Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, Fibro-adipojenik progenitörleri (FAP'ler) ve miyojenik progenitörleri (milletvekilleri) sıçan iskelet kasından izole etmek için bir yöntemi özetlemektedir. Sıçanın kas yaralanması modellerinde kullanılması, analiz için atrofik kastan doku mevcudiyetinin artmasını ve serbest hareket eden hayvanlarda kas gücünü ve yürüyüşlerini değerlendirmek için doğrulanmış yöntemlerden oluşan daha büyük bir repertuar sağlar.

Özet

Fibro-adipojenik Progenitors (FAP'lar), miyojenik progenitörler (milletvekilleri) ile birlikte kas homeostazında, yaralanmada ve onarımda önemli bir rol oynayan iskelet kasında yerleşik interstisyel hücrelerdir. SSS tanımlama ve izolasyon kullanım akış sitometrisi/floresan-aktif hücre sıralama (FACS) için mevcut protokoller ve bugüne kadar in vivo işlevlerini değerlendiren çalışmalar sadece farelerde yapılmıştır. Sıçanın daha büyük doğal boyutu, iskelet kası yaralanma modellerinde, özellikle ciddi atrofik kaslarda veya araştırmacılar birden fazla aşağı akış testi yapmak için önemli doku kütlesine ihtiyaç duyarsa, FAP'lerin daha kapsamlı bir analizini sağlar. Sıçan ayrıca hayvan sedasyonu veya fedakârlık gerektirmeyen daha geniş bir kas fonksiyonel tahlil seçimi sağlar, böylece seri değerlendirmeleri etkinleştirerek morbidite ve hayvan kullanımını en aza indirir. Fareler için optimize edilen akış sitometrisi / FACS protokolleri, özellikle piyasada bulunan antikorların özellikleri ile sınırlı olan türlere özgüdür. SSS'leri sıçan veya yüksek fibrotik kastan ayırmak için optimize edilmediler. CD31, CD45, Sca-1 ve VCAM-1 yüzey belirteçlerinin diferansiyel ekspresyonlarına dayanarak, HEM sağlıklı hem de denervatlı sıçan iskelet kasından FAP'lerin ve milletvekillerinin tanımlanması ve izolasyonu için bir akış sitometrisi / FACS protokolü geliştirilmiştir. Sıçana özgü, akış sitometrisi doğrulanmış primer antikorlar ciddi şekilde sınırlı olduğundan, Sca-1'i hedefleyen antikorun şirket içi konjugasyonu yapıldı. Bu protokol kullanılarak, başarılı Sca-1 konjugasyonu onaylandı ve FAP'lerin ve milletvekillerinin akış sitometrik tanımlaması hücre kültürü ve FACS izole EDILMIŞ SSP'lerin ve milletvekillerinin immünostainasyonu ile doğrulandı. Son olarak, uzun süreli (14 haftalık) bir sıçan denervasyon modelinde yeni bir FAP zaman kursu bildiriyoruz. Bu yöntem, araştırmacılara yeni bir hayvan modelinde SSS inceleme olanağı sağlar.

Giriş

Fibro-adipojenik progenitör hücreler (FAP'ler), iskelet kasında kas homeostazında, onarımında ve yenilenmesinde kritik rol oynayan ve tersine kas yaralanmasına patolojik yanıtlara aracılık eden yerleşik çok güçlü progenitör hücrelerin bir popülasyonudur. Adından da anlaşılacağı gibi, FAP'ler başlangıçta fibroblastlara ve adipositlere1'e farklılaşma potansiyeline sahip bir ata popülasyonu olarak tanımlandı ve kronik yaralanma ve hastalıkta iskelet kasının fibro-yağlı infiltrasyonunun anahtar arabulucuları olduğu iddia edildi. Daha fazla çalışma, FAP'lerin ek olarak osteogenez ve kondrogenez2,3,4. Bu nedenle, literatürde mezenkimal veya stromal progenitors 3 ,5,6,7,8olarak daha geniş bir şekilde not edilirler. Akut iskelet kası yaralanmasında, FAP'lar, aktif kas uydu hücreleri ve aşağı akış miyojenik progenitörleri (milletvekilleri) meslektaşları1,9,10için elverişli bir ortam sağlamak için geçici olarak çoğalarak rejeneratif miyogenezde dolaylı olarak yardımcı olur. Başarılı rejenerasyona paralel olarak, FAP'lar apoptoz geçirir ve sayılarını temel düzey 1 ,9,10,11'e döndürür. Buna karşılık, kronik kas yaralanmasında, FAP'ler pro-apoptotik sinyalleri geçersiz kılar, bu dakalıcılıkları 9,10,11 ve anormal kas onarımı ile sonuçlanır.

FAP'lerin kas yanıtlarına aracılık ettiği hücresel ve moleküler mekanizmaları değerlendiren in vivo çalışmalar bugüne kadar 1,7 , 9 ,10,11,12,13,14. Genetik olarak tasarlanmış fareler bu analizlerde kullanılmak üzere güçlü araçlar olsa da, hayvanın küçük boyutu, travmatik denervasyon gibi kas atrofisinin derin olabileceği uzun süreli lokalize yaralanma modellerinde çalışmak için doku kullanılabilirliğini sınırlar. Ayrıca, kas gücü ve fiziksel fonksiyon ölçümü, farenin sonlandırılmasını gerektiren ex vivo veya yerinde ölçümler veya kas kontrtilyon performansının değerlendirilmesine izin vermek için cerrahi ve / veya genel anestezi gerektiren in vivo yöntemler gerektirir15,16,17,18,19,20 . Sıçanlarda, iyi doğrulanmış ve küresel olarak kullanılan kas fonksiyonel analizleri, yürüyüş analizi (örneğin, Siyatik Fonksiyon İndeksi, CatWalk analizi) gibi daha karmaşık motor davranışları için analizlere ek olarak mevcuttur ve uyanık ve kendiliğinden hareket eden hayvanlarda 21 ,22,23,24 . Bu ayrıca hayvan deneylerinde minimum morbidite ilkelerini ve kullanılan araştırma hayvanlarının sayısını optimize eder. Sıçan böylece FAP araştırmacısına protein ve hücresel analizler için daha fazla yaralı kas hacminin ek esnekliğini ve uyarı hayvanında kas kompleksi statik ve dinamik fonksiyonel aktivite ve davranışların seri değerlendirmelerini yapma yeteneğini sağlar.

SSS'ler öncelikle akış sitometrisi ve Floresan ile aktive hücre sıralama (FACS) kullanılarak tüm kas örneklerinden tanımlanmış ve izole edilmiştir. Bunlar, boyut, parçalılık ve hücre yüzeyi veya hücre içi belirteçlerin belirli bir kombinasyonu gibi karakteristik özelliklere göre birden fazla spesifik hücre popülasyonu tanımlayabilen lazer tabanlı tahlillerdir25. Homeostaz ve rejenerasyon çok sayıda hücre tipi tarafından koordine edilen karmaşık, çok yönlü süreçler olduğu için iskelet kası gibi bir organ sisteminin çalışmasında bu oldukça avantajlıdır. Ufuk açıcı bir çalışma, fare iskelet kasında akış sitometrik yöntemlerini kullanarak FAP'ların yanı sıra milletvekillerini tanımladı1. FAP'lerin doğada mezenkimal olduğunu gösterdiler. endotel (CD31), hematopoetik (CD45) veya miyojenik (Integrin-α7 [ITGA7]) kökenlerinden hücrelere özgü yüzey antijenlerinden yoksun oldukları için, ancak mezenkimal kök hücre işaretleyicisi Sca-1 (Kök hücre antijeni 1)1'i ifade ettiler ve kültürde fibrojenik ve adipojenik hücrelere farklılaştılar. Diğer çalışmalar, alternatif bir kök hücre belirteci, trombosit türevi büyüme faktörü reseptörü alfa (PDGFRα)2,7,8 ve daha fazla analiz ifadesine dayanarak kastaki mezenkimal progenitörlerin başarılı bir şekilde izole edildiğini göstermiştir. SP'ler artık akış sitometrisinde Sca-1 veya PDGFRα pozitif seçim işaretçisi 1 , 9,10,11,12,13,14,26, 27,28,29,30,31kullanılaraktanımlanır. . PDGFRα kullanımı insan dokusu için tercih edilir, ancak murine Sca-1'in doğrudan bir insan homologu henüz tanımlanmıştır32. Ek olarak, diğer hücre yüzey proteinleri milletvekillerinin belirteçleri olarak bildirilmiştir (örneğin, VCAM-1), SSS izolasyonu sırasında miyojenik soy hücrelerinin bir göstergesi olarak ITGA7'ye potansiyel bir alternatif sağlar33.

Akış sitometrisi/FACS iskelet kası 1 , 9 , 10,11 ,13,29'dakiFAP'lerin rolünü ve patojenik potansiyelini incelemek için güçlü bir metodoloji olsa da, teknik olarak gerekli reaktiflerinin özgüllüğü ve optimizasyonu ile sınırlıdır. Akış sitometrik tanımlaması ve SSP'lerin izolasyonu fare hayvan modelleri 1 , 9,10,11,29'da geliştirildiği ve yürütüldüğünden, bu diğer model organizmalarda SP'leri incelemek isteyen araştırmacılar için zorluklar doğurur. İşlenecek optimal doku büyüklüğü, reaktif ve/veya antikor özgüllüğü ve kullanılabilirliği gibi birçok faktör kullanılan türlere bağlı olarak farklılık gösterir.

Yeni bir hayvan modelinde SSS'lerin incelenmesinin önündeki teknik engellere ek olarak, genellikle kas içi kimyasal enjeksiyon veya kardiyotoksin yoluyla akut, toksik bir ortamda çalışılmıştır. FAP'lerin uzun vadeli dinamiklerinin değerlendirilmesi öncelikle Duchenne'in kas distrofisinde, mdx fare modeli9, 10,11kullanılarak ve omuz kas yapısında eşzamanlı tendon transeksiyonu ve denervasyonun yapıldığı masif rotator manşet yırtığı gibi kombinasyon kas yaralanması modelleri ile sınırlıdır26,27,28 . FAP'lerin, ağır sanayi, tarım ve doğum travmalarında (brakial pleksus yaralanması)34, 35,36,37'de önemli morbidite ile iş yeri kazalarında sık görülen kronik travmatik denervasyonun tek hakaretine yanıtı, genellikle kısa süreli bir zaman dilimi11,38ile sınırlı olarak karakterize edilmiştir.

Sıçandaki sağlıklı ve ciddi atrofik ve fibrotik iskelet kasından FAP'ları ve milletvekillerini tanımlamak ve izole etmek için bir yöntem tarif ediyoruz. İlk olarak, doku sindirimi ve akış sitometrisi boyama protokolü kullanılarak CD31-/CD45-/VCAM-1- SCAP'ler ve CD31-/CD45-/Sca-1-1+ milletvekillerinin tanımlanması ve daha sonra bulgularımızın doğrulanması, FACS izole edilmiş hücrelerin kültür ve immünositokimyasal lekeleme yoluyla gerçekleştirilir. Bu yöntemi kullanarak, sıçanda uzun süreli izole denervasyon yaralanması modelinde yeni bir FAP zaman kursu da bildiriyoruz.

Protokol

Bu protokolü yürüten müfettişler yerel hayvan etik kurulu/bakım komitesinden izin almalıdır. Tüm hayvan çalışmaları St. Michael's Hospital Unity Health Toronto Hayvan Bakım Komitesi (ACC #918) tarafından onaylandı ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi (CCAC) tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi. Akış sitometrisi iletişim kuralının şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Aşağı akış uygulaması FACS ve sonraki hücre kültürü ise, tüm adımlar uygun aseptik teknikle tamamlanmalıdır.

1. Kas hasadı

  1. Sıçanları lokal vivarium ve hayvan etik kurulu yönergelerine göre uygun bir anestezi ve fedakarlık kullanarak uyuşturmak. Bu protokol, gastrocnemius kasını örnek olarak yetişkin dişi Lewis sıçanlarından (200-250 g) toplar. Sıçanlar% 2-3 Isoflurane kullanılarak uyuşturuldu ve T61 intrakardiyak enjeksiyonu ile kurban edildi.
  2. Hayvan kurban edildikten sonra, kasın yerini kolaylaştırmak ve hasat edilen dokunun kürk kirlenmesini en aza indirmek için tüm arkalığı tıraş edin.
  3. Steril bir neşter kullanarak, ciltte iki kesi yapın: birincisi ayak bileği ekleminin çevresi etrafında ve ikincisi ayak bileğinden kalçaya kadar arkalığın medial yönünün orta çizgisinin yukarısı.
  4. Femurun medial ve lateral kondyleslarından ve Aşil Tendonu'ndaki kesici uçlardan kaynaklanan alttaki gastrocnemius'u ortaya çıkarmak için cildi ve yüzeysel kas katmanlarını soyun.
  5. Gastrocnemius'ı çevre dokudan ayırmak için künt diseksiyon kullanın, kası sadece tendon tarafından ele alarak ezilme yaralanmasını önler.
  6. Aşil Tendonunu keskin makasla mümkün olduğunca distal olarak transeksiyon ederek gastrocnemius'u yerleştirilmesinden ayırın. Kesildikten sonra, aşil tendonunu asalarla kavrayın ve gastrocnemius'ı alttaki kemikten hafifçe soyun. Hala bir elindeps ile kas tutarak, gastrocnemius'un iki kökenleri bulun ve medial ve lateral femoral kondyles kesilmiş.
  7. Eksize gastrocnemius'u mümkün olduğunca fazla kan çıkarmak için steril bir gazlı bez parçasına karşı hafifçe lekelendir. Kası steril bir yüzeyde kırpın ve aşil tendonu kadar fazla bağ dokusunu da çıkarın.
  8. Kasları bir tartım teknesine yerleştirin ve hassas bir terazi kullanarak tartın. Bu protokol, 200-600 mg arasında değişen ıslak ağırlıkla kası sindirmek için optimize edilmiştir. Operatörler, istenirse, diğer aşağı akış tahlilleri için fazla hasat edilen dokuyu alt bölümlere katabilir.
  9. Akış sitometrisi için kullanılacak hasat edilen kası 3-4 küçük parçaya (yaklaşık 1-2 cm3)hafifçe bölün ve buz gibi 1x PBS'ye batırın. Tüm numuneler hasat edilene kadar buzda soğuk tutun.

2. Kas sindirimi

  1. PBS'den kasları çıkarın ve steril 10 cm hücre kültürü kabına yerleştirin. Parçalar yaklaşık 3-4mm3 olana kadar toparlama ile dokuyu hafifçe yırtın ve kıyın, mümkün olduğunca çok bağ dokusu çıkarın. İyice kıyıldıktan sonra, 6 mL DMEM + % 1 penisilin/ streptomisiin (P/ S) içeren steril 50 mL konik tüpe aktarın.
  2. Kollajenaz enzimini etkinleştirmek için 365 μL Kollajenaz II çözeltisine (stok konsantrasyonu 4800 U/mL) 10 μL 300 mM CaCl2 çözeltisi ekleyin. Aktif kollajenaz II çözeltisini doku bulamacı içeren 50 mL konik tüpe ekleyin. Son Kollajenaz II konsantrasyonu 250 U/mL'dir.
  3. Tüpleri 37 °C, 240 x g'da1 saat boyunca bir çalkalayıcıda kuluçkalayın, tüpün yanına yapışmış herhangi bir dokuyu yerinden çıkarmak için her 15 dakikada bir manuel olarak döndürdüyün.
  4. 1 saat sonra, tüpleri çalkalayıcıdan çıkarın ve numune başına aşağıdakileri ekleyin: 100 μL Kollajenaz II (4.800 U/mL) ve 50 μL Dispaz (4,8 U/mL).
  5. Çözelti homojen olana kadar 15-20 kez serolojik pipet kullanarak pipet örnekleri. Birden fazla numune işliyorsanız, numune çapraz kontaminasyonlarını önlemek için her numune için ayrı bir steril pipet kullanın.
  6. 37 °C ve 240 x g'da 30 dakika boyunca bir çalkalayıcıda tekrar kuluçkaya yatır. 15 dakika sonra, tüp tarafındaki yapışan dokuyu yerinden çıkarmak için örnekleri elle çalkalayın.

3. Tek hücreli süspansiyon üretimi

  1. Örnekleri 10 döngü boyunca 20 G iğne ile 10 mL şırıngadan yavaşça yamum.
    NOT: Bir döngü, kas çözeltisini şırındağa almayı ve tüpe geri enjekte etmeyi içerir. Aşırı köpürme ek hücre ölümüne neden olabileceğinden, kesmeyi yavaşça tamamlayarak kabarcıkları en aza indirdiğinizden emin olun39.
  2. Steril 50 mL konik bir tüpe 40 μm hücre süzgeci yerleştirin ve 5 mL DMEM + % 10 FBS ve% 1 P / S pipetleme ile ıslatın.
  3. Pipet Hücre süzgecinden bir seferde numunenin 1 mL'si.
  4. Tüpteki toplam hacmi 25 mL'ye çıkarmak için DMEM'i %10 FBS ve %1 P/S ile süzgeçten geçirerek hücre süzgecini yıkayın.
  5. Numunenin 25 mL'lik kısmını eşit olarak iki adet 15 mL konik tüpe ve 15 °C'de santrifüje bölün, 15 dakika boyunca 400 x g.
    NOT: Kas çözeltisinin iki adet 15 mL konik tüpe bölünmesi, santrifüjlemeden sonra tek bir tüpe kıyasla daha iyi hücre iyileşmesi sağlar.
  6. Eritrositleri ortadan kaldırmak için peletin 1 mL 1x RBC Lizis tamponunda (ek dosyayabakın) 7 dakika boyunca oda sıcaklığında aspire edin ve peletin yeniden askıya alın.
  7. 9 mL yıkama tamponu (bkz. Ek Dosya)ve 400 x g,15 °C'de 15 °C'de 15 ° C'de spin tüpleri ile hacmi 10 mL'ye getirin.
  8. 1 mL yıkama tamponunda yeniden askıya alarak süpernatantı emiş ve peletleri yeniden bire katın.
  9. Uygun miktarda hücreyi ayrı bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve trippan mavi boya ile karıştırın. Hemositometre kullanarak canlı hücreleri hafif bir mikroskopta sayın.

4. Akış sitometrisi için antikor boyama

NOT: Sca-1 antikor, üreticinin talimatlarına göre akış sitometrisi/FACS deneylerinden önce APC'ye konjuge edilmelidir. Her konjuge grubu için performans doğrulanmalıdır (Şekil 2). Son konjugasyonlar -20 °C'de 20 μL aliquots içinde saklanabilir ve üç hafta boyunca stabildir. Tam konjugasyon protokolü için Tamamlayıcı Dosya'ya bakın.

  1. Akış sitometrisi için, deneysel numune başına 1-2 x10 6 hücreyi steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Yıkama tamponu ile hacmi 1 mL'ye kadar getirin ve buza yerleştirin.
  2. Her deneme için aşağıdaki gerekli kontrolleri ayarlayın: i) canlı hücre popülasyonu için doğru bir şekilde seçmek üzere onaylanmamış ve ii) uygulanabilirlik kontrolleri; iii) CD31-/CD45 kesirleri, FAP'lar ve milletvekilleri için doğru kapılar ayarlamak için tek hücreli süspansiyonlarda floresan eksi bir (FMO) kontrolleri; ve iv) kanallar arasındaki floresan dökülmesini düzeltmek için tek lekeli kompanzasyon boncukları.
    1. Tüm hücre kontrolleri için, aliquot 5 x 105 - 1 x10 6 hücreli 1 mL yıkama tamponunda 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde ve buza yerleştirin.
    2. Boncuk kontrolleri için, etiketli her 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne1 damla pozitif kompanzasyon boncuk (damla başına ~1,5 x 10 5 boncuk) ekleyin. Denetimlerin tam tamamlayıcısı Tablo 1'de listelenmiştir.
      NOT: Deney ilk kez yapılıyorsa, hücrelerdeki pozitif lekeli popülasyonu değerlendirmek ve kompanzasyon boncuklarında gözlenen lekelenmeyi doğrulamak için tek hücreli süspansiyonlarda (lekelenmemiş, uygulanabilirlik, tek lekeli kompanzasyon boncuk ve FMO kontrollerine ek olarak) her konjuge antikor için tek lekeli kontroller çalıştırın. Kompanzasyon boncukları ve tek hücreli süspansiyonlar üzerinde tek boyama yaparak her yeni eşlenmiş Sca-1::APC hazırlığını doğrulayın. Boyama denetimlerinin tam listesi için Tablo 1'e bakın.
  3. Canlılık kontrolünü hazırlamak için, hücre hacminin yarısını "uygulanabilirlik" tüpünden yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bu tüpü "Ölü" olarak etiketle.
  4. Hücreleri öldürmek için 65 °C'de "Ölü" tüpü 2-3 dakika kuluçkaya yatırın, sonra buza yerleştirin. 2-3 dakika sonra, ölü hücreleri canlılık kontrol tüpünde kalan canlı hücrelerle yeniden birleştirin. Bu hücre popülasyonu, telafi değerlerini (gerekirse) ayarlamak ve canlılık boyası için kapıları düzgün bir şekilde ayarlamak için kullanılacaktır.
  5. Tek hücreli süspansiyonları (deneysel numuneler ve kontroller) 5 dakika boyunca 500 x g, 4 °C'de santrifüj edin.
  6. 100 μL yıkama tamponunda süpernatantı aspire edin ve hücre peletlerini yeniden askıya alın.
  7. Deneysel örneğe veya kontrole bağlı olarak antikor ekleyin. Antikor kombinasyonları ve miktarları hakkında bilgi için boyama matrisine (Tablo 2)bakın.
  8. Tam karıştırma sağlamak için her numuneyi hafifçe kaydırın ve karanlıkta 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yaslayın. Telafi boncukları için, 15 dakika boyunca karanlıkta oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
  9. Tek hücreli süspansiyon deneysel ve kontrol numuneleri için, 900 μL yıkama tamponu ekleyerek hacmi 1 mL'ye getirin. Kompanzasyon boncuk kontrolleri için, 900 μL 1x PBS ile hacmi 1 mL'ye getirin.
  10. 5 dakika boyunca 500 x g,4 °C'de santrifüj tek hücreli süspansiyon örnekleri. Santrifüj kompanzasyon boncuk kontrolleri 300 x g, 4 °C 5 dakika.
  11. Tüm tek hücreli süspansiyon örnekleri için, 300 μL yıkama tamponunda süpernatantı aspire edin ve atın ve hücre peletlerini yeniden askıya alın. Kompanzasyon boncuk kontrolleri için, süpernatantı aspire edin ve atın, peleti 1x PBS'nin 300 μL'sinde yeniden askıya alın, ardından 1 damla (~1,5 x10 5)negatif kompanzasyon boncuk ekleyin.
  12. Tüm tek hücreli süspansiyon örneklerini alüminyum folyo altında buz üzerinde tutun ve simetrik alım akışına devam edin. Kompanzasyon boncuk kontrolleri de ışıktan korunmalıdır, ancak oda sıcaklığında tutulabilir.
    NOT: Deneysel uç nokta akış sitometrisine göre FAP tanımlaması ise, lütfen 5.1.1-5.1.11 adımlarını izleyin. Uç nokta kültür ve boyama için FACS aracılığıyla hücre yalıtımı ise, lütfen 5.2.1-5.2.9 ve bölüm 6-7 adımlarını izleyin.

5. Akış sitometrisi ve floresanla aktive edilmiş hücre sıralama (FACS)

  1. Akış sitometrisi
    NOT: Bu protokol, aynı anda 10 farklı rengi ayırt edebilen 405 nm, 488 nm ve 640 nm lazerlerle donatılmış bir tezgah üstü akış sitometresi istihdam eder. Bandpass filtreleri ve bu protokolde kullanılan ilişkili florokromlar aşağıdaki gibidir: 450/50 (SYTOX Blue), 530/30 (FITC), 575/25 (PE) ve 670/30 (APC). Her dedektör için voltajlar aşağıdaki gibidir: FSC 700; SSC 475; FITC 360; PE 460; PE-Cy7 600; SYTOX Mavi 360; APC 570. Kullanmadan önce akış sitometresinin veya hücre sıralayıcısının düzgün çalışması konusunda eğitildiklerinden emin olun.
    1. Sitometrenin kullanımdan önce 10-20 dakika açık olduğundan ve her biri 30-45 sn için temiz, durulama ve kılıfa sıvı çözeltileri ile sırayla temizlenerek astarlanmış olduğundan emin olun. dH2O ile durulama ile bitirin.
    2. Faps ve milletvekillerini Şekil 3 'te belirtildiği gibi tanımlamak için gating stratejisini ayarlayın.
      NOT: SSC-A vs FSC-A (hücreleri ayırmak için ileri hücre saçılma alanına karşı ileri hücre dağılım alanı vs enkaz), ii) FSC-W vs FSC-H (ileri hücre ssc-H) FSC parametresinde singlet'ları çiftlerden ayırmak için ileri hücre dağılım yüksekliğine karşı dağılım genişliği), iii) SSC-W vs SSC-H (SSC parametresinde singlet'ları çiftlerden ayırmak için yan hücre dağılım genişliğine karşı yan hücre dağılım yüksekliği), iv) SSC-A vs SYTOX Blue (canlı ile ölü singlet'ları ayırt etmek için), v) SSC-A vs CD31/45::FITC (CD31+ ve CD45+ hücrelerini daha fazla analizden dışlamak için) ve vi) Sca-1::APC vs VCAM-1::P E CD31-/CD45- (Hat; Lin-) nüfusu (SSS ve milletvekillerinin tanımlanması). SP'ler CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- olayları ve milletvekilleri CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ olayları olarak tanımlanır.
    3. İlk olarak, kanallar arasındaki floresan dökülmesini düzeltmek için kullanılan kompanzasyon değerlerini oluşturmak için her bir tek lekeli kompanzasyon boncuk kontrolünü düşük hızda sitometreden geçirin. Her kontrolün floresan sinyalini kendi dedektöründe (örneğin, Sca-1 için SSC-A vs APC::APC tek lekeli boncuklar) ve diğer tüm dedektörleri karşılaştırarak telafiyi değerlendirin. Uygun dedektörde iki farklı popülasyon (biri negatif ve biri pozitif sinyalli) ve diğer tüm dedektörlerde sadece negatif bir popülasyon olmalıdır. Durdurma kapısını 10.000 tazminat boncuk olayına ayarlayın ve verileri kaydedin.
      NOT: Her numunenin alınması arasında, numuneden numuneye kirlenmeyi önlemek için dH2O'nun sitometreden 10-20 saniye boyunca çalıştırdığından emin olun.
    4. Daha sonra, canlı tek hücrelere düzgün bir şekilde kapı vermek için lekesiz ve canlılık kontrol örneklerini işleyin. Durdurma kapısını 10.000 singlet olaya ayarlayın ve verileri kaydedin.
      NOT: Her bir hücre süspansiyon örneğinin elde edilmeden yaklaşık 5 dakika önce, lekesiz numune hariç, her numuneye 1 μL SYTOX Mavi canlılık boyası (1 mM stok çözeltisinden seyreltilmiş 300 μM çalışma konsantrasyonu) ekleyin ve karıştırmak için hafifçe hareket ettirin (son konsantrasyon 1 μM).
    5. Ardından kalan tek hücreli süspansiyon kontrol örneklerini alın. Her FDO kontrolünü gating stratejisinde uygun çizimi ile değerlendirin (Şekil 3). Örneğin, cd31+CD45 FMO'nun FITC sinyalini değerlendirerek doğru bir CD31-/CD45 kapısı sağlayın. Şekil 3G'de en uygun örnek gösterilmiştir. Protokol ilk kez gerçekleştiriliyorsa, FDO denetimleri alınmadan önce hücreler üzerinde tek lekeli denetimler çalıştırılmalıdır.
    6. Uygun telafiyi doğrulamak için her bir tek lekeli hücre örneğinin floresan sinyalini uygun dedektöründe ve diğer tüm dedektörlerde değerlendirin. Durdurma kapısını 10.000 canlı singlet olayına ayarlayın ve yazılıma kaydedin.
    7. Tüm kontroller (tek hücreli süspansiyonlar ve boncuklar) işlendikten sonra, önce her numunenin hacmini ölçerek ve kaydederek tüm deneysel örnekleri hazırlayın. Bu ölçümler, adım 5.1.11'de açıklandığı gibi, SSP'leri ve milletvekillerini doğru bir şekilde ölçmek için kullanılacaktır. Ardından, 50 μL hassas sayım boncukları ekleyin ve 2-3 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hafifçe karıştırın.
    8. Sayım boncuk popülasyonunun tanımlanmasını doğrulamak için ilk deneysel örneği kısaca çalıştırın. Bu popülasyon, FSC-A vs SSC-A çiziminde(Şekil 3A, kırmızı kutu) genel hücre popülasyonundan ayrı küçük bir ayrı küme olarak görünür. Sayım boncuk popülasyonu etrafında bir kapı oluşturun. Daha sonra düşük hızda sitometreden işleyerek her deneysel örnek için veri elde edin. Durdurma kapısını 10.000 boncuk olayı ve kayıt olarak ayarlayın.
      NOT: Araştırmacılar alternatif olarak, sayım boncukları tüm dedektörlerde floresan olduğundan, SSC-A'yı dedektörlerden herhangi birine karşı değerlendiren ek bir arsa kurarak sayım boncuklarını tanımlayabilirler.
    9. Tüm numuneler işlendikten sonra, uygun protokolleri kullanarak sitometreyi temizleyin. Analiz için tüm verileri dışarı aktar.
    10. Tüm veri dosyalarını uygun bir akış sitometri analiz yazılımında açın. Gating stratejisini, adım 5.1.2'de açıklandığı gibi veri toplama için kullanıldığı şekilde ayarlayın. Gating stratejisini yeniden doğrulamak için denetimleri veri toplamadakiyle (örneğin, lekesiz, uygulanabilirlik, tek leke, ardından FMO denetimleri) aynı sırada inceleyin. FDO kontrolleri kullanılarak doğru kapılar ayarlandıktan sonra, kapıları tüm deneysel örneklere uygulayın. Ham verileri nicelleştirme için elektronik tablo olarak dışa aktarma.
    11. Sayım boncuklarını kullanarak her deneysel örnekteki SSS ve milletvekili sayısını hesaplayın:
      figure-protocol-15971
      burada, Edinilmiş Hücre Sayısı, satın alma yazılımında ilgili hücre popülasyonunun (örneğin, SSP'ler veya milletvekilleri) kaydedilen olay sayısıdır; Edinilen Boncuk Sayısı, satın alma yazılımında boncuk sayma kaydedilmiş olayların sayısıdır; Boncukların Sayısı Birimi, adım 5.1.7'de eklenen sayım boncuk çözeltisinin hacmidir; Örnek Hacim, sayım boncuklarının eklenmesinden önce her lekeli deneysel numunenin hacmidir.; Boncuk Konsantrasyonu, μL çözeltisi başına boncuk sayısıdır; bu değer ürün veri sayfası üzerinde bulunur.
  2. FACS - hücre kültürü için sıralama
    NOT: Bu protokol, aynı anda 11-14 rengi ayırt edebilen 4 lazer (UV, Menekşe, Mavi, Kırmızı) ile donatılmış bir hücre sıralayıcısı üzerinde FACS gerçekleştirir. FACS iş akışını optimize etmek için aşağıda tanımlanmış 1 ile 3 arası adımlar dışında deneysel örnek boyama (bölüm 4) ve akış sitometrisi protokolünü izleyin:
    1. FAP'ların ve milletvekillerinin sağlam verimlerini oluşturmak için 7 x 106 hücre/mL'ye sıralanacak deneysel numunelerdeki hücrelerin konsantrasyonu artırın.
    2. Hücre konsantrasyonundaki bu önemli artışı hesaba katmak için, sıralanacak deneysel örneklerdeki tüm antikor konsantrasyonlarını iki katına çıkarın.
    3. Hücre topaklanmasını azaltmak ve sıralama verimini artırmak için sıralamadan hemen önce 5 mL polistiren tüpe yapıştırılmış 40 μM hücre süzgeç kapağından son lekeli hücre örneklerini işleyin.
    4. Tek, canlı sıçan FAP'larını ve milletvekillerini doğrudan hücre sıralayıcısından 1 mL steril, %100 Fetal Sığır Serumu (FBS) içeren 5 mL polipropilen toplama tüpüne toplayın. Sıralama tamamlanana kadar hücreleri buzda tutun.
      NOT: FACS'leri saha dışında bir yerde yapıyorsanız, sıralanmış tüm hücreleri buz üzerinde ve güvenli, kapalı bir kapta aktarın.
    5. Steril bir biyogüvenlik kabininde (BSC) çalışarak, uygun büyüme ortamı (örneğin, sıralanmış FAP'lar için FAP büyüme ortamı (FAP GM) ve sıralanmış milletvekilleri için MP büyüme ortamı (MP GM) ile 7 mL'ye kadar sıralanmış hücrelerin hacmini getirin; tarifler için Ek Dosya'ya bakın) ve mümkün olduğunca fazla artık yıkama tamponu çıkarmak için 500 x g, 4 ° C'de santrifüj.
    6. Peletleri 1 mL uygun büyüme ortamına ve plakaya steril, kollajen kaplı 12 mm cam kapaklı/ kuyu içeren 12 kuyulu bir plakaya yeniden koyun (bkz. bölüm 6).
      NOT: Kollajen için immünositot entrika lekeleme ise, plaka hücreleri kollajen kaplı yerine steril, laminin kaplı 12 mm cam kapaklı / kuyu içeren 12 kuyu plakasına sıraladı. Hemen izole edilmiş progenitörlerin immünositör deneyleri gerekiyorsa, cm2 başına 15.000 hücre yoğunluğunda tohum SSS'leri ve milletvekilleri ve doğrudan 6.1 adımına geçin. Uzun vadeli kültürlerin progenitör farklılaşmasına neden olduğu için, cm2başına 5.000 hücre yoğunluğunda tohum SSS'leri ve cm başına 7.500 hücre yoğunluğunda milletvekilleri2.
    7. Hücre kültürü inkübatöründe 37 °C ve%5 CO 2'de hücreleri kuluçkaya yatır. Kültürde 72 saat sonra, medyanın yarısını değiştirin. Her 2-4 d'dan sonra medyayı tamamen değiştirin.
    8. Miyosit gelişimini teşvik etmek için, milletvekilleri kültürlerini kültürün 9. Adipozitleri teşvik etmek için, kültürün 10.
    9. Fibrogenez indük etmek için, FAP'ler kültür sırasında değişken zamanlarda fibrojenik farklılaşma (FD) ortamına geçebilir veya alternatif olarak, yalıtımdan sonra doğrudan FD ortamına tohumlanabilir (adım 5.2.6) (Tüm medya tarifleri için Ek Dosya'ya bakın).

6. Kültürlü SSS ve milletvekillerinin immünosikokimyası

  1. Hücre sıralamasını doğrulamak ve SSP'lerin ve milletvekilleri kültürlerinin saflığını göstermek için PDGFRα (FAP belirteç), Pax-7 (kas sapı [uydu] hücre işaretçisi), Fibroblast'a özgü protein (FSP-1, fibroblast belirteci), Perilipin-1 (Plin-1, adiposit belirteci), Kollajen tip 1 (Col1a1, fibrozis göstergesi), Miyosin Ağır Zinciri (MHC, olgun miyosit belirteci).
    1. Yeni sıralanmış hücrelerin immünostaining için, hücrelerin kapak kılıfı / kuyuya yapışmasını kolaylaştırmak için oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 200 x g'da 12 kuyu plakasını santrifüj edin. Bu adım uzun vadeli kültürler için gerekli değildir. Kültür medyasını kaldırın.
    2. FSP-1 ile immünostaining için, 4 °C'de 2 dakika boyunca 1 mL% 100 metanol (MeOH) ile hücreleri sabitle. PDGFRα, Plin-1, Pax7 veya Col1a1 için immünostaining ise, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 1x PBS'de 1 mL% 4 PFA ile hücre kültürlerini düzeltin. MHC immünostaining her iki fiksatif tolere eder.
      NOT: Metanol sabitli hücreler için, 6.2 adımlarını atlayın ve 6.3.
  2. %4 PFA'yı epire edin ve hücre kültürlerini 1x PBS ile 3-4 kez hızla yıkayın. 1x PBS'de 1 mL 100 mM Glisin ekleyin ve artık PFA'yı devre dışı bırakmak için oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. 1x PBS ile 1-2 kez aspire edin ve yıkayın.
    NOT: Hücreler bu aşamada 2 mL 1x PBS'de bırakılabilir, streç filme sarılabilir ve maksimum 7-10 gün boyunca 4 °C'de saklanabilir.
  3. Yıkadıktan sonra, 1x PBS'de% 0.1 Triton-X'in 1 mL'sini ekleyin ve hücre zarlarını permeabilize etmek için 20 dakika kuluçkaya yatırın.
  4. Kuyuları 1x PBS'nin 1-2 mL'si ile 2-3 kez yıkayın, ardından oda sıcaklığında 1 saat boyunca kuyu başına 1 mL 1x PBS +% 3 BSA ile hücreleri engelleyin.
  5. Pipet 80 μL primer antikor 1x PBS + %3 BSA (PDGFRα 1:100, Pax7 temiz, FSP-1 1:50, Plin-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 μg/mL) mobil konteynere bantlanmış bir parafilm parçasına. Steril ince forseps kullanarak, kapak sapını dikkatlice kuyudan kaldırın ve antikor çözeltisinin damlasına ters çevirin. Antikor çözeltisinin buharlaşmasını önlemek için kapak kapağını iki ıslak kağıt havlu ve kapak kabı ile plastik film içinde kuluçkalayın. 4 °C'de gece boyunca kuluçkaya yaslanın.
    NOT: Kuyunun içindeki lekeleme kapakları, kuyunun içindeki lekelemeden daha az antikor (~80 μL) kullanır (minimum 500 μL).
  6. 2. günde, kapakları ısınmak için oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. Forsepsleri dikkatlice doğru kullanmak ve kapakları kendi kuyularına (yukarı bakan hücreler) geri aktarın ve mümkün olduğunca fazla birincil antikoru çıkarmak için her biri 2 dakika boyunca 1-2 mL 1x PBS ile 2-3 kez yıkayın.
  7. Birincil antikor boyama ile aynı boyama tekniğini kullanarak, MHC veya Pax-7'yi tespit etmek için FSP-1, Plin-1, Col1a1 veya PDGFRα ve keçi anti-fare Alexa Fluor 555 ikincil antikoru (1:300) tespit etmek için keçi anti-tavşan Alexa Fluor 488 ikincil antikor (1:400) ile leke hücreleri. Hücreleri oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın ve hücreleri ışıktan koruyun.
  8. Hücreleri kuyuya geri döndürün ve oda sıcaklığında 2-4 dakika boyunca Hoechst (1:10.000) ile hücreleri kuluçkaya yatırın. Fazla Hoechst'i çıkarmak için her biri 2 dakika boyunca 1x PBS ile hücreleri 2-3 kez daha yıkayın.
  9. Kapakları solmaya karşı floresan montaj ortamı kullanarak cam slaytlara monte edin ve slaytları oda sıcaklığında karanlıkta bir gecede kurumaya bırakın. Monte edilmiş kapakları karanlıkta 4 °C'de saklayın.

7. Kültürlü FAP'ların ve milletvekillerinin Yağ Kırmızısı O (ORO) lekesi

  1. Hücre zarının permeabilizasyonu adipojenik olmayan hücre tiplerinin spesifik olmayan/istenmeyen lekelenmesine neden olabileceğinden, permeabilize olmayan hücreler üzerinde ORO boyama gerçekleştirin. Boyamaya başlamadan önce, bir ORO çalışma stoğu hazırlayın (tarif için Ek Dosyaya Bakın) ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın.
  2. 20 dakika sonra, çözülmemiş agregaları çıkarmak için çözeltiyi 0,2 μm filtre kullanarak filtreleyin.
  3. Medyayı iyiden epire edin ve %10 Nötr Arabelleğe Alınmış Formalin'in (%10 NBF) 1 mL'sini ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatır.
    NOT: Hücre konflüjisi kuyudan/kapaklardan kaldırılmasına neden olabilir. Çözümleri aspirasyon yaparken/eklerken dikkatli olun.
  4. 1 mL taze %10 NBF'yi epire edin ve ekleyin ve oda sıcaklığında en az 1 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: Hücreler bir gecede %10 NBF'de bırakılabildiği için protokol bu noktada durdurulabilir.
  5. Kuyuları bir kez 1 mL% 60 izopropanol ile yıkayın, ardından aspire edin ve kuyuların tamamen kurumasını bekleyin (yaklaşık 2 dk).
  6. Kuyu başına 400 μL Yağ Kırmızı O çalışma stoğu ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırarak plakanın duvarlarında herhangi bir ORO borulamayı önlediğinizden emin olun.
  7. Tüm Oil Red O'nun tamamını çıkarın ve kuyuyu dH 2 O ile4kez hızlı bir şekilde yıkayın.
    NOT: Lekeli kuyular kapak kılıfı içeriyorsa, adım 6.9'da açıklandığı gibi aynı tekniği kullanarak monte edin.
  8. Görüntü ya monte kapaklar ya da parlak alan mikroskobu kullanarak lekeli kuyu.

8. Kontralateral ve denervated sıçan gastrocnemius bölümlerinin doku lekesi

  1. Picrosirius Kırmızı (PSR)
    1. Daha önceaçıklandığıgibi 5 μm kalınlığında, formalin sabit parafin gömülü (FFPE) sıçan gastrocnemius histolojik bölümlerde PSR boyama gerçekleştirin.
  2. Yağ Kırmızı O (ORO)
    1. 5 μm kalınlığında izopentan donmuş sıçan gastroknemius histolojik bölümlerini 10 dakika boyunca% 4 PFA'da sabitleyin, 1 dakika boyunca% 60 izopropil alkolde kuluçkaya yatır.
    2. 12 dakika boyunca ORO çalışma stoğu ile leke. % 60 izopropil alkolde 1 dakika kuluçkaya yaslanın, dH2O'da 10 dakika yıkayın.
  3. Sca-1 ve laminin doku floresan immünhistokimya (IHC)
    1. 5 μm kalınlığında izopentan donmuş sıçan gastroknemius histolojik kesitlerinde floresan IHC gerçekleştirin.
    2. Örnekleri 1x PBS'de 5 dakika boyunca nemlendirin, 10 dakika boyunca% 4 PFA'da sabitlenin, ardından 90 dakika boyunca doku IF blokaj çözeltisinde örnekleri kuluçkaya yatırın (ek dosyayabakın).
    3. Bir gecede 4 °C'de 1x PBS + %0,05 Ara ile seyreltilmiş anti-Sca-1 primer antikor (1:500) ile kuluçkaya yaslanın.
    4. 2. Günde, her biri 5 dakika boyunca 1x PBS +% 0.05 Ara üç kez yıkayın, ardından keçi anti-tavşan Alexa Fluor 555'te (1:500) 1 saat kuluçkaya yatırın.
    5. Tekrar yıkayın (daha önce olduğu gibi), 1 saat boyunca blokaj çözeltisi ile kuluçkaya yatın, ardından 1x PBS + 0.05% Ara 1 saat boyunca seyreltilmiş anti-laminin primer antikoru (1:500) ekleyin.
    6. Tekrar yıkayın (daha önce olduğu gibi), daha sonra keçi anti-tavşan Alexa Fluor 488'de (1:500) 1 saat (laminin için) kuluçkaya yatın.
    7. Tekrar yıkayın (daha önce olduğu gibi) ardından 4 dakika boyunca DAPI'da (1:10.000) kuluçkaya yatırın. Solmaya karşı montaj ortamı kullanarak kapak örtülerini yıkayın ve monte edin.

Sonuçlar

Sca-1 ve VCAM-1 dahil olmak üzere yeni bir antikor paneli kullanarak akış sitometrisi yoluyla FAP'ları ve milletvekillerini tanımlama
Sıçan kasındaKI FAP'ları tanımlamak için gating stratejisi, CD31 (endotel) ve CD45 (hematopoetik) pozitif hücrelere (soy [Lin] olarak adlandırılan) kapı olan fare29'dakiakış sitometri protokollerine dayanır ve Sca-1 ve milletvekillerinin linage-negatif (Lin-) popülasyonundan I...

Tartışmalar

Sıçan kası için optimize edilmiş, onaylanmış bir SSS izolasyon protokolü, biyolojik veya teknik nedenlerle farede mümkün olmayan yaralanma modellerini incelemek isteyen araştırmacılar için gereklidir. Örneğin, fareler kronik lokal veya uzun süreli denervasyon gibi nörodejeneratif yaralanmaları incelemek için en uygun hayvan modeli değildir. Biyolojik olarak, farelerin kısa ömrü ve hızlı yaşlanması, yaşlanmanın şaşırtıcı faktöründen denervasyon nedeniyle kas sequalae'yi doğru bir şek...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir ihtilafı yoktur.

Teşekkürler

Ottawa Üniversitesi'ndeki Flow sitotmetri Çekirdek Tesisleri'ne ve Keenan Biyomedikal Bilimler Araştırma Merkezi (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto'ya bu yazıda sunulan akış sitometrisi/FACS protokolünün optimizasyonundaki uzmanlıkları ve rehberliği için teşekkür ederiz. Bu çalışma Medicine tarafından Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) tarafından JB'ye finanse edildi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL Polypropylene Round-Bottom TubeFalcon352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer CapFalcon352235
10 cm cell culture dishesSarstedt83.3902
12-well cell culture plateThermoFisher130185
12 mm glass coverslips, No.2VWR89015-724
10 mL SyringeBeckton Dickenson302995
15 mL centrifuge tubesFroggaBio91014
20 gauge needleBeckton Dickenson305176
25mL Serological pipetteSarstedt86.1685.001
40µm cell strainerFisher Scientific22363547
50mL centrifuge tubesFroggaBioTB50
AbC Total Antibody Compensation Beads ThermoFisherA10497
Ammonium Chloride, Reagent GradeBioshopAMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µgBiotium92307
Aquatex Aqueous Mounting MediumMerck108562
Biolaminin 411 LNBiolaminaLN411
Bovine Serum Albumin (BSA)BioshopALB001
Calcium ChlorideBioshopCCL444.500
Collagenase Type IIGibco17101015
CountBright Plus Absolute Counting BeadsThermoFisherC36995
DexamethasoneMillipore SigmaD4902
DispaseGibco17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Gibco11995-065(+)4.5 g/L D-Glucose
(+)L-Glutamine
(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTAFisherScientificS311
FACSClean SolutionBeckton Dickenson340345
FACSDiva SoftwareBeckton Dickenson--
FACSRinse SolutionBeckton Dickenson340346
Fetal Bovine SerumSigmaF1051
Flow Cytometry Sheath FluidBeckton Dickenson342003
FlowJo SoftwareBeckton Dickenson--
Fluorescent Mounting MediumDakoS302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibodyInvitrogenA21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibodyInvitrogenA11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibodyInvitrogenA21429
Goat SerumGibco16210-064
Ham's F10 MediaThermoFisher 11550043(+) Phenol Red
(+) L-Glutamine
(-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)Multicell311-513-CL
Heat Inactivated Horse SerumGibco26050-088
HemocytometerReichertN/A
HEPES, minimum 99.5% titrationSigmaH3375
Horse SerumThermoFisher16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1)Cell Signaling8915LF
Humulin RLillyHI0210
IBMXMillipore SigmaI5879Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
IsopropanolSigmaI9516Also known as 2-propanol
Lewis Rat, FemaleCharles River Kingston004 (Strain Code)200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop CytometerBeckton Dickenson--
MicrocentrifugeEppendorfEP-5417R
MoFlo XDP Cell SorterBeckman Coulter--
Mouse Anti-CD31::FITC AntibodyAbcamab33858Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC AntibodyBiolegend202205Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE AntibodyBiolegend200403Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/AAlso known as MF20
Mouse Anti-Pax7 AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 %SigmaHT501128
Oil Red OMillipore SigmaO0625
PE-Cy7 Conjugation KitAbcamab102903
Penicillin-StreptomycinSigma P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)Gibco10010-023(-)Calcium Chloride
(-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent GradeBioshopPBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) AntibodyInvitrogenMA5-32347FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 AntibodyAbcamab203254
Rabbit Anti-Laminin AntibodySigmaL9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 AntibodyAbcamab3526
Rabbit Anti-Sca-1 AntibodyMillipore SigmaAB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I AntibodyAbcamab260043Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha AntibodyAbcamab203491
Recombinant Human FGF-basicGibcoPHG0266
Sodium AzideSigmaS2002
Triton-X-100Fisher ScientificBP151
TroglitazoneMillipore SigmaT2573
Tween-20BioshopTWN510

Referanslar

  1. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12, 153-163 (2010).
  2. Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
  3. Uezumi, A., Ikemoto-Uezumi, M., Tsuchida, K. Roles of nonmyogenic mesenchymal progenitors in pathogenesis and regeneration of skeletal muscle. Frontiers in Physiology. 5, 1-11 (2014).
  4. Biswas, A. A., Goldhamer, D. J. FACS fractionation and differentiation of skeletal-muscle resident multipotent Tie2+ progenitors. Methods in Molecular Biology. 1460, 255-267 (2016).
  5. Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1-10 (2019).
  6. Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46 (2), 135-143 (2018).
  7. Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
  8. Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. Journal of Cell Science. 124 (21), 3654-3664 (2011).
  9. Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
  10. Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  11. Madaro, L., et al. Denervation-activated STAT3-IL-6 signalling in fibro-adipogenic progenitors promotes myofibres atrophy and fibrosis. Nature Cell Biology. 20 (8), 917-927 (2018).
  12. Heredia, J. E., et al. Type 2 innate signals stimulate fibro/adipogenic progenitors to facilitate muscle regeneration. Cell. 153 (2), 376-388 (2013).
  13. Fiore, D., et al. Pharmacological blockage of fibro/adipogenic progenitor expansion and suppression of regenerative fibrogenesis is associated with impaired skeletal muscle regeneration. Stem Cell Research. 17 (1), 161-169 (2016).
  14. Kang, X., et al. Interleukin-15 facilitates muscle regeneration through modulation of fibro/adipogenic progenitors. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 1-11 (2018).
  15. Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., Mcmillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e2782 (2011).
  16. Iyer, S. R., Valencia, A. P., Hernández-Ochoa, E. O., Lovering, R. M. In vivo assessment of muscle contractility in animal studies. Methods in Molecular Biology. 1460, 293-307 (2016).
  17. Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487 (2016).
  18. Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50183 (2013).
  19. Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. (71), e50036 (2013).
  20. Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696 (2019).
  21. Iohom, G., et al. Long-term evaluation of motor function following intraneural injection of ropivacaine using walking track analysis in rats. British Journal of Anaesthesia. 94 (4), 524-529 (2005).
  22. Brown, C. J., et al. Self-evaluation of walking-track measurement using a sciatic function index. Microsurgery. 10 (3), 226-235 (1989).
  23. Bozkurt, A., et al. CatWalk gait analysis in assessment of functional recovery after sciatic nerve injury. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 91-98 (2008).
  24. Deumens, R., Jaken, R. J. P., Marcus, M. A. E., Joosten, E. A. J. The CatWalk gait analysis in assessment of both dynamic and static gait changes after adult rat sciatic nerve resection. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 120-130 (2007).
  25. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 2018, 1-11 (2018).
  26. Jensen, A. R., et al. Neer Award 2018: Platelet-derived growth factor receptor α co-expression typifies a subset of platelet-derived growth factor receptor β-positive progenitor cells that contribute to fatty degeneration and fibrosis of the murine rotator cuff. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 27 (7), 1149-1161 (2018).
  27. Mosich, G. M., et al. Non-fibro-adipogenic pericytes from human embryonic stem cells attenuate degeneration of the chronically injured mouse muscle. JCI Insight. 4 (24), (2019).
  28. Lee, D., et al. HMGB2 is a novel adipogenic factor that regulates ectopic fat infiltration in skeletal muscles. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  29. Low, M., Eisner, C., Rossi, F. Fibro/Adipogenic Progenitors (FAPs): Isolation by FACS and Culture. Muscle Stem Cells: Methods and Protocols. , 179-189 (2017).
  30. Giuliani, G., et al. SCA-1 micro-heterogeneity in the fate decision of dystrophic fibro/adipogenic progenitors. Cell Death and Disease. 12 (1), 1-24 (2021).
  31. Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
  32. Upadhyay, G. Emerging role of lymphocyte antigen-6 family of genes in cancer and immune cells. Frontiers in Immunology. 10, 819 (2019).
  33. Boscolo Sesillo, F., Wong, M., Cortez, A., Alperin, M. Isolation of muscle stem cells from rat skeletal muscles. Stem Cell Research. 43, 101684 (2020).
  34. Ciaramitaro, P., et al. Traumatic peripheral nerve injuries: Epidemiological findings, neuropathic pain and quality of life in 158 patients. Journal of the Peripheral Nervous System. 15 (2), 120-127 (2010).
  35. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of upper and lower extremity peripheral nerve injuries in a population of patients with multiple injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45 (1), (1998).
  36. Malik, S. Traumatic peripheral neuropraxias in neonates: A case series. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (10), 10-12 (2014).
  37. Smith, B. W., Daunter, A. K., Yang, L. J. S., Wilson, T. J. An update on the management of neonatal brachial plexus palsy-replacing old paradigms a review. JAMA Pediatrics. 172 (6), 585-591 (2018).
  38. Rebolledo, D. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle fibrosis is mediated by CTGF/CCN2 independently of TGF-β. Matrix Biology. 82, 20-37 (2019).
  39. Walls, P. L. L., McRae, O., Natarajan, V., Johnson, C., Antoniou, C., Bird, J. C. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  40. Yuen, D. A., et al. Culture-modified bone marrow cells attenuate cardiac and renal injury in a chronic kidney disease rat model via a novel antifibrotic mechanism. PLOS One. 5 (3), 9543 (2010).
  41. Fukada, S. I. The roles of muscle stem cells in muscle injury, atrophy and hypertrophy. Journal of Biochemistry. 163 (5), 353-358 (2018).
  42. Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 1-11 (2017).
  43. Chapman, M. A., Mukund, K., Subramaniam, S., Brenner, D., Lieber, R. L. Three distinct cell populations express extracellular matrix proteins and increase in number during skeletal muscle fibrosis. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 312 (2), 131-143 (2016).
  44. Hillege, M., Galli Caro, R., Offringa, C., de Wit, G., Jaspers, R., Hoogaars, W. TGF-β regulates Collagen Type I expression in myoblasts and myotubes via transient Ctgf and Fgf-2 Expression. Cells. 9 (2), 375 (2020).
  45. Kafadar, K. A., Yi, L., Ahmad, Y., So, L., Rossi, F., Pavlath, G. K. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
  46. Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50657 (2013).
  47. Carlson, B. M. The biology of long-term denervated skeletal muscle. European Journal of Translational Myology. 24 (1), (2014).
  48. Kennedy, E., et al. Embryonic rat vascular smooth muscle cells revisited - A model for neonatal, neointimal SMC or differentiated vascular stem cells. Vascular Cell. 6 (1), 1-13 (2014).
  49. Pannérec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development (Cambridge). 140 (14), 2879-2891 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 172mezenkimal progenit rlerfibro adipojenik progenit rlermiyojenik progenit rlerak sitometrisifloresanla aktive h cre s ralamaFACSiskelet kaskronik travmatik denervasyons ankas atrofisifibrozis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır