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Resumo

Este protocolo descreve um método para isolar progenitores fibro-adipogênicos (FAPs) e progenitores miogênicos (MPs) do músculo esquelético de rato. A utilização do rato em modelos de lesão muscular proporciona maior disponibilidade tecidual do músculo atroférico para a análise e um repertório maior de métodos validados para avaliar a força muscular e a marcha em animais em movimento livre.

Resumo

Progenitores fibro-adipogênicos (FAPs) são células intersticiciais residentes no músculo esquelético que, juntamente com progenitores miogênicos (MPs), desempenham um papel fundamental na homeostase muscular, lesão e reparo. Os protocolos atuais para identificação e isolamento de FAPs utilizam citometria/fluorescência ativada de triagem celular (FACS) e estudos que avaliam sua função in vivo até o momento foram realizados exclusivamente em camundongos. O maior tamanho inerente do rato permite uma análise mais abrangente das FAPs em modelos de lesão muscular esquelética, especialmente em músculos severamente atroféricos ou quando os pesquisadores requerem massa tecidual substancial para realizar múltiplos ensaios a jusante. O rato também fornece uma seleção maior de ensaios funcionais musculares que não requerem sedação ou sacrifício animal, minimizando assim a morbidade e o uso animal, permitindo avaliações seriais. Os protocolos de citometria/FACS de fluxo otimizados para camundongos são espécies específicas, notadamente restritas pelas características dos anticorpos disponíveis comercialmente. Eles não foram otimizados para separar FAPs de músculos ratos ou altamente fibrosos. Desenvolveu-se um protocolo de citometria/FACS de fluxo para identificação e isolamento de FAPs e MPs de músculo esquelético de rato saudável e denervado, contando com a expressão diferencial dos marcadores de superfície CD31, CD45, Sca-1 e VCAM-1. Como os anticorpos primários específicos do fluxo, validados pela citometria de fluxo, são severamente limitados, a conjugação interna do anticorpo que tem como alvo o Sca-1 foi realizada. Por meio deste protocolo, foi confirmada a conjugação Sca-1 bem sucedida, e a identificação citométrica de fluxo de FAPs e MPs foi validada pela cultura celular e imunossaturação de FAPs e MPs isolados pelo FACS. Finalmente, relatamos um novo curso de tempo faps em um modelo prolongado (14 semanas) de denervação de ratos. Este método fornece aos pesquisadores a capacidade de estudar FAPs em um novo modelo animal.

Introdução

As células progenitoras fibro-adipogênicas (FAPs) são uma população de células progenitoras multipotentes residentes no músculo esquelético que desempenham um papel crítico na homeostase muscular, reparação e regeneração, e, por outro lado, também mediam respostas patológicas à lesão muscular. Como o nome sugere, as FAPs foram originalmente identificadas como uma população progenitora com potencial para diferenciar-se em fibroblastos e adipócitos1 e foram supostamente os principais mediadores da infiltração fibro-gordurosa do músculo esquelético em lesões crônicas e doenças. Estudo suplementar revelou que as FAPs são adicionalmente capazes de osteogênese e condrogênese2,3,4. Assim, são mais amplamente notados na literatura como progenitores mesenquimais ou estrogonais3,5,6,7,8. Em lesão muscular esquelética aguda, os FAPs ajudam indiretamente na miogênese regenerativa, proliferando transitoriamente para fornecer um ambiente favorável para células de satélite musculares ativadas e seus progenitores miogênicos a jusante (MPs)contrapartes 1,9,10. Paralelamente à regeneração bem sucedida, os FAPs passam por apoptose, devolvendo seus números aos níveis de linha de base1,9,10,11. Em contraste, na lesão muscular crônica, as FAPs substituem sinais pró-apoptóticos, o que resulta em sua persistência9,10,11 e reparação muscular anormal.

Estudos in vivo que avaliam os mecanismos celulares e moleculares pelos quais as FAPs mediam as respostas musculares utilizaram modelos de animais murinos até o momento1,7,9,10,11,12,13,14. Embora camundongos geneticamente modificados sejam ferramentas poderosas para uso nessas análises, o pequeno tamanho do animal limita a disponibilidade de tecidos para estudo em modelos localizados de lesão a longo prazo onde a atrofia muscular pode ser profunda, como a denervação traumática. Além disso, a medição da força muscular e da função física requer medidas ex vivo ou in situ que requerem a terminação do camundongo, ou métodos in vivo que requerem cirurgia e/ou um anestésico geral para permitir a avaliação do desempenho contratil muscular15,16,17,18,19,20 . Em ratos, existem análises funcionais musculares bem validadas e utilizadas globalmente, além de análises para comportamentos motores mais complexos, como análise de marcha (por exemplo, Índice de Função Ciática, Análise de CatWalk) e são realizadas em animais acordados e em movimentos espontaneamente21,22,23,24 . Isso otimiza, ainda, os princípios de morbidade mínima na experimentação animal e o número de animais de pesquisa utilizados. O rato fornece ao pesquisador das FAPs a flexibilidade adicional de maior volume muscular ferido para análises proteicas e celulares e a capacidade de realizar avaliações seriais de atividades e comportamentos funcionais complexos musculares e dinâmicos, no animal de alerta.

As FAPs foram principalmente identificadas e isoladas de amostras musculares inteiras usando citometria de fluxo e triagem celular ativada por Fluorescência (FACS), respectivamente. Estes são ensaios baseados em laser que são capazes de identificar múltiplas populações celulares específicas com base em características características como tamanho, granularidade e uma combinação específica de superfície celular ou marcadores intracelulares25. Isso é altamente vantajoso no estudo de um sistema de órgãos como o músculo esquelético, pois a homeostase e a regeneração são processos complexos e multifatoriais coordenados por uma infinidade de tipos celulares. Estudo seminal identificou FAPs, bem como MPs, utilizando métodos citométricos de fluxo no músculo esquelético do camundongo1. Eles demonstraram que os FAPs são mesenquimais na natureza, por falta de antígenos superficiais específicos para células de origens endoteliais (CD31), hematopoiéticas (CD45), ou miogênicas (Integrin-α7 [ITGA7]), mas expressaram o marcador de células-tronco mesenquimal Sca-1 (antígeno de células-tronco 1)1 e diferenciado em células fibrogênicas e adipogênicas na cultura. Outros estudos demonstraram o isolamento bem-sucedido de progenitores mesenquimais em músculos com base na expressão de um marcador de células-tronco alternativo, o receptor de fator de crescimento alfa derivado de plaquetas (PDGFRα)2,7,8 e análises posteriores revelaram que estes provavelmente são a mesma população celular que as FAPs3. Os FAPs são agora comumente identificados na citometria de fluxo usando sca-1 ou PDGFRα como um marcador de seleção positivo1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . O uso de PDGFRα é preferencial para o tecido humano, no entanto, como um homólogo humano direto do Murine Sca-1 ainda não foi identificado32. Além disso, outras proteínas de superfície celular têm sido relatadas como marcadores de MPs (por exemplo, VCAM-1), fornecendo uma alternativa potencial ao ITGA7 como um indicador de células de linhagem miogênica durante o isolamentofaps 33.

Enquanto a citometria de fluxo/FACS é uma metodologia poderosa para estudar o papel e o potencial patogênico das FAPs no músculo esquelético1,9,10,11,13,29, é limitada tecnicamente pela especificidade e otimização de seus reagentes necessários. Uma vez que a identificação citométrica do fluxo e o isolamento das FAPs tem sido desenvolvido e conduzido nos modelos de animais de camundongos1,9,10,11,29, isso coloca desafios para os pesquisadores que desejam estudar FAPs em outros organismos modelo. Muitos fatores - como o tamanho ideal do tecido a ser processado, bem como a especificidade e disponibilidade de reagentes e/ou anticorpos - diferem dependendo das espécies utilizadas.

Além das barreiras técnicas para estudar FAPs em um novo modelo animal, eles têm sido em grande parte estudados em um ambiente agudo e tóxico - geralmente através de injeção química intramuscular ou cardiotoxina. A avaliação da dinâmica de longo prazo dos FAPs limita-se principalmente à avaliação na distrofia muscular de Duchenne, utilizando o modelo de camundongo mdx9,10,11, e modelos de lesão muscular combinada, como ruptura maciça do manguito rotador, onde a transposição e denervação do tendão simultâneo é realizada na musculatura do ombro26,27,28 . A resposta dos FAPs ao único insulto da denervação traumática crônica, ocorrência comum em acidentes de trabalho na indústria pesada, agricultura e em traumas de nascimento (lesão por plexo braquial)34,35,36,37 com morbidade significativa, não tem sido tão bem caracterizada, muitas vezes limitada a um período de curto prazo11,38.

Descrevemos um método para identificar e isolar FAPs e MPs de músculo esquelético severamente atroférico e fibroso no rato. Primeiro, a identificação de MPs CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs e CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ utilizando um protocolo de coloração de digestão e citometria de fluxo de tecido é demonstrada e a validação subsequente de nossos achados é realizada através da cultura e coloração imunocitológica de células isoladas do FACS. Usando este método, também relatamos um novo curso de tempo faps em um modelo de lesão de denervação isolada de longo prazo no rato.

Protocolo

Os investigadores que conduzem este protocolo devem receber permissão de seu conselho local de ética animal/comitê de cuidados. Todo o trabalho animal foi aprovado pelo St. Michael's Hospital Unity Toronto Animal Care Committee (ACC #918) e foi conduzido de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Conselho Canadense de Cuidados com Animais (CCAC). Um esquema do protocolo de citometria de fluxo é mostrado na Figura 1. Se a aplicação a jusante for FACS e cultura celular subsequente, todas as etapas devem ser completadas com técnica asséptica adequada.

1. Colheita muscular

  1. Anestesize ratos usando um anestésico apropriado e sacrifício de acordo com as diretrizes locais do conselho de ética animal e vivarium. Este protocolo colhe o músculo gastrocnemius de ratos adultos de Lewis (200-250 g), como exemplo. Os ratos foram anestesiados usando isoflurane de 2-3% e foram sacrificados por injeção intracardiac de T61.
  2. Uma vez que o animal tenha sido sacrificado, raspe toda a mepinte para facilitar a localização do músculo e minimizar a contaminação do tecido colhido.
  3. Usando um bisturi estéril, faça duas incisões na pele: a primeira em torno da circunferência da articulação do tornozelo e a segunda até a linha média do aspecto medial da linha traseira do tornozelo ao quadril.
  4. Retire a pele e as camadas musculares superficiais para revelar o gastrocnemius subjacente, que se origina nas condílais medial e lateral do fêmur e insere no Tendão de Aquiles.
  5. Use dissecção contundente para separar o gastrocnemius do tecido circundante, manuseando o músculo apenas pelo tendão para evitar lesões por esmagamento.
  6. Separe o gastrocnemius de sua inserção transcessão do Tendão de Aquiles o mais distally possível com uma tesoura afiada. Uma vez cortado, segure o tendão de Aquiles com fórceps e retire suavemente o gastrocnemius do osso subjacente. Ainda segurando o músculo com fórceps em uma mão, localize as duas origens do gastrocnemius e corte nos condyles femorais medial e lateral.
  7. Borriize o gastrocnemius excisado suavemente contra um pedaço estéril de gaze para remover o máximo de sangue possível. Corte o músculo em uma superfície estéril e remova qualquer excesso de tecido conjuntivo, bem como o Tendão de Aquiles.
  8. Coloque o músculo em um barco de pesagem e pese usando uma balança de precisão. Este protocolo é otimizado para digerir músculo com um peso úmido variando de 200-600 mgs. Os operadores podem subdividir o excesso de tecido colhido para outros ensaios a jusante, se desejar.
  9. Divida suavemente ainda mais o músculo colhido para ser usado para citometria de fluxo em 3-4 pedaços menores (aproximadamente 1-2 cm3) e submerse em 1x PBS gelado. Mantenha frio no gelo até que todas as amostras tenham sido colhidas.

2. Digestão muscular

  1. Remova o músculo da PBS e coloque em um prato de cultura celular estéril de 10 cm. Tecido suavemente rasgado e picado com fórces até que os pedaços sejam aproximadamente 3-4 mm3, removendo o máximo de tecido conjuntivo possível. Uma vez completamente picado, transfira para um tubo cônico estéril de 50 mL contendo 6 mL DMEM + 1% penicilina/estreptomicina (P/S).
  2. Adicione 10 μL de solução cacl2 de 300 mM a 365 μL de solução Collagenase II (concentração de estoque 4800 U/mL) para ativar a enzima colagenase. Adicione a solução de colagemnase II ativada ao tubo cônico de 50 mL contendo o chorume tecidual. A concentração final de Colagenase II é de 250 U/mL.
  3. Incubar tubos em um agitador por 1 h a 37 °C, 240 x g,certificando-se de girar manualmente a cada 15 minutos para desalojar qualquer tecido que tenha aderido ao lado do tubo.
  4. Após 1h, remova os tubos do agitador e adicione o seguinte por amostra: 100 μL de Colagenase II (4.800 U/mL) e 50 μL de Dispase (4,8 U/mL).
  5. Amostras de pipeta utilizando uma pipeta sorológica 15-20 vezes até que a solução seja homogênea. Se processar várias amostras, use uma pipeta estéril separada para cada amostra para evitar a contaminação cruzada da amostra.
  6. Incubar novamente em um shaker por 30 min a 37 °C e 240 x g. Após 15 minutos, agite amostras à mão para desalojar tecido aderente do lado do tubo.

3. Geração de suspensão de célula única

  1. Lentamente, as amostras de cisalhamento através de uma seringa de 10 mL com uma agulha de 20 G para 10 ciclos.
    NOTA: Um ciclo envolve a entrada de solução muscular na seringa e a injeção de volta no tubo. Certifique-se de minimizar quaisquer bolhas completando o esarquihamento lentamente, pois espuma excessiva pode causar morte celular adicional39.
  2. Coloque um coador de células de 40 μm em um tubo cônico estéril de 50 mL e molhe-o por tubos de 5 mL DMEM + 10% FBS & 1% P/S.
  3. Pipeta 1 mL da amostra de cada vez através do coador celular.
  4. Lave o coador de células por pipetação de DMEM com 10% de FBS e 1% P/S através do coador para levar o volume total do tubo para 25 mL.
  5. Divida 25 mL da amostra igualmente em dois tubos cônicos de 15 mL e centrífuga a 15 °C, 400 x g por 15 min.
    NOTA: Dividir a solução muscular em dois tubos cônicos de 15 mL garante uma melhor recuperação celular após a centrifugação em comparação com um único tubo.
  6. Aspire o supernatante e suspenda a pelota em 1 mL 1x RBC Lysis buffer (ver Arquivo Suplementar) em temperatura ambiente por 7 minutos para eliminar eritrócitos.
  7. Leve o volume para 10 mL com 9 mL de tampão de lavagem (ver Arquivo Suplementar) e tubos de spin a 400 x g, 15 °C por 15 min.
  8. Aspire as pelotas supernascidas e recombinas, re suspendindo em tampão de lavagem de 1 mL.
  9. Transfira um volume apropriado de células para um tubo de microcentrifutura separado de 1,5 mL e misture com corante azul trypan. Conte células vivas em um microscópio leve usando um hemótmetro.

4. Coloração de anticorpos para citometria de fluxo

NOTA: O anticorpo Sca-1 deve ser conjugado à APC antes de experimentos de citometria/FACS de fluxo, de acordo com as instruções do fabricante. O desempenho deve ser validado para cada lote de conjugados(Figura 2). As conjugações finais podem ser armazenadas em 20 μL a -20 °C e estão estáveis por três semanas. Consulte o Arquivo Suplementar para o protocolo de conjugação completo.

  1. Para citometria de fluxo, transfira 1-2 x 106 células por amostra experimental para um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL estéril. Leve o volume até 1 mL com tampão de lavagem e coloque no gelo.
  2. Para cada experimento, configure os seguintes controles necessários: i) controles de viabilidade não manchados e ii) para selecionar com precisão para a população de células vivas; iii) controles de fluorescência menos um (FMO) em suspensões de célula única para definir portões precisos para frações CD31-/CD45, FAPs e MPs; e iv) contas de compensação de uma única mancha para corrigir a fluorescência entre os canais.
    1. Para todos os controles celulares, alíquota 5 x 105 - 1 x 106 células em 1 mL de tampão de lavagem em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e coloque no gelo.
    2. Para controles de contas, adicione 1 gota de contas de compensação positivas (~1,5 x 105 contas por gota) a cada tubo de microcentrifuuge rotulado de 1,5 mL. O complemento completo dos controles está listado na Tabela 1.
      NOTA: Se o experimento estiver sendo realizado pela primeira vez, execute controles de uma única mancha para cada anticorpo conjugado em suspensões de células únicas (além de contas de compensação não manchadas, viabilidade, compensação de uma única mancha e controles de FMO) para avaliar a população manchada positiva em células e validar a coloração observada em contas de compensação. Validar cada preparação recém-conjugada de Sca-1::APC realizando coloração única em contas de compensação e suspensões de células únicas. Consulte a Tabela 1 para obter uma lista completa de controles de coloração.
  3. Para preparar o controle de viabilidade, transfira metade do volume de células do tubo de "viabilidade" para um novo tubo de microcentrifuge de 1,5 mL. Rotule este tubo de "Morto".
  4. Incubar tubo "morto" a 65 °C por 2-3 minutos para matar as células, em seguida, coloque no gelo. Após 2-3 min, ree combinar células mortas com células vivas permanecendo no tubo de controle de viabilidade. Essa população de células será usada para definir valores de compensação (se necessário) e definir adequadamente os portões para o corante de viabilidade.
  5. Centrifugar as suspensões de células únicas (amostras e controles experimentais) a 500 x g, 4 °C por 5 min.
  6. Aspire as cápsulas de células supernascidas e re-suspender em 100 μL tampão de lavagem.
  7. Adicione anticorpos, dependendo da amostra experimental ou controle. Consulte a matriz de coloração(Tabela 2)para obter informações sobre combinações e quantidades de anticorpos.
  8. Mova suavemente cada amostra para garantir a mistura completa e incubar no gelo no escuro por 15 minutos. Para contas de compensação, incubar à temperatura ambiente no escuro por 15 minutos.
  9. Para amostras experimentais e de controle de suspensão celular única, eleve o volume para 1 mL adicionando 900 μL de tampão de lavagem. Para controles de contas de compensação, eleça o volume para 1 mL com 900 μL de 1x PBS.
  10. Centrifugar amostras de suspensão de célula única a 500 x g,4 °C por 5 min. Cento de compensação controles de contas a 300 x g, 4 °C por 5 min.
  11. Para todas as amostras de suspensão de células únicas, aspirar e descartar supernasce e suspender de re-suspensão a pelota celular em 300 μL tampão de lavagem. Para controles de contas de compensação, aspire e descarte o supernasce, suspenda novamente a pelota em 300 μL de 1x PBS e adicione 1 gota (~1,5 x 105) de contas de compensação negativa.
  12. Mantenha todas as amostras de suspensão de células únicas no gelo sob papel alumínio e prossiga para a aquisição citométrica de fluxo. Os controles de contas de compensação também devem ser protegidos contra a luz, mas podem ser mantidos à temperatura ambiente.
    NOTA: Se o ponto final experimental for a identificação de FAPs por citometria de fluxo, siga as etapas 5.1.1-5.1.11. Se o ponto final for o isolamento celular via FACS para cultura e coloração, siga as etapas 5.2.1-5.2.9 e as seções 6-7.

5. Citometria de fluxo e classificação celular ativada por fluorescência (FACS)

  1. Citometria de fluxo
    NOTA: Este protocolo emprega um citômetro de fluxo de bancada equipado com lasers de 405 nm, 488 nm e 640 nm capazes de distinguir simultaneamente 10 cores diferentes. Os filtros bandpass e seus fluorochromes associados utilizados neste protocolo são os seguintes: 450/50 (SYTOX Blue), 530/30 (FITC), 575/25 (PE) e 670/30 (APC). As tensões para cada detector são as seguintes: FSC 700; SSC 475; FITC 360; PE 460; PE-Cy7 600; SYTOX Azul 360; APC 570. Certifique-se de que você é treinado sobre o funcionamento adequado do citômetro de fluxo ou classificador celular antes de usar.
    1. Certifique-se de que o cítmetro foi ligado por 10-20 minutos antes do uso e foi preparado pela limpeza sequencial com soluções limpas, enxaguadas e fluidos de baia para 30-45 s cada. Finalize com uma lavagem com dH2O. Certifique-se de que um volume adequado de fluido de baia foi adicionado ao recipiente de armazenamento para manter o fluxo adequado da amostra durante toda a aquisição.
    2. Configure a estratégia de gating para identificar FAPs e MPs conforme delineado na Figura 3.
      NOTA: Os FAPs e os MPs são identificados pela seguinte estratégia hierárquica: i) SSC-A vs FSC-A (área de dispersão de células laterais versus área de dispersão de células dianteiras para células separadas vs detritos), ii) FSC-W vs FSC-H (largura de dispersão de células dianteiras versus altura de dispersão da célula dianteira para discriminar singlets de doublets no parâmetro FSC), iii) SSC-W vs SSC-H (largura de dispersão de células laterais versus altura de dispersão de células laterais para discriminar singlets de doublets no parâmetro SSC), iv) SSC-A vs SYTOX Blue (para distinguir singlets vivos versus mortos), v) SSC-A vs CD31/45::FITC (para excluir células CD31+ e CD45+ de análises posteriores) e vi) Sca-1::APC vs VCAM-1::P E do CD31-/CD45- (Linhagem; Lin-) população (identificação de FAPs e PMs). Os FAPs são identificados como eventos CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- e os MPs são identificados como eventos CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+.
    3. Primeiro execute cada controle de contas de compensação de uma única mancha através do citômetro em baixa velocidade para gerar valores de compensação usados para corrigir qualquer derramamento de fluorescência entre os canais. Avalie a compensação comparando o sinal fluorescente de cada controle em seu próprio detector (por exemplo, SSC-A vs APC para Sca-1::APC contas de uma única mancha) bem como todos os outros detectores. Deve haver duas populações distintas (uma com negativo e outra com sinal positivo) no detector apropriado e apenas uma população negativa em todos os outros detectores. Estabeleça o portão de parada para 10.000 eventos de contas de compensação e regise os dados.
      NOTA: Entre a aquisição de cada amostra, certifique-se de executar dH2O através do cítômetro por 10-20 seg para evitar a contaminação amostral..
    4. Em seguida, processe as amostras de controle de viabilidade não manchadas para portar adequadamente em células individuais vivas. Defina o portão de parada para 10.000 eventos de singlet e grave dados.
      NOTA: Aproximadamente 5 minutos antes da aquisição de cada amostra de suspensão celular única, com exceção da amostra não manchada, adicione 1 μL de corante de viabilidade azul SYTOX (concentração de trabalho de 300 μM diluída a partir de 1 mM solução de estoque) a cada amostra e gire suavemente para misturar (concentração final 1 μM).
    5. Em seguida, adquira as amostras restantes de controle de suspensão de célula única. Avalie cada controle de FMO com seu enredo apropriado na estratégia de gating(Figura 3). Por exemplo, avalie o sinal FITC do FMO CD31+CD45 para garantir um portão CD31-/CD45 preciso. Um exemplo ideal é mostrado na Figura 3G. Se o protocolo estiver sendo executado pela primeira vez, os controles de uma única mancha nas células devem ser executados antes da aquisição dos controles FMO.
    6. Avalie o sinal fluorescente de cada amostra celular manchada em seu detector apropriado, bem como em todos os outros detectores para validar a compensação adequada. Defina o portão de parada para 10.000 eventos singlet ao vivo e grave no software.
    7. Uma vez processados todos os controles (suspensões e contas de células únicas), prepare todas as amostras experimentais medindo e registrando primeiro o volume de cada amostra. Essas medidas serão utilizadas para quantificar com precisão os FAPs e os PMs, conforme descrito na etapa 5.1.11. Em seguida, adicione 50 μL de contas de contagem de precisão e misture suavemente por pipetar para cima e para baixo 2-3 vezes.
    8. Execute brevemente a primeira amostra experimental para validar a identificação da população de contas de contagem. Esta população aparece como um pequeno aglomerado distinto separado da população geral de células na trama FSC-A vs SSC-A(Figura 3A, caixa vermelha). Crie um portão em torno da população de contas de contagem. Em seguida, adquira dados para cada amostra experimental processando através do citômetro em baixa velocidade. Defina o portão de parada para 10.000 eventos de contas e recorde.
      NOTA: Os investigadores podem identificar alternativamente a contagem de contas, configurando um gráfico adicional avaliando o SSC-A versus qualquer um dos detectores, já que as contas de contagem são fluorescentes em todos os detectores.
    9. Depois de todas as amostras terem sido processadas, limpe o citómetro usando os protocolos apropriados. Exportar todos os dados para análise.
    10. Abra todos os arquivos de dados em um software apropriado de análise de citometria de fluxo. Defina a estratégia de gating como usada para aquisição de dados conforme descrito na etapa 5.1.2. Examine os controles na mesma ordem da aquisição de dados (por exemplo, não manchados, viabilidade, única mancha, depois controles FMO) para validar novamente a estratégia de gating. Uma vez que portões precisos tenham sido definidos usando controles FMO, aplique os portões em todas as amostras experimentais. Exportar dados brutos como uma planilha para quantificação.
    11. Calcule o número de FAPs e MPs em cada amostra experimental usando as contas de contagem:
      figure-protocol-17412
      onde, Contagem de Células Adquiridas é o número de eventos registrados de população celular pertinente (por exemplo, FAPs ou MPs) no software de aquisição; O Bead Count adquirido é o número de eventos registrados de contas de contagem no software de aquisição; Contando o Volume de Contas é o volume de solução de contas de contagem adicionada na etapa 5.1.7; Volume amostral é o volume de cada amostra experimental manchada antes da adição de contas de contagem.; Concentração de contas é o número de contas por solução μL; este valor é encontrado na folha de dados do produto.
  2. FACS - classificação para cultura celular
    NOTA: Este protocolo executa FACS em um classificador de células equipado com 4 lasers (UV, Violet, Azul, Vermelho) que é capaz de distinguir simultaneamente cores de 11-14. Siga a coloração experimental da amostra (seção 4) e o protocolo de citometria de fluxo, com exceções das etapas 1 a 3 delineadas abaixo, para otimizar o fluxo de trabalho FACS:
    1. Aumente a concentração de células nas amostras experimentais a serem classificadas para 7 x 106 células/mL para gerar rendimentos robustos de FAPs e MPs.
    2. Para explicar esse aumento significativo na concentração celular, dobre todas as concentrações de anticorpos nas amostras experimentais a serem classificadas.
    3. Processe as amostras de células manchadas finais através de uma tampa de coador de células de 40 μM afixada em um tubo de poliestireno de 5 mL imediatamente antes da triagem para reduzir a aglomeração celular e aumentar os rendimentos de classificação.
    4. Recolher FAPs e MPs de ratos únicos e vivos diretamente do classificador celular em um tubo de coleta de polipropileno de 5 mL contendo 1 mL de estéril, 100% de bovino fetal (FBS). Mantenha as células no gelo até que a classificação esteja completa.
      NOTA: Se estiver conduzindo o FACS em um local fora do local, transfira todas as células classificadas no gelo e em um recipiente protegido e coberto.
    5. Trabalhando em um gabinete de biossegurança estéril (BSC), traga volume de células classificadas até 7 mL com mídia de crescimento apropriada (por exemplo, mídia de crescimento FAP (FAP GM) para FAPs classificados e mídia de crescimento mp (MP GM) para MPs classificados; ver Arquivo Suplementar para receitas) e centrífuga a 500 x g, 4 °C por 7 min para remover o máximo de tampão de lavagem residual possível.
    6. Resuspend pelotas em 1 mL de mídia de crescimento apropriada e placa em uma placa de 12 poços contendo uma tampa de vidro estéril, revestida de colágeno 12 mm/poço para imunostaining subsequente (ver seção 6).
      NOTA: Se a imunocitoquímica colorir para colágeno, as células classificadas em uma placa de 12 poços contendo uma tampa de vidro estéril, revestida de laminina de 12 mm/bem, em vez de revestida de colágeno. Se forem necessários experimentos imunocittoquímicos de progenitores imediatamente isolados, sejam necessários FAPs e MPs de sementes a uma densidade de 15.000 células por cm2 e procedem diretamente à etapa 6.1. Para culturas de longo prazo induzirem a diferenciação progenitora, as FAPs de sementes a uma densidade de 5.000 células por cm2, e MPs a uma densidade de 7.500 células por cm2.
    7. Incubar células a 37 °C e 5% de CO2 em uma incubadora de cultura celular. Depois de 72 h na cultura, mude metade da mídia. Mude a mídia totalmente a cada 2-4 d depois.
    8. Para induzir o desenvolvimento do miócito, mude as culturas dos MPs para o meio de diferenciação de MP (MD) no dia 9 da cultura. Para induzir adipócitos, mude as culturas faps para o meio de diferenciação adipogênica (AD) fap no dia 10 da cultura.
    9. Para induzir a fibrogênese, os FAPs podem ser trocados para a mídia de diferenciação fibrogênica (FD) em momentos variáveis durante a cultura, ou, alternativamente, podem ser semeados diretamente na mídia FD após o isolamento (etapa 5.2.6) (Ver Arquivo Suplementar para todas as receitas de mídia).

6. Imunocytoquímica de FAPs e PMs cultos

  1. Para validar a classificação celular e demonstrar pureza das culturas faps e MPs, imunostain com marcadores específicos do tipo celular, incluindo PDGFRα (marcador FAPs), Pax-7 (marcador de células de tronco muscular [satélite]), proteína específica do fibroblasto (FSP-1, marcador fibroblasto), Perilipin-1 (Plin-1, marcador de adipocito), colágeno tipo 1 (Col1a1, indicador de fibrose), Myosin Heavy Chain (MHC, marcador de miec.
    1. Para a imunossuagem de células recém-classificadas, centrifugar a placa de 12 poços a 200 x g por 3 min à temperatura ambiente para facilitar a adesão das células ao deslizamento/poço. Este passo não é necessário para culturas de longo prazo. Remova a mídia cultural.
    2. Para imunostaining com FSP-1, fixar células com 1 mL 100% metanol (MeOH) por 2 min a 4 °C. Se imunostaining para PDGFRα, Plin-1, Pax7 ou Col1a1, fixar culturas celulares com 1 mL 4% PFA em 1x PBS por 15 minutos à temperatura ambiente. A imunossuagem do MHC tolera qualquer fixação.
      NOTA: Para células fixas de metanol, pule a etapa 6.2 e prossiga para a etapa 6.3.
  2. Aspirar 4% PFA e lavar rapidamente as culturas celulares 3-4 vezes com 1x PBS. Adicione 1 mL de 100 mM Glycine em 1x PBS e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente para inativar PFA residual. Aspire e lave 1-2 vezes com 1x PBS.
    NOTA: As células podem ser deixadas nesta fase em 2 mL de 1x PBS, enroladas em filme agarrado e armazenadas a 4 °C por 7-10 dias no máximo.
  3. Após a lavagem, adicione 1 mL de 0,1% Triton-X em 1x PBS e incuba por 20 minutos para permeabilize membranas celulares.
  4. Lave os poços 2-3 vezes com 1-2 mL de 1x PBS e bloqueie as células com 1 mL de 1x PBS + 3% BSA por poço por 1h à temperatura ambiente.
  5. Pipeta 80 μL de anticorpo primário diluído em 1x PBS + 3% BSA (PDGFRα 1:100, Pax7 puro, FSP-1 1:50, Plin-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 μg/mL) em um pedaço de parafilme colado em um recipiente móvel. Usando fórceps finos estéreis, levante cuidadosamente o deslizamento de tampas para fora do poço e inverta na gota da solução de anticorpos. Incubar tampas com dois pedaços molhados de papel toalha e recipiente de cobertura em filme plástico para evitar a evaporação da solução de anticorpos. Incubar durante a noite a 4 °C.
    NOTA: As manchas saem do poço utiliza menos anticorpos (~80 μL) do que a coloração dentro do poço (mínimo de 500 μL).
  6. No dia 2, deixe as coberturas em temperatura ambiente por 30 minutos para aquecer. Usando fórceps cuidadosamente corretamente e transferir tampas de volta para seus respectivos poços (células voltadas para cima) e lavar 2-3 vezes com 1-2 mL de 1x PBS por 2 min cada para remover o máximo de anticorpos primários possível.
  7. Usando a mesma técnica de coloração como com a coloração primária de anticorpos, colorições com anticorpos secundários Alexa Fluor 488 (1:400) para detectar FSP-1, Plin-1, Col1a1 ou PDGFRα e anti-rato de cabra Alexa Fluor 555 anticorpo secundário (1:300) para detectar MHC ou Pax-7. Incubar células por 1h à temperatura ambiente e manter as células protegidas da luz.
  8. Retornar células ao poço e incubar células com Hoechst (1:10.000) por 2-4 min em temperatura ambiente. Lave as células mais 2-3 vezes com 1x PBS por 2 min cada para remover o excesso de Hoechst.
  9. Montagem desliza em lâminas de vidro usando um meio de montagem fluorescente anti-fade e deixa slides para secar durante a noite no escuro à temperatura ambiente. Armazene as tampas montadas a 4 °C no escuro.

7. Mancha de O Vermelho-Óleo (ORO) de FAPs e MPs cultos

  1. Realizar a coloração de ORO em células não permeabilizadas, pois a permeabilização da membrana celular pode resultar em coloração não específica/indesejada de tipos de células não adipogênicas. Antes de iniciar a coloração, prepare um estoque de trabalho oro (Ver Arquivo Suplementar para a receita) e incubar à temperatura ambiente por 20 minutos.
  2. Após 20 min, filtre a solução usando um filtro de 0,2 μm para remover quaisquer agregados não resolvidos.
  3. Aspirar mídia de bem e adicionar 1 mL de Formalina Tamponada Neutra de 10% (10% NBF). Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
    NOTA: A confluência celular pode resultar na elevação do poço/deslizamento de tampas. Tome cuidado ao aspirar/adicionar soluções.
  4. Aspire e adicione 1 mL de 10% de NBF fresco e incubar por pelo menos 1h em temperatura ambiente.
    NOTA: O protocolo pode ser interrompido neste momento, pois as células podem ser deixadas em 10% NBF durante a noite.
  5. Lave rapidamente os poços uma vez com 1 mL de isopropanol de 60%, depois aspire e deixe os poços secarem completamente (aproximadamente 2 min).
  6. Adicione 400 μL Óleo Vermelho O de trabalho por poço e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente, certificando-se de evitar a tubulação de qualquer ORO nas paredes da placa.
  7. Remova todo o Óleo Vermelho O e lave rapidamente o poço 4 vezes com dH2O.
    NOTA: Se os poços manchados conterem tampas, monte usando a mesma técnica descrita na etapa 6.9.
  8. A imagem ou tampas montadas ou o poço manchado usando um microscópio brightfield.

8. Coloração tecidual de seções gastrocnemius de ratos contralaterais e denervadas

  1. Vermelho Picrosirius (PSR)
    1. Realize a coloração de PSR em seções histológicas de rato de 5 μm de espessura e fixas (FFPE), como descrito anteriormente40.
  2. Óleo vermelho o (ORO)
    1. Fixar 5 μm de espessura isopentane-congelado de rato gastrocnemius seções histológicas em 4% PFA por 10 min, incubar em 60% álcool isopropílico por 1 min.
    2. Mancha com estoque de trabalho ORO por 12 min. Incubar em 60% de álcool isopropílico por 1 min, lave por 10 min em dH2O. Monte em tampas usando uma mídia de montagem solúvel em água.
  3. Imunohistoquímica fluorescente de tecido sca-1 e laminina (IHC)
    1. Realize o IHC fluorescente em seções histológicas de ratos congelados de isopentane de 5 μm de espessura.
    2. Hidrate amostras em 1x PBS por 5 min, fixe em 4% PFA por 10 minutos e incuba amostras na solução de bloqueio if de tecido (ver Arquivo Suplementar) por 90 minutos.
    3. Incubar com anticorpo primário anti-Sca-1 (1:500) diluído em 1x PBS + 0,05% Tween a 4 °C durante a noite.
    4. No dia 2, lave três vezes em 1x PBS + 0,05% Tween por 5 min cada, depois incubar em anti-coelho de cabra Alexa Fluor 555 (1:500) por 1 h.
    5. Lave novamente (como antes), incubar com solução de bloqueio por 1h e, em seguida, adicione anticorpo primário anti-laminina (1:500) diluído em 1x PBS + 0,05% Tween por 1 h.
    6. Lave novamente (como antes), depois incubar em anti-coelho de cabra Alexa Fluor 488 (1:500) por 1 h (para laminina).
    7. Lave novamente (como antes) e incuba em DAPI (1:10.000) por 4 min. Lave e monte em tampas usando meio de montagem anti-fade.

Resultados

Identificação de FAPs e MPs via citometria de fluxo usando um novo painel de anticorpos, incluindo Sca-1 e VCAM-1
A estratégia de gating para identificar FAPs no músculo de rato baseia-se nos protocolos de citometria de fluxo no mouse29, que portão em células positivas CD31 (endotelial) e CD45 (hematopoiética) (denominada linhagem [Lin]) e examina o perfil fluorescente do marcador FAPs Sca-1 e MPs marcador ITGA7 da popu...

Discussão

Um protocolo de isolamento otimizado e validado de FAPs para músculos de ratos é essencial para pesquisadores que desejam estudar modelos de lesões que não são viáveis no camundongo por razões biológicas ou técnicas. Por exemplo, os camundongos não são um modelo animal ideal para estudar lesões crônicas locais ou neurodegenerativas, como a denervação a longo prazo. Biologicamente, a vida útil curta e o envelhecimento rápido dos camundongos dificultam o delineamento preciso do músculo sequalae devido à ...

Divulgações

Os autores não têm conflitos para revelar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer às Instalações do Núcleo de Citometria de Fluxo da Universidade de Ottawa e do Keenan Research Centre for Biomedical Sciences (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto por sua expertise e orientação na otimização do protocolo de citometria de fluxo/FACS apresentado neste manuscrito. Este trabalho foi financiado pela Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) para jb.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL Polypropylene Round-Bottom TubeFalcon352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer CapFalcon352235
10 cm cell culture dishesSarstedt83.3902
12-well cell culture plateThermoFisher130185
12 mm glass coverslips, No.2VWR89015-724
10 mL SyringeBeckton Dickenson302995
15 mL centrifuge tubesFroggaBio91014
20 gauge needleBeckton Dickenson305176
25mL Serological pipetteSarstedt86.1685.001
40µm cell strainerFisher Scientific22363547
50mL centrifuge tubesFroggaBioTB50
AbC Total Antibody Compensation Beads ThermoFisherA10497
Ammonium Chloride, Reagent GradeBioshopAMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µgBiotium92307
Aquatex Aqueous Mounting MediumMerck108562
Biolaminin 411 LNBiolaminaLN411
Bovine Serum Albumin (BSA)BioshopALB001
Calcium ChlorideBioshopCCL444.500
Collagenase Type IIGibco17101015
CountBright Plus Absolute Counting BeadsThermoFisherC36995
DexamethasoneMillipore SigmaD4902
DispaseGibco17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Gibco11995-065(+)4.5 g/L D-Glucose
(+)L-Glutamine
(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTAFisherScientificS311
FACSClean SolutionBeckton Dickenson340345
FACSDiva SoftwareBeckton Dickenson--
FACSRinse SolutionBeckton Dickenson340346
Fetal Bovine SerumSigmaF1051
Flow Cytometry Sheath FluidBeckton Dickenson342003
FlowJo SoftwareBeckton Dickenson--
Fluorescent Mounting MediumDakoS302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibodyInvitrogenA21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibodyInvitrogenA11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibodyInvitrogenA21429
Goat SerumGibco16210-064
Ham's F10 MediaThermoFisher 11550043(+) Phenol Red
(+) L-Glutamine
(-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)Multicell311-513-CL
Heat Inactivated Horse SerumGibco26050-088
HemocytometerReichertN/A
HEPES, minimum 99.5% titrationSigmaH3375
Horse SerumThermoFisher16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1)Cell Signaling8915LF
Humulin RLillyHI0210
IBMXMillipore SigmaI5879Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
IsopropanolSigmaI9516Also known as 2-propanol
Lewis Rat, FemaleCharles River Kingston004 (Strain Code)200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop CytometerBeckton Dickenson--
MicrocentrifugeEppendorfEP-5417R
MoFlo XDP Cell SorterBeckman Coulter--
Mouse Anti-CD31::FITC AntibodyAbcamab33858Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC AntibodyBiolegend202205Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE AntibodyBiolegend200403Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/AAlso known as MF20
Mouse Anti-Pax7 AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 %SigmaHT501128
Oil Red OMillipore SigmaO0625
PE-Cy7 Conjugation KitAbcamab102903
Penicillin-StreptomycinSigma P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)Gibco10010-023(-)Calcium Chloride
(-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent GradeBioshopPBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) AntibodyInvitrogenMA5-32347FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 AntibodyAbcamab203254
Rabbit Anti-Laminin AntibodySigmaL9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 AntibodyAbcamab3526
Rabbit Anti-Sca-1 AntibodyMillipore SigmaAB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I AntibodyAbcamab260043Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha AntibodyAbcamab203491
Recombinant Human FGF-basicGibcoPHG0266
Sodium AzideSigmaS2002
Triton-X-100Fisher ScientificBP151
TroglitazoneMillipore SigmaT2573
Tween-20BioshopTWN510

Referências

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