados no disueltos.
  3. Aspire los medios del pozo y agregue 1 ml de formalina tamponada neutra al 10% (10% NBF). Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
    NOTA: La confluencia celular puede resultar en la elevación del pozo / cubierta. Tenga cuidado al aspirar/agregar soluciones.
  4. Aspirar y añadir 1 mL de NBF fresco al 10% e incubar durante al menos 1 h a temperatura ambiente.
    NOTA: El protocolo se puede detener en este punto, ya que las células se pueden dejar en 10% NBF durante la noche.
  5. Lave rápidamente los pocillos una vez con 1 ml de isopropanol al 60%, luego aspire y deje que los pozos se sequen completamente (aproximadamente 2 min).
  6. Agregue 400 μL de aceite rojo O por pozo e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente, asegurándose de evitar pipetear cualquier ORO en las paredes de la placa.
  7. Retire todo el aceite Rojo O y lave rápidamente el pozo 4 veces con dH2O.
    NOTA: Si los pozos teñidos contienen hojas de cubierta, monte utilizando la misma técnica que se describe en el paso 6.9.
  8. Imagine los labios de cubierta montados o el pozo teñido con un microscopio de campo brillante.

8. Tinción tisular de secciones de gastrocnemio de rata contralateral y denervada

  1. Picrosirius Rojo (PSR)
    1. Realizar tinción PSR en secciones histológicas de parafina gastrocneemius incrustadas en formalina (FFPE) de 5 μm de espesor como se describió anteriormente40.
  2. Aceite Rojo O (ORO)
    1. Fijar secciones histológicas de gastrocnemio de rata congelada con isopentano de 5 μm de espesor en PFA al 4% durante 10 min, incubar en alcohol isopropílico al 60% durante 1 min.
    2. Manchar con material de trabajo ORO durante 12 min. Incubar en alcohol isopropílico al 60% durante 1 min, lavar durante 10 min en dH2O. Montar en fundas utilizando un medio de montaje soluble en agua.
  3. Sca-1 e inmunohistoquímica fluorescente del tejido laminina (IHC)
    1. Realizar IHC fluorescente en secciones histológicas de gastrocneemius de 5 μm de espesor congeladas con isopentano.
    2. Hidrate muestras en 1x PBS durante 5 min, fije en PFA al 4% durante 10 min y luego incube muestras en solución de bloqueo de IF de tejido (ver Archivo suplementario)durante 90 min.
    3. Incubar con anticuerpo primario anti-Sca-1 (1:500) diluido en 1x PBS + 0.05% Tween a 4 °C durante la noche.
    4. El día 2, lavar tres veces en 1x PBS + 0.05% Tween durante 5 min cada uno, luego incubar en cabra anti-conejo Alexa Fluor 555 (1:500) durante 1 h.
    5. Lavar de nuevo (como antes), incubar con solución bloqueadora durante 1 h, luego agregar anticuerpo primario anti-laminina (1:500) diluido en 1x PBS + 0.05% Tween durante 1 h.
    6. Lavar de nuevo (como antes), luego incubar en cabra anti-conejo Alexa Fluor 488 (1:500) durante 1 h (para laminina).
    7. Lavar de nuevo (como antes) y luego incubar en DAPI (1:10.000) durante 4 min. Lave y monte en fundas utilizando un medio de montaje antidesvaneo.

Resultados

Identificación de FAPs y MPs a través de citometría de flujo utilizando un nuevo panel de anticuerpos que incluye Sca-1 y VCAM-1
La estrategia de gating para identificar FAPs en músculo de rata se basa en protocolos de citometría de flujo en elratón 29, que se acercan a las células positivas CD31 (endotelial) y CD45 (hematopoyéticas) (denominadas linaje [Lin]) y examina el perfil fluorescente del marcador FAPs Sca-1 y ...

Discusión

Un protocolo de aislamiento de FAPs optimizado y validado para el músculo de la rata es esencial para los investigadores que desean estudiar modelos de lesiones que no son factibles en el ratón por razones biológicas o técnicas. Por ejemplo, los ratones no son un modelo animal óptimo para estudiar lesiones crónicas locales o neurodegenerativas, como la denervación a largo plazo. Biológicamente, la corta vida útil y el rápido envejecimiento de los ratones dificultan la delineación precisa de las secuaras muscul...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a las instalaciones centrales de citometría de flujo de la Universidad de Ottawa y al Centro de Investigación Keenan para Ciencias Biomédicas (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto por su experiencia y orientación en la optimización del protocolo de citometría de flujo / FACS presentado en este manuscrito. Este trabajo fue financiado por Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) a JB.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL Polypropylene Round-Bottom TubeFalcon352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer CapFalcon352235
10 cm cell culture dishesSarstedt83.3902
12-well cell culture plateThermoFisher130185
12 mm glass coverslips, No.2VWR89015-724
10 mL SyringeBeckton Dickenson302995
15 mL centrifuge tubesFroggaBio91014
20 gauge needleBeckton Dickenson305176
25mL Serological pipetteSarstedt86.1685.001
40µm cell strainerFisher Scientific22363547
50mL centrifuge tubesFroggaBioTB50
AbC Total Antibody Compensation Beads ThermoFisherA10497
Ammonium Chloride, Reagent GradeBioshopAMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µgBiotium92307
Aquatex Aqueous Mounting MediumMerck108562
Biolaminin 411 LNBiolaminaLN411
Bovine Serum Albumin (BSA)BioshopALB001
Calcium ChlorideBioshopCCL444.500
Collagenase Type IIGibco17101015
CountBright Plus Absolute Counting BeadsThermoFisherC36995
DexamethasoneMillipore SigmaD4902
DispaseGibco17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Gibco11995-065(+)4.5 g/L D-Glucose
(+)L-Glutamine
(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTAFisherScientificS311
FACSClean SolutionBeckton Dickenson340345
FACSDiva SoftwareBeckton Dickenson--
FACSRinse SolutionBeckton Dickenson340346
Fetal Bovine SerumSigmaF1051
Flow Cytometry Sheath FluidBeckton Dickenson342003
FlowJo SoftwareBeckton Dickenson--
Fluorescent Mounting MediumDakoS302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibodyInvitrogenA21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibodyInvitrogenA11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibodyInvitrogenA21429
Goat SerumGibco16210-064
Ham's F10 MediaThermoFisher 11550043(+) Phenol Red
(+) L-Glutamine
(-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)Multicell311-513-CL
Heat Inactivated Horse SerumGibco26050-088
HemocytometerReichertN/A
HEPES, minimum 99.5% titrationSigmaH3375
Horse SerumThermoFisher16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1)Cell Signaling8915LF
Humulin RLillyHI0210
IBMXMillipore SigmaI5879Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
IsopropanolSigmaI9516Also known as 2-propanol
Lewis Rat, FemaleCharles River Kingston004 (Strain Code)200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop CytometerBeckton Dickenson--
MicrocentrifugeEppendorfEP-5417R
MoFlo XDP Cell SorterBeckman Coulter--
Mouse Anti-CD31::FITC AntibodyAbcamab33858Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC AntibodyBiolegend202205Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE AntibodyBiolegend200403Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/AAlso known as MF20
Mouse Anti-Pax7 AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 %SigmaHT501128
Oil Red OMillipore SigmaO0625
PE-Cy7 Conjugation KitAbcamab102903
Penicillin-StreptomycinSigma P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)Gibco10010-023(-)Calcium Chloride
(-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent GradeBioshopPBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) AntibodyInvitrogenMA5-32347FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 AntibodyAbcamab203254
Rabbit Anti-Laminin AntibodySigmaL9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 AntibodyAbcamab3526
Rabbit Anti-Sca-1 AntibodyMillipore SigmaAB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I AntibodyAbcamab260043Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha AntibodyAbcamab203491
Recombinant Human FGF-basicGibcoPHG0266
Sodium AzideSigmaS2002
Triton-X-100Fisher ScientificBP151
TroglitazoneMillipore SigmaT2573
Tween-20BioshopTWN510

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