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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo delinea un metodo per isolare i progenitori fibro-adipogeni (FAP) e i progenitori miogeni (MP) dal muscolo scheletrico del ratto. L'utilizzo del ratto nei modelli di lesione muscolare fornisce una maggiore disponibilità di tessuto dal muscolo atrofico per l'analisi e un repertorio più ampio di metodi convalidati per valutare la forza muscolare e l'andatura negli animali in movimento libero.

Abstract

I progenitori fibro-adipogeni (FAPs) sono cellule interstiziali residenti nel muscolo scheletrico che, insieme ai progenitori miogeni (MP), svolgono un ruolo chiave nell'omeostasi muscolare, nelle lesioni e nella riparazione. Gli attuali protocolli per l'identificazione e l'isolamento dei FAP utilizzano la citometria a flusso/ lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) e gli studi che valutano la loro funzione in vivo fino ad oggi sono stati intrapresi esclusivamente nei topi. La maggiore dimensione intrinseca del ratto consente un'analisi più completa dei FAP nei modelli di lesione del muscolo scheletrico, specialmente nel muscolo gravemente atrofico o quando gli investigatori richiedono una massa tissutale sostanziale per condurre più saggi a valle. Il ratto fornisce inoltre una selezione più ampia di saggi funzionali muscolari che non richiedono sedazione o sacrificio animale, riducendo così al minimo la morbilità e l'uso di animali consentendo valutazioni seriali. I protocolli di citometria a flusso/FACS ottimizzati per i topi sono specifici per specie, in particolare limitati dalle caratteristiche degli anticorpi disponibili in commercio. Non sono stati ottimizzati per separare i FAP dal ratto o dal muscolo altamente fibrotico. È stato sviluppato un protocollo di citometria a flusso/FACS per l'identificazione e l'isolamento di FAP e MP dal muscolo scheletrico di ratto sano e denervato, basandosi sull'espressione differenziale dei marcatori di superficie CD31, CD45, Sca-1 e VCAM-1. Poiché gli anticorpi primari specifici per il ratto, convalidati con citometria a flusso, sono gravemente limitati, è stata eseguita la coniugazione interna dell'anticorpo che prende di mira Sca-1. Utilizzando questo protocollo, è stata confermata la coniugazione Sca-1 di successo e l'identificazione citometrica a flusso di FAP e MP è stata convalidata mediante coltura cellulare e immunocolorazione di FAPs e MP isolati da FACS. Infine, riportiamo un nuovo decorso temporale dei FAP in un modello di denervazione prolungata (14 settimane). Questo metodo fornisce ai ricercatori la possibilità di studiare i FAP in un nuovo modello animale.

Introduzione

Le cellule progenitrici fibro-adipogene (FAP) sono una popolazione di cellule progenitrici multipotenti residenti nel muscolo scheletrico che svolgono un ruolo critico nell'omeostasi muscolare, nella riparazione e nella rigenerazione e, al contrario, mediano anche le risposte patologiche alle lesioni muscolari. Come suggerisce il nome, i FAP sono stati originariamente identificati come una popolazione progenitrice con il potenziale di differenziarsi in fibroblasti e adipociti1 e sono stati pretesi per essere i principali mediatori dell'infiltrazione fibro-grassa del muscolo scheletrico in lesioni croniche e malattie. Ulteriori studi hanno rivelato che i FAP sono inoltre in grado di osteogenesi e condrogenesi2,3,4. Pertanto, sono più ampiamente notati in letteratura come progenitori mesenchimali ostromali 3,5,6,7,8. Nel danno acuto del muscolo scheletrico, i FAP aiutano indirettamente nella miogenesi rigenerativa proliferando transitoriamente per fornire un ambiente favorevole per le cellule satelliti muscolari attivate e le loro controparti progenitrici miogeniche (MP) a valle1,9,10. Parallelamente alla rigenerazione di successo, i FAP subiscono l'apoptosi, riportando il loro numero ai livellibasali1,9,10,11. Al contrario, nelle lesioni muscolari croniche, i FAP sovrascrivono i segnali pro-apoptotici, il che si traduce nella loro persistenza9,10,11 e nella riparazione muscolare anormale.

Studi in vivo che valutano i meccanismi cellulari e molecolari con cui i FAP mediano le risposte muscolari hanno utilizzato modelli animali murini fino ad oggi1,7,9,10,11,12,13,14. Mentre i topi geneticamente modificati sono potenti strumenti da utilizzare in queste analisi, le piccole dimensioni dell'animale limitano la disponibilità di tessuti per lo studio in modelli di lesioni localizzate a lungo termine in cui l'atrofia muscolare può essere profonda, come la denervazione traumatica. Inoltre, la misurazione della forza muscolare e della funzione fisica richiede misurazioni ex vivo o in situ che richiedono la cessazione del topo, o metodi in vivo che richiedono un intervento chirurgico e/o un anestetico generale per consentire la valutazione delle prestazioni contrattili muscolari15,16,17,18,19,20 . Nei ratti, esistono analisi funzionali muscolari ben convalidate e utilizzate a livello globale, oltre alle analisi per comportamenti motori più complessi come l'analisi dell'andatura (ad esempio, indice di funzione sciatica, analisi CatWalk) e vengono eseguite in animali svegli e in movimento spontaneo21,22,23,24 . Ciò ottimizza ulteriormente i principi di morbilità minima nella sperimentazione animale e il numero di animali da ricerca utilizzati. Il ratto fornisce quindi al ricercatore FAPs la flessibilità aggiuntiva di un maggiore volume muscolare ferito per analisi proteiche e cellulari e la capacità di intraprendere valutazioni seriali dell'attività e dei comportamenti funzionali statici e dinamici del complesso muscolare, nell'animale di allerta.

I FAP sono stati identificati e isolati principalmente da campioni di muscoli interi utilizzando rispettivamente la citometria a flusso e lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS). Si tratta di saggi basati su laser che sono in grado di identificare più popolazioni cellulari specifiche in base a caratteristiche caratteristiche come dimensioni, granularità e una combinazione specifica di superficie cellulare o marcatori intracellulari25. Questo è molto vantaggioso nello studio di un sistema di organi come il muscolo scheletrico, poiché l'omeostasi e la rigenerazione sono processi complessi e multifattoriali coordinati da una pletora di tipi di cellule. Uno studio seminale ha identificato i FAP, così come i MP, utilizzando metodi citometrici a flusso nel muscolo scheletrico del topo1. Hanno dimostrato che i FAP sono di natura mesenchimale, in quanto mancavano di antigeni di superficie specifici per le cellule di origine endoteliale (CD31), ematopoietica (CD45) o miogenica (Integrina-α7 [ITGA7]), ma esprimevano il marcatore delle cellule staminali mesenchimali Sca-1 (antigene delle cellule staminali 1)1 e differenziato in cellule fibrogene e adipogeniche in coltura. Altri studi hanno dimostrato il successo dell'isolamento dei progenitori mesenchimali nel muscolo in base all'espressione di un marcatore alternativo di cellule staminali, il recettore alfa del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRα)2,7,8 e ulteriori analisi hanno rivelato che questi probabilmente sono la stessa popolazione cellulare dei FAPs3. I FAP sono ora comunemente identificati nella citometria a flusso utilizzando Sca-1 o PDGFRα come marcatore di selezionepositiva 1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . L'uso di PDGFRα è preferenziale per il tessuto umano tuttavia, in quanto un omologo umano diretto di Sca-1 murino deve ancora essere identificato32. Inoltre, altre proteine di superficie cellulare sono state segnalate come marcatori di MP (ad esempio, VCAM-1), fornendo una potenziale alternativa a ITGA7 come indicatore di cellule di lignaggio miogenico durante l'isolamento dei FAPs33.

Mentre la citometria a flusso / FACS è una potente metodologia per studiare il ruolo e il potenziale patogenetico dei FAP nel muscolo scheletrico1,9,10,11,13,29, è limitato tecnicamente dalla specificità e dall'ottimizzazione dei suoi reagenti richiesti. Poiché l'identificazione citometrica a flusso e l'isolamento dei FAP sono stati sviluppati e condotti in modelli animalimurini1,9,10, 11,29, ciòpone sfide per i ricercatori che desiderano studiare i FAP in altri organismi modello. Molti fattori - come la dimensione ottimale del tessuto da elaborare, nonché la specificità e la disponibilità di reagenti e/o anticorpi - differiscono a seconda della specie utilizzata.

Oltre alle barriere tecniche allo studio dei FAP in un nuovo modello animale, sono state in gran parte studiate in un ambiente acuto e tossico, di solito tramite iniezione chimica intramuscolare o cardiotossina. La valutazione delle dinamiche a lungo termine dei FAP è limitata principalmente alla valutazione nella distrofia muscolare di Duchenne, utilizzando il modello murino mdx9,10,11e modelli di lesioni muscolari combinate come la rottura massiccia della cuffia dei rotatori in cui la traslazione e la denervazione del tendine concomitanti vengono eseguite sulla muscolatura della spalla26,27,28 . La risposta dei FAP al solo insulto della denervazione traumatica cronica, un evento comune negli incidenti sul posto di lavoro nell'industria pesante, nell'agricoltura e nei traumi alla nascita (lesione del plesso brachiale)34,35,36,37 con morbilità significativa, non è stata altrettanto ben caratterizzata, spesso limitata a un breve periodo di tempo11,38.

Descriviamo un metodo per identificare e isolare FAP e MP dal muscolo scheletrico sano e gravemente atrofico e fibrotico nel ratto. In primo luogo, viene dimostrata l'identificazione di MP CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- e CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ utilizzando un protocollo di colorazione della digestione dei tessuti e della citometria a flusso e la successiva convalida dei nostri risultati viene eseguita attraverso la coltura e la colorazione immunocitochimica di cellule isolate da FACS. Usando questo metodo, riportiamo anche un nuovo decorso temporale dei FAP in un modello di lesione da denervazione isolata a lungo termine nel ratto.

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Protocollo

Gli investigatori che conducono questo protocollo devono ricevere il permesso dal loro comitato etico / comitato di cura degli animali locale. Tutto il lavoro sugli animali è stato approvato dal St. Michael's Hospital Unity Health Toronto Animal Care Committee (ACC # 918) ed è stato condotto in conformità con le linee guida stabilite dal Canadian Council on Animal Care (CCAC). Uno schema del protocollo di citometria a flusso è mostrato nella Figura 1. Se l'applicazione a valle è FACS e successiva coltura cellulare, tutti i passaggi devono essere completati con una tecnica asettica adeguata.

1. Raccolta muscolare

  1. Anestetizzare i ratti utilizzando un anestetico appropriato e sacrificare secondo le linee guida locali del vivaio e del comitato etico animale. Questo protocollo raccoglie il muscolo gastrocnemio da ratti Lewis femmine adulte (200-250 g), ad esempio. I ratti sono stati anestetizzati con isoflurano al 2-3% e sono stati sacrificati mediante iniezione intracardiaca di T61.
  2. Una volta che l'animale è stato sacrificato, radere l'intero arto posteriore per facilitare la posizione del muscolo e ridurre al minimo la contaminazione della pelliccia del tessuto raccolto.
  3. Usando un bisturi sterile, fai due incisioni nella pelle: la prima intorno alla circonferenza dell'articolazione della caviglia e la seconda fino alla linea mediana dell'aspetto mediale dell'arto posteriore dalla caviglia all'anca.
  4. Staccare la pelle e gli strati muscolari superficiali per rivelare il gastrocnemio sottostante, che ha origine nei condili mediali e laterali del femore e si inserisce nel tendine di Achille.
  5. Utilizzare la dissezione smussata per separare il gastrocnemio dal tessuto circostante, maneggiando il muscolo solo dal tendine per evitare lesioni da schiacciamento.
  6. Separare il gastrocnemio dalla sua inserzione transettando il tendine di Achille nel modo più distale possibile con forbici affilate. Una volta tagliato, afferrare il tendine di Achille con una pinza e staccare delicatamente il gastrocnemio dall'osso sottostante. Tenendo ancora il muscolo con una pinza in una mano, individuare le due origini del gastrocnemio e tagliare i condili femorali mediali e laterali.
  7. Tamponare delicatamente il gastrocnemio asportato contro un pezzo sterile di garza per rimuovere più sangue possibile. Tagliare il muscolo su una superficie sterile e rimuovere il tessuto connettivo in eccesso e il tendine di Achille.
  8. Posiziona i muscoli in una barca di pesatura e pesa usando una bilancia di precisione. Questo protocollo è ottimizzato per digerire i muscoli con un peso umido che va da 200-600 mg. Gli operatori possono suddividere il tessuto raccolto in eccesso per altri saggi a valle, se lo desiderano.
  9. Dividere ulteriormente il muscolo raccolto da utilizzare per la citometria a flusso in 3-4 pezzi più piccoli (circa 1-2 cm3) e immergersi in 1x PBS ghiacciato. Mantenere freddo sul ghiaccio fino a quando tutti i campioni sono stati raccolti.

2. Digestione muscolare

  1. Rimuovere il muscolo dalla PBS e metterlo in una capsula sterile di coltura cellulare di 10 cm. Strappare e tritare delicatamente il tessuto con una pinza fino a quando i pezzi sono di circa 3-4 mm3, rimuovendo il più possibile il tessuto connettivo. Una volta accuratamente tritato, trasferire in un tubo conico sterile da 50 ml contenente 6 mL dmEM + 1% penicillina/ streptomicina (P / S).
  2. Aggiungere 10 μL di soluzione di CaCl2 da 300 mM a 365 μL di soluzione di Collagenasi II (concentrazione di stock 4800 U/mL) per attivare l'enzima collagenasi. Aggiungere la soluzione di collagenasi II attivata al tubo conico da 50 ml contenente il liquame tissutale. La concentrazione finale di collagenasi II è di 250 U/mL.
  3. Incubare i tubi in uno shaker per 1 ora a 37 °C, 240 x g, assicurandosi di ruotare manualmente ogni 15 minuti per rimuovere qualsiasi tessuto che ha aderito al lato del tubo.
  4. Dopo 1 ora, rimuovere i tubi dallo shaker e aggiungere quanto segue per campione: 100 μL di collagenasi II (4.800 U/mL) e 50 μL di dispasa (4,8 U/mL).
  5. Campioni di pipetta utilizzando una pipetta sierologica 15-20 volte fino a quando la soluzione è omogenea. Se si elaborano più campioni, utilizzare una pipetta sterile separata per ciascun campione per evitare la contaminazione incrociata del campione.
  6. Incubare nuovamente in uno shaker per 30 minuti a 37 °C e 240 x g. Dopo 15 minuti, agitare i campioni a mano per rimuovere il tessuto aderente dal lato del tubo.

3. Generazione di sospensioni monocellulari

  1. Tagliare lentamente i campioni attraverso una siringa da 10 ml con un ago da 20 G per 10 cicli.
    NOTA: Un ciclo prevede l'assunzione della soluzione muscolare nella siringa e l'iniezione nel tubo. Assicurarsi di ridurre al minimo eventuali bolle completando lentamente la tosatura, poiché un'eccessiva schiuma può causare ulteriore morte cellulare39.
  2. Posizionare un filtro cellulare da 40 μm su un tubo conico sterile da 50 mL e bagnarlo pipettando 5 mL DMEM + 10% FBS e 1% P/S.
  3. Pipettare 1 mL del campione alla volta attraverso il filtro cellulare.
  4. Lavare il filtro cellulare pipettando DMEM con 10% FBS e 1% P/S attraverso il filtro per portare il volume totale nel tubo a 25 ml.
  5. Dividere equamente 25 mL del campione in due tubi conici da 15 mL e centrifugare a 15 °C, 400 x g per 15 min.
    NOTA: La scissione della soluzione muscolare in due tubi conici da 15 mL garantisce un migliore recupero cellulare dopo la centrifugazione rispetto a un singolo tubo.
  6. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL 1x tampone di lisi RBC (vedi File supplementare)a temperatura ambiente per 7 minuti per eliminare gli eritrociti.
  7. Portare il volume a 10 mL con 9 mL di tampone di lavaggio (vedi File supplementare)e centrifuga tubi a 400 x g,15 °C per 15 min.
  8. Aspirare il surnatante e ricombinare i pellet riaspensendo in 1 mL di tampone di lavaggio.
  9. Trasferire un volume appropriato di cellule in un tubo microcentrifuga separato da 1,5 ml e mescolare con colorante blu tripano. Conta le cellule vive su un microscopio ottico usando un emocitometro.

4. Colorazione anticorpale per citometria a flusso

NOTA: L'anticorpo Sca-1 deve essere coniugato all'APC prima degli esperimenti di citometria a flusso/FACS, secondo le istruzioni del produttore. Le prestazioni devono essere convalidate per ogni lotto di coniugati (Figura 2). Le coniugazioni finali possono essere conservate in aliquote da 20 μL a -20 °C e sono stabili per tre settimane. Fare riferimento al file supplementare per il protocollo di coniugazione completo.

  1. Per la citometria a flusso, trasferire 1-2 x10 6 cellule per campione sperimentale in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 ml. Portare il volume fino a 1 mL con tampone di lavaggio e mettere sul ghiaccio.
  2. Per ogni esperimento, impostare i seguenti controlli richiesti: i) non macchiati e ii) controlli di vitalità per selezionare con precisione la popolazione di cellule vive; iii) controlli di fluorescenza meno uno (FMO) su sospensioni a cella singola per impostare cancelli accurati per frazioni CD31-/CD45-, FAPs e MP; e iv) perline di compensazione monocolorate per correggere lo spillover di fluorescenza tra i canali.
    1. Per tutti i controlli cellulari, aliquota 5 x 105 - 1 x 106 celle in 1 mL di tampone di lavaggio in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e posto su ghiaccio.
    2. Per i controlli delle perline, aggiungere 1 goccia di perline di compensazione positiva (~ 1,5 x 105 perline per goccia) a ciascun tubo microcentrifuga da 1,5 mL etichettato. L'intero complemento dei controlli è elencato nella tabella 1.
      NOTA: se l'esperimento viene eseguito per la prima volta, eseguire controlli a colorazione singola per ciascun anticorpo coniugato su sospensioni monocellulari (oltre a controlli non macchiati, vitali, perline di compensazione a colorazione singola e FMO) per valutare la popolazione macchiata positiva nelle cellule e convalidare la colorazione osservata sulle perle di compensazione. Convalidare ogni preparazione Sca-1::APC appena coniugata eseguendo una singola colorazione su perline di compensazione e sospensioni a cella singola. Fare riferimento alla Tabella 1 per un elenco completo dei controlli di colorazione.
  3. Per preparare il controllo di vitalità, trasferire metà del volume di cellule dal tubo di "vitalità" a un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 ml. Etichettare questo tubo "Morto".
  4. Incubare il tubo "morto" a 65 °C per 2-3 minuti per uccidere le cellule, quindi metterle sul ghiaccio. Dopo 2-3 minuti, ricompilare le cellule morte con le cellule vive che rimangono nel tubo di controllo della vitalità. Questa popolazione di cellule verrà utilizzata per impostare i valori di compensazione (se necessario) e impostare correttamente le porte per il colorante di vitalità.
  5. Centrifugare le sospensioni monocellulari (campioni sperimentali e controlli) a 500 x g,4 °C per 5 min.
  6. Aspirare il surnatante e ri-sospendere i pellet di cella in un tampone di lavaggio da 100 μL.
  7. Aggiungere anticorpi, a seconda del campione sperimentale o del controllo. Fare riferimento alla matrice di colorazione (Tabella 2) per informazioni sulle combinazioni e le quantità di anticorpi.
  8. Scorrere delicatamente ogni campione per garantire la miscelazione completa e incubare sul ghiaccio al buio per 15 minuti. Per la compensazione delle perline, incubare a temperatura ambiente al buio per 15 minuti.
  9. Per i campioni sperimentali e di controllo in sospensione monocellulare, portare il volume a 1 mL aggiungendo un tampone di lavaggio da 900 μL. Per i controlli delle perline di compensazione, portare il volume a 1 mL con 900 μL di 1x PBS.
  10. Centrifugare campioni di sospensione monocellulare a 500 x g,4 °C per 5 min. Controlli per perline di compensazione centrifughe a 300 x g,4 °C per 5 min.
  11. Per tutti i campioni di sospensione a cella singola, aspirare ed eliminare il surnatante e rimettere il pellet cellulare in un tampone di lavaggio da 300 μL. Per i controlli del tallone di compensazione, aspirare e scartare il surnatante, sospendere nuovamente il pellet in 300 μL di 1x PBS, quindi aggiungere 1 goccia (~ 1,5 x 105) di perline di compensazione negativa.
  12. Conservare tutti i campioni di sospensione a singola cellula su ghiaccio sotto un foglio di alluminio e procedere all'acquisizione citometrica a flusso. Anche i controlli dei talloni di compensazione devono essere protetti dalla luce, ma possono essere mantenuti a temperatura ambiente.
    NOTA: se l'endpoint sperimentale è l'identificazione dei FAPs mediante citometria a flusso, seguire i passaggi 5.1.1-5.1.11. Se l'endpoint è l'isolamento cellulare tramite FACS per la coltura e la colorazione, seguire i passaggi 5.2.1-5.2.9 e i paragrafi 6-7.

5. Citometria a flusso e selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS)

  1. Citometria a flusso
    NOTA: Questo protocollo utilizza un citometro a flusso da banco dotato di laser da 405 nm, 488 nm e 640 nm in grado di distinguere contemporaneamente 10 colori diversi. I filtri passa-banda e i fluorocromi associati utilizzati in questo protocollo sono i seguenti: 450/50 (SYTOX Blue), 530/30 (FITC), 575/25 (PE) e 670/30 (APC). Le tensioni per ogni rivelatore sono le seguenti: FSC 700; SSC 475; FITC 360; PE 460; PE-Cy7 600; SYTOX Blu 360; APC 570. Assicurarsi di essere addestrati sul corretto funzionamento del citometro a flusso o del selezionatore di cellule prima dell'uso.
    1. Assicurarsi che il citometro sia stato acceso per 10-20 minuti prima dell'uso e che sia stato innescato pulendo sequenzialmente con soluzioni fluide pulite, risciacquate e guainate per 30-45 s ciascuna. Terminare con un risciacquo con dH2O. Assicurarsi che un volume adeguato di liquido di guaina sia stato aggiunto al contenitore di stoccaggio per mantenere il corretto flusso del campione durante l'acquisizione.
    2. Impostare la strategia di gating per identificare i FAP e i PARLAMENTARI come delineato nella Figura 3.
      NOTA: i FAP e i MP sono identificati dalla seguente strategia gerarchica di gating: i) SSC-A vs FSC-A (area di scatter delle celle laterali rispetto all'area di scatter delle celle in avanti per separare le celle vs detriti), ii) FSC-W vs FSC-H (larghezza di dispersione della cella in avanti rispetto all'altezza di dispersione della cella in avanti per discriminare i singoletti dai doppietti nel parametro FSC), iii) SSC-W vs SSC-H (larghezza dello scatter della cella laterale rispetto all'altezza dello scatter della cella laterale per discriminare le canottiere dai doppietti nel parametro SSC), iv) SSC-A vs SYTOX Blue (per distinguere le singolette vive da quelle morte), v) SSC-A vs CD31/45::FITC (per escludere le celle CD31+ e CD45+ da ulteriori analisi) e vi) Sca-1::APC vs VCAM-1::P E dal CD31-/CD45- (Lineage; Lin-) popolazione (identificazione di FAPs e MP). I FAP sono identificati come eventi CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- e i MP sono identificati come eventi CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+.
    3. Per prima cosa eseguire ogni controllo del tallone di compensazione a singola colorazione attraverso il citometro a bassa velocità per generare valori di compensazione utilizzati per correggere eventuali ricadute di fluorescenza tra i canali. Valutare la compensazione confrontando il segnale fluorescente di ciascun controllo nel proprio rivelatore (ad esempio, SSC-A vs APC per perline a colorazione singola Sca-1::APC) e tutti gli altri rilevatori. Ci dovrebbero essere due popolazioni distinte (una con segnale negativo e una con segnale positivo) nel rivelatore appropriato e solo una popolazione negativa in tutti gli altri rivelatori. Imposta il cancello di arresto su 10.000 eventi di perline di compensazione e registra i dati.
      NOTA: tra un'acquisizione e l'altra di ciascun campione, assicurarsi di eseguire dH2O attraverso il citometro per 10-20 secondi per evitare la contaminazione da campione a campione.
    4. Successivamente elaborare i campioni di controllo non macchiati e di vitalità per gateare correttamente su singole celle vive. Imposta il cancello di arresto su 10.000 eventi singlet e registra i dati.
      NOTA: Circa 5 minuti prima dell'acquisizione di ogni singolo campione di sospensione cellulare ad eccezione del campione non macchiato, aggiungere 1 μL di colorante di vitalità SYTOX Blue (concentrazione di lavoro di 300 μM diluita da 1 mM di soluzione madre) a ciascun campione e scorrere delicatamente per miscelare (concentrazione finale 1 μM).
    5. Quindi acquisire i restanti campioni di controllo della sospensione a cella singola. Valutare ogni controllo FMO con il suo grafico appropriato nella strategia di gating (Figura 3). Ad esempio, valutare il segnale FITC dell'FMO CD31+CD45 per garantire un gate CD31/CD45 accurato. Un esempio ottimale è mostrato nella Figura 3G. Se il protocollo viene eseguito per la prima volta, i controlli a macchia singola sulle cellule devono essere eseguiti prima dell'acquisizione dei controlli FMO.
    6. Valutare il segnale fluorescente di ciascun campione di cella a singola macchia nel suo rivelatore appropriato e in tutti gli altri rivelatori per convalidare la corretta compensazione. Imposta il cancello di arresto su 10.000 eventi singlet dal vivo e registra sul software.
    7. Una volta che tutti i controlli (sospensioni e perline a cella singola) sono stati elaborati, preparare tutti i campioni sperimentali misurando e registrando prima il volume di ciascun campione. Queste misurazioni saranno utilizzate per quantificare con precisione FAP e MP, come descritto nella fase 5.1.11. Quindi, aggiungere 50 μL di perline di conteggio di precisione e mescolare delicatamente pipettando su e giù 2-3 volte.
    8. Eseguire brevemente il primo campione sperimentale per convalidare l'identificazione della popolazione di perline di conteggio. Questa popolazione appare come un piccolo cluster distinto separato dalla popolazione cellulare generale sul grafico FSC-A vs SSC-A (Figura 3A, riquadro rosso). Crea un cancello attorno alla popolazione di perline di conteggio. Quindi acquisire i dati per ogni campione sperimentale elaborando attraverso il citometro a bassa velocità. Imposta il cancello di arresto su 10.000 eventi di perline di conteggio e registra.
      NOTA: gli investigatori possono in alternativa identificare le perle di conteggio impostando un terreno aggiuntivo che valuti SSC-A rispetto a uno qualsiasi dei rivelatori, poiché le perle di conteggio sono fluorescenti in tutti i rivelatori.
    9. Dopo che tutti i campioni sono stati elaborati, pulire il citometro utilizzando i protocolli appropriati. Esporta tutti i dati per l'analisi.
    10. Aprire tutti i file di dati su un software di analisi della citometria a flusso appropriato. Impostare la strategia di gating utilizzata per l'acquisizione dei dati come descritto nel passaggio 5.1.2. Esaminare i controlli nello stesso ordine dell'acquisizione dei dati (ad esempio, non macchiato, vitalità, singola macchia, quindi controlli FMO) per riconvalidare la strategia di gating. Una volta che i cancelli accurati sono stati impostati utilizzando i controlli FMO, applicare i cancelli a tutti i campioni sperimentali. Esporta i dati grezzi come foglio di calcolo per la quantificazione.
    11. Calcola il numero di FAP e MP in ciascun campione sperimentale utilizzando le perle di conteggio:
      figure-protocol-18353
      dove, Il conteggio delle cellule acquisite è il numero di eventi registrati della popolazione cellulare pertinente (ad esempio VIP o MP) sul software di acquisizione; Il conteggio dei perline acquisito è il numero di eventi registrati di conteggio delle perline sul software di acquisizione; Counting Beads Volume è il volume della soluzione di perline di conteggio aggiunto nel passaggio 5.1.7; Il volume del campione è il volume di ciascun campione sperimentale colorato prima dell'aggiunta di perline di conteggio. La concentrazione di perline è il numero di perline per soluzione di μL; questo valore si trova nella scheda tecnica del prodotto.
  2. FACS - smistamento per colture cellulari
    NOTA: Questo protocollo esegue FACS su un selezionatore di celle dotato di 4 laser (UV, Viola, Blu, Rosso) che è in grado di distinguere contemporaneamente 11-14 colori. Seguire la colorazione sperimentale del campione (sezione 4) e il protocollo di citometria a flusso, con le eccezioni dei passaggi da 1 a 3 delineati di seguito, per ottimizzare il flusso di lavoro FACS:
    1. Aumentare la concentrazione di cellule nei campioni sperimentali da selezionare a 7 x 106 celle/ml per generare robuste rese di FAP e MP.
    2. Per tenere conto di questo significativo aumento della concentrazione cellulare, raddoppiare tutte le concentrazioni di anticorpi nei campioni sperimentali da selezionare.
    3. Elaborare i campioni finali di cellule colorate attraverso un tappo del filtro cellulare da 40 μM fissato a un tubo di polistirene da 5 ml immediatamente prima della cernita per ridurre l'aggregazione cellulare e aumentare le rese di selezione.
    4. Raccogliere FAP e MP di ratto singoli e vivi direttamente dalla selezionatrice cellulare in un tubo di raccolta in polipropilene da 5 ml contenente 1 mL di siero bovino fetale sterile al 100% (FBS). Mantenere le cellule sul ghiaccio fino al completamento dello smistamento.
      NOTA: se si esegue FACS in un luogo fuori sede, trasferire tutte le celle selezionate sul ghiaccio e in un contenitore coperto e protetto.
    5. Lavorando in un armadio sterile di biosicurezza (BSC), portare il volume di cellule selezionate fino a 7 ml con mezzi di crescita appropriati (ad esempio, mezzi di crescita FAP (FAP GM) per i FAP ordinati e mezzi di crescita MP (MP GM) per i MP ordinati; vedere File supplementare per le ricette) e centrifugare a 500 x g, 4 °C per 7 minuti per rimuovere il più possibile il tampone di lavaggio residuo.
    6. Sostituire i pellet in 1 mL di terreno di crescita appropriato e in una piastra in una piastra a 12 pozzetti contenente un coperchio/pozzetto sterile di vetro da 12 mm rivestito di collagene per la successiva immunocolorazione (vedere paragrafo 6).
      NOTA: Se l'immunocitochimica colora per il collagene, le cellule selezionate in una piastra a 12 pozzetti contenente un coperchio / pozzetto di vetro sterile da 12 mm rivestito di laminina, invece di rivestito di collagene. Se sono necessari esperimenti di immunocitochimica di progenitori immediatamente isolati, seminare FAP e MP ad una densità di 15.000 cellule per cm2 e procedere direttamente al passaggio 6.1. Per le colture a lungo termine per indurre la differenziazione progenitrice, i FAP di semi ad una densità di 5.000 cellule per cm2e i PARLAMENTARI ad una densità di 7.500 cellule per cm2.
    7. Incubare le cellule a 37 °C e al 5% di CO2 in un incubatore di colture cellulari. Dopo 72 ore in cultura, cambia metà dei media. Cambia completamente i supporti ogni 2-4 d dopo.
    8. Per indurre lo sviluppo dei miociti, passare le colture dei MP al mezzo di differenziazione MP (MD) il giorno 9 della coltura. Per indurre gli adipociti, passare le colture DI FAPs al mezzo di differenziazione adipogenica FAP (AD) il giorno 10 della coltura.
    9. Per indurre la fibrogenesi, i FAP possono essere commutati in mezzi di differenziazione fibrogenica (FD) in momenti variabili durante la coltura o, in alternativa, possono essere seminati direttamente in mezzi FD dopo l'isolamento (fase 5.2.6) (vedere file supplementare per tutte le ricette dei media).

6. Immunocitochimica di FAP e PARLAMENTARI in coltura

  1. Per convalidare l'ordinamento cellulare e dimostrare la purezza delle colture di FAPs e MP, immunomacchia con marcatori specifici del tipo cellulare tra cui PDGFRα (marcatore FAPs), Pax-7 (marcatore cellulare [satellite] dello stelo muscolare), proteina specifica dei fibroblasti (FSP-1, marcatore dei fibroblasti), Perilipin-1 (Plin-1, marcatore degli adipociti), Collagene di tipo 1 (Col1a1, indicatore di fibrosi), Myosin Heavy Chain (MHC, marcatore di miociti maturi).
    1. Per l'immunocolorazione delle cellule appena selezionate, centrifugare la piastra a 12 pozzetti a 200 x g per 3 minuti a temperatura ambiente per facilitare l'aderenza delle cellule al coverslip/pozzo. Questo passaggio non è necessario per le culture a lungo termine. Rimuovere i supporti della cultura.
    2. Per l'immunocolorazione con FSP-1, fissare le cellule con 1 mL di metanolo al 100% (MeOH) per 2 minuti a 4 °C. Se immunocolorante per PDGFRα, Plin-1, Pax7 o Col1a1, fissare colture cellulari con 1 mL 4% PFA in 1x PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. L'immunocolorazione MHC tollera entrambi i fissativi.
      NOTA: per le celle fisse a metanolo, saltare il passaggio 6.2 e procedere al passaggio 6.3.
  2. Aspirare il 4% di PFA e lavare rapidamente le colture cellulari 3-4 volte con 1x PBS. Aggiungere 1 mL di 100 mM di glicina in 1x PBS e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente per inattivare il PFA residuo. Aspirare e lavare 1-2 volte con 1x PBS.
    NOTA: Le celle possono essere lasciate in questa fase in 2 mL di 1x PBS, avvolte in pellicola trasparente e conservate a 4 °C per un massimo di 7-10 giorni.
  3. Dopo il lavaggio, aggiungere 1 mL di Triton-X allo 0,1% in 1x PBS e incubare per 20 minuti per permeabilizzare le membrane cellulari.
  4. Lavare i pozzetti 2-3 volte con 1-2 mL di 1x PBS quindi bloccare le celle con 1 mL di 1x PBS + 3% BSA per pozzetto per 1 ora a temperatura ambiente.
  5. Pipetta 80 μL di anticorpo primario diluito in 1x PBS + 3% BSA (PDGFRα 1:100, Pax7 pulito, FSP-1 1:50, Plin-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 μg/mL) su un pezzo di parafilm fissato a un contenitore mobile. Usando una pinza fine sterile, sollevare con attenzione la slitta di copertura dal pozzo e invertire sulla goccia di soluzione anticorpale. Incubare il coperchio con due pezzi bagnati di carta assorbente e coprire il contenitore in pellicola di plastica per evitare l'evaporazione della soluzione anticorpale. Incubare durante la notte a 4 °C.
    NOTA: la colorazione dei coverslip fuori dal pozzo utilizza meno anticorpi (~ 80 μL) rispetto alla colorazione all'interno del pozzo (minimo 500 μL).
  6. Il giorno 2, lasciare le coperture a temperatura ambiente per 30 minuti per riscaldare. Usando la pinza con attenzione a destra e trasferisci le coperture ai rispettivi pozzetti (cellule rivolte verso l'alto) e lava 2-3 volte con 1-2 ml di 1x PBS per 2 minuti ciascuna per rimuovere il maggior numero possibile di anticorpi primari.
  7. Utilizzando la stessa tecnica di colorazione della colorazione degli anticorpi primari, le cellule di colore con l'anticorpo secondario Alexa Fluor 488 anti-coniglio di capra (1:400) per rilevare FSP-1, Plin-1, Col1a1 o PDGFRα e l'anticorpo secondario alexa Fluor 555 anti-topo di capra (1:300) per rilevare MHC o Pax-7. Incubare le cellule per 1 ora a temperatura ambiente e mantenere le cellule protette dalla luce.
  8. Riportare le cellule al pozzo e incubare le cellule con Hoechst (1:10.000) per 2-4 minuti a temperatura ambiente. Lavare le celle altre 2-3 volte con 1x PBS per 2 minuti ciascuna per rimuovere l'eccesso di Hoechst.
  9. Montare i coperchi su vetrini utilizzando un mezzo di montaggio fluorescente anti-dissolvenza e lasciare asciugare le diapositive durante la notte al buio a temperatura ambiente. Conservare i coperchi montati a 4 °C al buio.

7. Colorazione Oil Red O (ORO) di FAP e PARLAMENTARI coltivati

  1. Eseguire la colorazione ORO su cellule non permeabilizzate, poiché la permeabilizzazione della membrana cellulare può comportare una colorazione non specifica / indesiderata di tipi di cellule non adipogeniche. Prima di iniziare la colorazione, preparare un brodo di lavoro ORO (vedere il file supplementare per la ricetta) e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti.
  2. Dopo 20 minuti, filtrare la soluzione utilizzando un filtro da 0,2 μm per rimuovere eventuali aggregati non disciolti.
  3. Aspirare i mezzi dal pozzo e aggiungere 1 mL di formalina tamponata neutra al 10% (10% NBF). Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: la confluenza cellulare può comportare il sollevamento dal pozzo / coverslip. Prestare attenzione quando si aspirano/si aggiungono soluzioni.
  4. Aspirare e aggiungere 1 mL di NBF fresco al 10% e incubare per almeno 1 ora a temperatura ambiente.
    NOTA: il protocollo può essere interrotto a questo punto, poiché le celle possono essere lasciate in 10% NBF durante la notte.
  5. Lavare rapidamente i pozzetti una volta con 1 mL di isopropanolo al 60%, quindi aspirare e lasciare asciugare completamente i pozzetti (circa 2 min).
  6. Aggiungere 400 μL di olio rosso O di stock di lavoro per pozzetto e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, assicurandosi di evitare il pipettaggio di qualsiasi ORO sulle pareti della piastra.
  7. Rimuovere tutto l'Olio Rosso O e lavare rapidamente il pozzetto 4 volte con dH2O.
    NOTA: se i pozzetti macchiati contengono coverslip, montare utilizzando la stessa tecnica descritta al passaggio 6.9.
  8. Immagine di coverslip montati o del pozzo macchiato usando un microscopio a campo luminoso.

8. Colorazione tissutale di sezioni di gastrocnemio di ratto controlaterale e denervato

  1. Picrosirius Rosso (PSR)
    1. Eseguire la colorazione PSR su sezioni istoma istologica di ratto incorporato in paraffina incorporata (FFPE) con paraffina fissa in formalina di spessore 5 μm come descritto in precedenza40.
  2. Olio Rosso O (ORO)
    1. Fissare sezioni istologiche di ratto congelato con isopentano di spessore 5 μm in PFA al 4% per 10 minuti, incubare in alcool isopropilico al 60% per 1 minuto.
    2. Macchia con stock di lavoro ORO per 12 min. Incubare in alcool isopropilico al 60% per 1 minuto, lavare per 10 minuti in dH2O. Montare su coperchi utilizzando un supporto di montaggio solubile in acqua.
  3. Sca-1 e immunoistochimica fluorescente del tessuto laminina (IHC)
    1. Eseguire IHC fluorescenti su sezioni istologiche gastrocnemio di ratto congelate con isopentano di spessore 5 μm.
    2. Idratare i campioni in 1x PBS per 5 min, fissare in PFA al 4% per 10 min, quindi incubare i campioni in soluzione di blocco IF tissutale (vedere File supplementare)per 90 min.
    3. Incubare con anticorpo primario anti-Sca-1 (1:500) diluito in 1x PBS + 0,05% Tween a 4 °C durante la notte.
    4. Il giorno 2, lavare tre volte in 1x PBS + 0,05% Tween per 5 minuti ciascuno, quindi incubare in capra anti-coniglio Alexa Fluor 555 (1:500) per 1 ora.
    5. Lavare di nuovo (come prima), incubare con soluzione bloccante per 1 ora, quindi aggiungere l'anticorpo primario anti-laminina (1:500) diluito in 1x PBS + 0,05% Tween per 1 ora.
    6. Lavare di nuovo (come prima), quindi incubare in capra anti-coniglio Alexa Fluor 488 (1:500) per 1 ora (per laminina).
    7. Lavare di nuovo (come prima) quindi incubare in DAPI (1:10.000) per 4 min. Lavare e montare su coverslip utilizzando un mezzo di montaggio anti-dissolvenza.

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Risultati

Identificazione di FAP e MP tramite citometria a flusso utilizzando un nuovo pannello anticorpale tra cui Sca-1 e VCAM-1
La strategia di gating per l'identificazione dei FAP nel muscolo di ratto si basa sui protocolli di citometria a flusso nel topo29, che gate su cellule cd31 (endoteliali) e CD45 (ematopoietiche) positive (chiamato lignaggio [Lin]) ed esamina il profilo fluorescente del marcatore FAPs Sca-1 e del marcatore MP...

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Discussione

Un protocollo di isolamento DEI FAP ottimizzato e convalidato per il muscolo di ratto è essenziale per i ricercatori che desiderano studiare modelli di lesioni che non sono fattibili nel topo per motivi biologici o tecnici. Ad esempio, i topi non sono un modello animale ottimale in cui studiare lesioni croniche locali o neurodegenerative come la denervazione a lungo termine. Biologicamente, la breve durata della vita e il rapido invecchiamento dei topi rendono difficile delineare con precisione le sequalae muscolari a c...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti da rivelare.

Riconoscimenti

Vorremmo ringraziare le strutture principali della citometria a flusso presso l'Università di Ottawa e il Keenan Research Centre for Biomedical Sciences (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto per la loro esperienza e guida nell'ottimizzazione del protocollo di citometria a flusso / FACS presentato in questo manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) a JB.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL Polypropylene Round-Bottom TubeFalcon352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer CapFalcon352235
10 cm cell culture dishesSarstedt83.3902
12-well cell culture plateThermoFisher130185
12 mm glass coverslips, No.2VWR89015-724
10 mL SyringeBeckton Dickenson302995
15 mL centrifuge tubesFroggaBio91014
20 gauge needleBeckton Dickenson305176
25mL Serological pipetteSarstedt86.1685.001
40µm cell strainerFisher Scientific22363547
50mL centrifuge tubesFroggaBioTB50
AbC Total Antibody Compensation Beads ThermoFisherA10497
Ammonium Chloride, Reagent GradeBioshopAMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µgBiotium92307
Aquatex Aqueous Mounting MediumMerck108562
Biolaminin 411 LNBiolaminaLN411
Bovine Serum Albumin (BSA)BioshopALB001
Calcium ChlorideBioshopCCL444.500
Collagenase Type IIGibco17101015
CountBright Plus Absolute Counting BeadsThermoFisherC36995
DexamethasoneMillipore SigmaD4902
DispaseGibco17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Gibco11995-065(+)4.5 g/L D-Glucose
(+)L-Glutamine
(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTAFisherScientificS311
FACSClean SolutionBeckton Dickenson340345
FACSDiva SoftwareBeckton Dickenson--
FACSRinse SolutionBeckton Dickenson340346
Fetal Bovine SerumSigmaF1051
Flow Cytometry Sheath FluidBeckton Dickenson342003
FlowJo SoftwareBeckton Dickenson--
Fluorescent Mounting MediumDakoS302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibodyInvitrogenA21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibodyInvitrogenA11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibodyInvitrogenA21429
Goat SerumGibco16210-064
Ham's F10 MediaThermoFisher 11550043(+) Phenol Red
(+) L-Glutamine
(-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)Multicell311-513-CL
Heat Inactivated Horse SerumGibco26050-088
HemocytometerReichertN/A
HEPES, minimum 99.5% titrationSigmaH3375
Horse SerumThermoFisher16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1)Cell Signaling8915LF
Humulin RLillyHI0210
IBMXMillipore SigmaI5879Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
IsopropanolSigmaI9516Also known as 2-propanol
Lewis Rat, FemaleCharles River Kingston004 (Strain Code)200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop CytometerBeckton Dickenson--
MicrocentrifugeEppendorfEP-5417R
MoFlo XDP Cell SorterBeckman Coulter--
Mouse Anti-CD31::FITC AntibodyAbcamab33858Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC AntibodyBiolegend202205Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE AntibodyBiolegend200403Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/AAlso known as MF20
Mouse Anti-Pax7 AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 %SigmaHT501128
Oil Red OMillipore SigmaO0625
PE-Cy7 Conjugation KitAbcamab102903
Penicillin-StreptomycinSigma P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)Gibco10010-023(-)Calcium Chloride
(-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent GradeBioshopPBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) AntibodyInvitrogenMA5-32347FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 AntibodyAbcamab203254
Rabbit Anti-Laminin AntibodySigmaL9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 AntibodyAbcamab3526
Rabbit Anti-Sca-1 AntibodyMillipore SigmaAB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I AntibodyAbcamab260043Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha AntibodyAbcamab203491
Recombinant Human FGF-basicGibcoPHG0266
Sodium AzideSigmaS2002
Triton-X-100Fisher ScientificBP151
TroglitazoneMillipore SigmaT2573
Tween-20BioshopTWN510

Riferimenti

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