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요약

이 프로토콜은 쥐 골격 근에서 섬유-선화 선조 (FAP) 및 근생 선조 (의원)를 격리하는 방법을 설명합니다. 근육 상해 모형에 있는 쥐의 활용은 분석을 위한 위축근에서 증가한 조직 가용성및 자유로운 움직이는 동물에 있는 근육 강도 및 걸음걸이를 평가하기 위하여 검증된 방법의 더 큰 레퍼토리를 제공합니다.

초록

섬유-adipogenic 전조자 (FAP) 골격 근육에 거주 성 간질 세포, myogenic 전조와 함께 (의원), 근육 항상성에 중요 한 역할을, 부상, 그리고 수리. FAP 식별 및 절연 사용에 대한 현재 프로토콜은 혈류 세포측정제/형광 활성화 세포 분류(FACS) 및 현재까지 생체내에서 의 기능을 평가하는 연구가 마우스에서만 수행되고 있다. 쥐의 더 큰 내재 크기는 골격 근육 부상 모델, 특히 가혹하게 위축성 근육또는 조사관이 여러 다운스트림 분석을 수행하기 위해 상당한 조직 질량을 필요로 할 때 FAP의 보다 포괄적 인 분석을 할 수 있습니다. 쥐는 또한 동물 진정 또는 희생을 필요로하지 않는 근육 기능적 인 연구의 더 큰 선택을 제공하므로 직렬 평가를 가능하게하여 이환율과 동물 사용을 최소화합니다. 마우스에 최적화된 유동 세포종/FACS 프로토콜은 종특이적이며, 특히 시판되는 항체의 특성에 의해 제한됩니다. 그(것)들은 쥐 또는 높게 섬유질 근육에서 FAP를 분리하기 위해 최적화되지 않았습니다. 표면 마커 CD31, CD45, Sca-1 및 VCAM-1의 차동 발현에 의존하여 건강하고 기질이 강한 쥐 골격 근육에서 FAP 및 MP의 식별 및 격리를 위한 유동 세포계/FACS 프로토콜이 개발되었다. 쥐 특이적, 유동 세포측정-검증된 1차 항체는 심각하게 제한되고, Sca-1을 표적으로 하는 항체의 사내 융합이 수행되었다. 이 프로토콜을 사용하여 성공적인 Sca-1 연상이 확인되었으며, FAP와 의원의 흐름 세포 식별은 FACS 격리 FAP 및 의원의 세포 배양 및 면역 스테인링에 의해 검증되었습니다. 마지막으로, 우리는 장기간 (14 주) 쥐 기종 모델에서 새로운 FAP 시간 과정을보고합니다. 이 방법은 조사자에게 새로운 동물 모델에서 FAP를 연구할 수 있는 기능을 제공합니다.

서문

섬유-adipogenic 전구 세포 (FAP)는 근육 항상성, 수리 및 재생에 중요한 역할을 하는 골격 근육에 거주하는 다능성 전구 세포의 인구이며, 반대로 근육 손상에 대한 병리학적 반응을 중재합니다. 이름에서 알 수 있듯이, FAP는 원래 섬유 아세포와 지방 세포1로 분화 할 수있는 잠재력을 가진 선조 인구로 확인되었으며 만성 상해 및 질병에 있는 골격 근육의 섬유 지방 침투의 핵심 중재자로 사칭되었습니다. 추가 연구 결과는 FAP가 골발생및 연골발생2,3,4의추가능력이 있다는 것을 밝혔다. 따라서, 그들은 더 광범위하게 중간 엽 또는 기질 선조로 문학에서 통보3,5,6,7,8. 급성 골격 근육 부상에서, FAP는 일시적으로 활성화 된 근육 위성 세포와 그들의 다운스트림 심근 선조 (의원)에 대한 유리한 환경을 제공하기 위해 일시적으로 증식하여 재생 근신생에 간접적으로 원조1,9,10. 성공적인 재생과 병행하여 FAP는 자멸을 겪으며 숫자를 기준 수준1,9,10,11로되돌린다. 대조적으로, 만성 근육 상해에서, FAP는 그들의 지속성9,10,11 및 이상한 근육 복구 결과 프로 세포 신호를 재정의합니다.

FAP가 근육 반응을 중재하는 세포 및 분자 메커니즘을 평가하는 생체 내 연구에서 현재까지뮤뇨 동물모델을1,7,9,10,11,12, 13,14로활용하였다. 유전자 조작 된 마우스는 이러한 분석에 사용하기위한 강력한 도구이지만, 동물의 작은 크기는 근육 위축이 외상성 기형과 같은 심오할 수있는 장기 국화 부상 모델에서 연구를위한 조직 가용성을 제한합니다. 더욱이, 근육강도 및 신체 기능의 측정은 마우스의 종료를 필요로 하는 전 생체 내 또는 시투 측정, 또는 수술 및/또는 전신 마취가 필요한 생체 내 측정을 필요로 하여 근육 수축 성능15,16,17,18,19,20의 평가를 허용해야합니다. . 쥐에서, 잘 검증되고 세계적으로 활용된 근육 기능 분석, 걸음걸이 분석(예를 들어, 상시 기능 지수, CatWalk 분석)과 같은 보다 복잡한 모터 행동에 대한 분석이 존재하며, 깨어 있고 자발적으로 움직이는 동물21,22,23,24에서 수행된다. . 이것은 또한 동물 실험에 있는 최소한의 이환율의 원리및 사용된 연구 동물의 수를 낙관합니다. 따라서 쥐는 FAP 조사관에게 단백질 및 세포 분석을 위한 더 큰 부상된 근육 부피의 추가된 융통성과 경보 동물에서 근육 복잡한 정적 및 동적 기능 활동 및 행동의 연쇄 평가를 착수하는 기능을 제공합니다.

FAP는 주로 유동 세포측정및 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 전체 근육 샘플에서 각각 확인되고 격리되었습니다. 이들은 크기, 세분성 및 세포 표면 또는 세포 내마커(25)의특정 조합과 같은 특징적인 특징에 기초하여 다중 특정 세포 집단을 식별할 수 있는 레이저 기반 의 소세이다. 이것은 항상성 및 재생이 세포 모형의 과다에 의해 조정된 다자간 프로세스이기 때문에, 골격 근육과 같은 기관 시스템의 연구 결과에서 매우 유리합니다. 정액 연구는 마우스 골격 근육 1에서 유동 세포 측정 방법을 사용하여 FAP뿐만 아니라 의원을확인했습니다. 그(것)들은 내피성 (CD31), 조혈 (CD45), 또는 근생성 (Integrin-α7 [ITGA7]) 기원에서 세포에 특정표면 항원이 부족하기 때문에 FAP는 본질적으로 중간엽이다는 것을 보여주었습니다, 그러나 중간엽 줄기 세포 마커 Sca-1 (줄기 세포 항원 1분화)와섬유질1의 자궁근증 세포 마커Sca-1을 표현했습니다. 다른 연구는 대체 줄기 세포 마커의 발현에 기초하여 근육에서 중간엽 전두체의 성공적인 절연을 입증, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파 (PDGFRα)2,7,8 및 추가 분석은 FAPs와 동일한 세포 집단이 될 가능성이 있음을 밝혀3. FAP는 이제 일반적으로 양성 선택 마커1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31로 Sca-1 또는 PDGFRα를 사용하여 유량 세포측정에서확인된다. . PDGFRα의 사용은 인간 조직에 우선적이지만, 뮤린 스카-1의 직접적인 인간 호모로그로 아직 확인되지 않은32. 또한, 다른 세포 표면 단백질은 FAP격리(33)에서근생 계보의 세포 지표로서 ITGA7에 대한 잠재적 대안을 제공하는 MP(예를 들어, VCAM-1)의 마커로서 보고되었다.

유동 세포측정법/FACS는 골격 근육1,9,10,11,13,29에서FAP의 역할 및 병원성 잠재력을 연구하기 위한 강력한 방법론이지만, 필요한 시약의 특이성 및 최적화에 의해 기술적으로 제한됩니다. FAP의 흐름 세포 식별 및 격리가 마우스 동물 모델1, 9,10,11,29에서개발 및 수행되었기 때문에 다른 모델 유기체에서 FAP를 연구하고자하는 연구자에게 도전이 제기됩니다. 처리될 최적의 조직 크기, 시약 및/또는 항체 특이성 및 가용성과 같은 많은 요인은 사용되는 종에 따라 다릅니다.

새로운 동물 모델에서 FAP를 연구하는 기술적 장벽 외에도, 그들은 주로 급성에서 연구되었습니다, 독성 설정 - 일반적으로 근육 화학 주입 또는 심장 독소를 통해. FAP의 장기 역학평가는 주로 듀첸의 근이영양증 에 대한 평가에 국한되어 있으며, mdx 마우스 모델9,10,11,및 동시 힘줄 트란과 기질이 어깨 근육26,27, 28, 28에서 동시 힘줄 과 기립이 수행되는 대규모 회전근 파열과 같은 조합 근육 부상의 모델 . 만성 외상성 기형의 단독 모욕에 대한 FAP의 반응, 중공업, 농업 및 출생 외상 (brachial 신경총 상해)에서 발생하는 일반적인 발생 (brachial 신경총 상해)34,35,36,37이 중요한 이환율을 가진, 종종 단기 시간 프레임11,38로제한되는 특성화되지 않았습니다.

우리는 쥐에 있는 가혹한 위축및 섬유성 골격 근뿐만 아니라 건강에서 FAP와 의원을 확인하고 격리하는 방법을 기술합니다. 첫째, 조직 소화 및 유동 세포체 염색 프로토콜을 사용하여 CD31/CD45-1+/VCAM-1-FAP 및 CD31/CD45-1-/VCAM-1+ MP의 식별이 입증되고, 분리된 세포의 배양 및 면역세포 화학적 얼룩을 통해 당사의 연구 결과의 후속 검증이 수행된다. 이 방법을 사용하여, 우리는 또한 쥐에 있는 장기 고립된 기질 상해 모형에 있는 새로운 FAP 시간 과정을 보고합니다.

프로토콜

이 프로토콜을 수행하는 조사관은 지역 동물 윤리 위원회 /관리 위원회의 허가를 받아야합니다. 모든 동물 작업은 세인트 마이클의 병원 유니티 건강 토론토 동물 관리위원회 (ACC #918)에 의해 승인되었으며 캐나다 동물 관리위원회 (CCAC)가 제시 한 지침에 따라 수행되었습니다. 플로우 세포측정 프로토콜의 회로도는 도 1에도시된다. 다운스트림 응용 프로그램이 FACS 및 후속 세포 배양인 경우 모든 단계는 적절한 무균 기술로 완료되어야 합니다.

1. 근육 수확

  1. 지역 생체 및 동물 윤리 위원회 지침에 따라 적절한 마취 및 희생을 사용하여 쥐를 마취합니다. 이 프로토콜은 성인 여성 루이스 쥐 (200-250 g)에서 위장 근육을 수확, 예를 들어. 쥐는 2-3%의 이소플루란을 사용하여 마취되었고 T61의 심내 주입에 의해 희생되었다.
  2. 동물이 희생되면 근육의 위치를 용이하게하고 수확 된 조직의 모피 오염을 최소화하기 위해 전체 뒷다리를 면도하십시오.
  3. 멸균 메스를 사용하여 발목 관절 의 둘레 주위와 발목에서 엉덩이까지 뒷다리의 내측 측면의 중간선까지 두 개의 절개를 합니다.
  4. 대퇴골의 내측 및 측면 콘딜레에서 유래하고 아킬레스 건에 삽입 기본 위장혈증을 밝히기 위해 피부와 피상적 인 근육 층을 다시 껍질.
  5. 무딘 해부를 사용하여 위트로테니미를 주변 조직과 분리하여 힘줄에 의해서만 근육을 처리하여 크러시 부상을 피하십시오.
  6. 날카로운 가위로 가능한 한 탈모한 아킬레스 건을 분리하여 위트로네미에 대한 삽입을 분리하십시오. 절단되면, 집게로 아킬레스 건을 잡고 부드럽게 밑줄 뼈떨어져 위트로네미를 껍질. 여전히 한 손에 집게와 근육을 잡고, 위장혈증의 두 기원을 찾아 내측과 측면 대퇴 추도에서 잘라.
  7. 가능한 한 많은 혈액을 제거하기 위해 살균 된 거즈 조각에 대해 절제 된 위장혈을 부드럽게 얼룩. 멸균 표면에 근육을 손질하고 아킬레스 건뿐만 아니라 과도한 결합 조직을 제거합니다.
  8. 계량 보트에 근육을 놓고 정밀 한 스케일을 사용하여 무게. 이 프로토콜은 200-600 mg에 이르는 젖은 무게로 근육을 소화하도록 최적화되어 있습니다. 작업자는 원하는 경우 다른 다운스트림 분해를 위해 과도한 수확 조직을 세분화할 수 있습니다.
  9. 수확된 근육을 유동 세포측정에 사용하는 근육을 3-4개의 작은 조각(약 1-2cm3)으로부드럽게 나누고 얼음냉이 1배 PBS에 침수합니다. 모든 샘플을 수확 할 때까지 얼음에 차가운 유지.

2. 근육 소화

  1. PBS에서 근육을 제거하고 멸균 10cm 세포 배양 접시에 배치합니다. 조각이 약 3-4mm3이될 때까지 부드럽게 찢어지고 조직을 양포로 다진, 가능한 한 많은 결합 조직을 제거. 일단 철저하게 다진, 6 mL DMEM + 1 % 페니실린 / 연쇄 절제술 (P / S)를 포함하는 멸균 50 mL 원문 튜브로 전송합니다.
  2. 콜라게나제 II 용액 365 μL(재고 농도 4800 U/mL)에 300mM CaCl2 용액의 10μL을 추가하여 콜라게나제 효소를 활성화합니다. 활성 콜라게나아제 II 용액을 조직 슬러리를 포함하는 50mL 원문 튜브에 추가합니다. 최종 콜라게나아제 II 농도는 250 U/mL입니다.
  3. 37°C, 240 x g에서1시간 동안 셰이커에 튜브를 인큐베이션하여 15분마다 수동으로 소용돌이어 튜브 측면에 부착된 조직을 제거합니다.
  4. 1 시간 후 셰이커에서 튜브를 제거하고 샘플 당 다음을 추가하십시오 : 콜라게나세 II의 100 μL (4,800 U /mL) 및 디스파스 (4.8 U /mL)의 50 μL.
  5. 피펫 샘플은 용액이 균일할 때까지 15-20배의 혈청피펫을 사용한다. 여러 샘플을 처리하는 경우 각 샘플에 대해 별도의 멸균 파이펫을 사용하여 시료 교차 오염을 방지하십시오.
  6. 37°C 및 240 x g에서30분 동안 셰이커로 다시 배양합니다. 15 분 후, 튜브의 측면에서 부착 조직을 제거하기 위해 손으로 샘플을 흔들어.

3. 단일 셀 서스펜션생성

  1. 10 사이클 동안 20 G 바늘로 10mL 주사기를 통해 천천히 전단시.
    참고: 한 주기 주사기에 근육 솔루션을 복용 포함, 튜브에 다시 주입. 과도한 거품이 추가 세포 사망을 일으킬 수 있으므로 천천히 전단을 완료하여 거품을 최소화해야합니다(39).
  2. 멸균 50mL 원판 튜브에 40 μm 셀 스트레이너를 놓고 5mL DMEM + 10 % FBS 및 1 % P / S를 피펫팅하여 적시십시오.
  3. 피펫 1 mL 샘플은 세포 스트레이너를 통해 한 번에.
  4. DMEM을 10% FBS, 1% P/S로 스트레이너를 통해 전지 스트레이너를 세척하여 튜브의 총 부피를 25mL로 가져옵니다.
  5. 시료의 25mL를 15°C에서 15mL 원심형 튜브와 원심분리기, 15분 동안 400 x g로 균등하게 분할합니다.
    참고: 근육 용액을 15mL 원문 튜브 2개로 분할하면 단일 튜브에 비해 원심분리 후 세포 회복이 개선됩니다.
  6. 상류체를 흡습하고 1mL 1x RBC 리시스 버퍼(보충 파일참조)에서 7분 동안 적혈구를 제거한다.
  7. 9mL의 워시 버퍼(보충 파일참조)로 10mL로 볼륨을 들고 400 x g,15 °C에서 15 분 동안 튜브를 회전하십시오.
  8. 1 mL 세척 버퍼에서 다시 일시 중단하여 슈퍼 네티얼을 흡인하고 펠릿을 재결합하십시오.
  9. 별도의 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브로 적절한 양의 세포를 옮기고 트라이판 블루 염료와 섞는다. 혈전계를 사용하여 가벼운 현미경으로 살아있는 세포를 계산합니다.

4. 유동 세포측정을 위한 항체 염색

참고: Sca-1 항체는 제조업체의 지침에 따라 세포측정/FACS 실험을 하기 전에 APC에 공해져야 합니다. 각 컨쥬게이트배치(그림 2)에대해 성능이 유효성을 검사해야 합니다. 최종 컨쥬게이션은 -20°C에서 20 μL 알리쿼트에 저장될 수 있으며 3주 동안 안정적입니다. 전체 컨쥬게이션 프로토콜은 보충 파일을 참조하십시오.

  1. 유동 세포측정을 위해 실험 샘플당 1-2 x 106 세포를 멸균 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브로 이송한다. 세척 버퍼로 최대 1mL의 부피를 가져와 얼음 위에 놓습니다.
  2. 각 실험에 대해, 다음과 같은 필수 컨트롤을 설정: i) 스테인드 및 ii) 생존 능력 컨트롤은 라이브 셀 집단을 정확하게 선택; iii) 형광은 단일 셀 서스펜션에 대한 1개의 (FMO) 제어를 뺀 값CD31-/CD45-분획, FAP 및 의원에 대한 정확한 게이트를 설정합니다. 및 iv) 단일 스테인드 보상 구슬은 채널 간의 형광 유출을 수정합니다.
    1. 모든 셀 컨트롤의 경우, 알리쿼트 5 x 105 - 1 x 106 셀 1 mL의 세척 버퍼에서 1.5 mL 마이크로 센심 분리기 튜브와 얼음에 배치합니다.
    2. 비드 컨트롤의 경우, 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에 1방울의 양수 보상 구슬(~1.5 x 105 비드)을 추가합니다. 컨트롤의 전체 보완은 표 1에나열됩니다.
      참고: 실험이 처음으로 수행되는 경우, 단일 세포 현탁액에 대한 각 공자 항체에 대한 단일 스테인드 컨트롤을 실행 (얼룩지지 않은, 생존가능성, 단일 염색 보상 비드 및 FMO 컨트롤 이외에) 세포에서 양성 얼룩진 인구를 평가하고 보상 비드에 관찰 된 염색을 검증하십시오. 보상 구슬 및 단일 셀 현탁액에 단 하나 염색을 수행하여 모든 갓 컨쥬게이션된 Sca-1:APC 준비를 검증합니다. 염색 컨트롤의 전체 목록은 표 1을 참조하십시오.
  3. 생존력 조절을 준비하려면 세포의 부피의 절반을 "생존가능성" 튜브에서 새로운 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브로 이송한다. 이 튜브를 "죽은"이라고 표시합니다.
  4. 세포를 죽이기 위해 65 °C에서 "죽은"튜브를 인큐베이션 한 다음 얼음위에 놓습니다. 2-3 분 후, 생존 제어 튜브에 남아있는 살아있는 세포와 죽은 세포를 다시 결합합니다. 이 셀 모집단은 보상 값(필요한 경우)을 설정하고 생존 가능성 염료에 대한 게이트를 적절하게 설정하는 데 사용됩니다.
  5. 원심분리기는 500 x g,4°C에서 5분 동안 단일 세포 서스펜션(실험 샘플 및 대조군)을 원심분리합니다.
  6. 100 μL 세척 버퍼에서 슈퍼네티드를 흡인하고 셀 펠릿을 다시 중단합니다.
  7. 실험용 시료 또는 대조에 따라 항체를 추가합니다. 항체 조합 및 양에 대한 정보는 염색 매트릭스(표2)를참조하십시오.
  8. 각 샘플을 부드럽게 쓸어서 15분 동안 어둠 속에서 얼음에 완벽하게 혼합하고 배양합니다. 보상 구슬의 경우, 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 배양하십시오.
  9. 단일 셀 서스펜션 실험 및 제어 샘플의 경우 900 μL 세척 버퍼를 추가하여 부피를 1mL로 끌어올수 있습니다. 보상 비드 컨트롤의 경우 1x PBS의 900 μL로 부피를 1mL로 끌어올수 있습니다.
  10. 원심분리기 단일 세포 현탁액 샘플은 500 x g,5 분 동안 4 °C. 원심분리기 보상 비드는 300 x g,5 분 동안 4 °C에서 제어합니다.
  11. 모든 단일 세포 현탁액 샘플의 경우, 흡인 및 300 μL 세척 버퍼에서 셀 펠릿을 다시 중단하십시오. 보상 비드 컨트롤, 흡인 및 슈퍼 나들을 폐기하려면 1x PBS의 300 μL에서 펠릿을 다시 중단한 다음 음의 보상 구슬 1 방울 (~1.5 x 105)을추가합니다.
  12. 모든 단일 셀 서스펜션 샘플을 알루미늄 호일 아래 얼음에 보관하고 세포 측정 획득을 진행합니다. 보상 구단 컨트롤도 빛으로부터 보호해야 하지만 실온에서 보관할 수 있습니다.
    참고: 실험적 종점이 유동 세포측정에 의한 FAP 식별인 경우 5.1.1-5.11단계를 따르십시오. 종점은 배양 및 염색을 위해 FACS를 통한 세포 격리인 경우 5.2.1-5.2.9 단계 및 섹션 6-7을 따르십시오.

5. 유동 세포 측정 및 형광 활성화 세포 분류 (FACS)

  1. 유동 세포측정
    참고: 이 프로토콜은 405nm, 488nm 및 640 nm 레이저가 장착된 벤치탑 유동 사이토미터를 사용하여 10가지 색상을 동시에 구별할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 밴드패스 필터 및 관련 플루오로크롬은 다음과 같습니다: 450/50(SYTOX 블루), 530/30(FITC), 575/25(PE), 670/30(APC). 각 검출기에 대한 전압은 다음과 같습니다 : FSC 700; SSC 475; FITC 360; PE 460; PE-Cy7 600; SYTOX 블루 360; APC 570. 사용하기 전에 유동 사이토미터 또는 셀 선별기의 적절한 작동에 대해 교육을 받을 수 있습니다.
    1. 세포계가 사용하기 전에 10-20분 동안 켜져 있는지 확인하고 각각 30-45s의 깨끗한 헹구기 및 칼집 유체 용액으로 순차적으로 세척하여 준비되었는지 확인합니다. dH2O.로 헹구면 적절한 양의 칼집 유체가 저장 용기에 첨가되어 획득 전반에 걸쳐 적절한 샘플 흐름을 유지합니다.
    2. 그림 3에서설명된 FAP 및 의원을 식별하기 위한 게이팅 전략을 설정합니다.
      참고 : FAP와 의원은 다음과 같은 계층 게이팅 전략에 의해 식별됩니다 : i) SSC-A 대 FSC-A (사이드 셀 산란 영역 대 전방 세포 분산 영역 대 파편 을 분리), ii) FSC-W vs FSC-H (앞으로 세포 분산 폭 대 전방 세포 분산 높이는 FSC 매개 변수에서 더블에서 싱글을 구별하기 위해, iii) SSC-W 대 SSC-H (측면 셀 분산 폭 대 측면 셀 분산 높이 대 SSC 매개 변수에서 더블에서 싱글을 구별하는) iv) SSC-A vs SYTOX 블루 (죽은 싱글을 구별하기 위해), v) SSC-A vs CD31/45:FITC (CD31+ 및 CD45+ 세포를 추가 분석에서 제외), vi) Sca-1:aPC vs VCAM-1::P E CD31-/CD45- 라인 린-) 인구 (FAP 및 의원의 식별). FAP는 CD31/CD45-/Sca-1+/VCAM-1-이벤트로 식별되며, 의원은 CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ 이벤트로 식별됩니다.
    3. 먼저 각 단일 스테인드 보상 비드 컨트롤을 저속의 사이토미터를 통해 실행하여 채널 간의 형광 유출을 보정하는 데 사용되는 보상 값을 생성합니다. 자체 검출기(예: SSC-A vs Sca-1:APC 단일 염색 구슬)와 다른 모든 검출기에서 각 제어의 형광 신호를 비교하여 보상을 평가합니다. 적절한 검출기에는 두 개의 별개의 인구(음수와 양수 신호가 있는 인구)가 있어야 하며 다른 모든 검출기에는 부정적인 집단만 있어야 합니다. 정지 게이트를 10,000개의 보상 비드 이벤트로 설정하고 데이터를 기록합니다.
      참고: 각 샘플을 획득하는 동안 시료 간 오염을 피하기 위해 10-20초 동안 사이토미터를 통해 dH2O를 실행해야 합니다.
    4. 다음으로 스테인드 및 생존 능력 제어 샘플을 처리하여 살아있는 단일 셀에 올바르게 게이트합니다. 정지 게이트를 10,000개의 단일 이벤트로 설정하고 데이터를 기록합니다.
      참고: 스테인드 되지 않은 시료를 제외한 각 단일 셀 서스펜션 시료를 획득하기 약 5분 전, SYTOX 블루 생존성 염료 1μL(1mM 스톡 용액에서 희석된 300μM 작업 농도)을 각 샘플에 추가하고 부드럽게 섞어 둡니다(최종 농도 1 μM).
    5. 그런 다음 나머지 단일 세포 서스펜션 제어 샘플을 획득합니다. 게이팅전략(그림 3)에서적절한 플롯으로 각 FMO 제어를 평가합니다. 예를 들어 CD31+CD45 FMO의 FITC 신호를 평가하여 정확한 CD31/CD45 게이트를 보장합니다. 최적의 예는 도 3G에표시됩니다. 프로토콜이 처음으로 수행되는 경우 FMO 컨트롤을 획득하기 전에 셀에 대한 단일 스테인드 컨트롤을 실행해야 합니다.
    6. 적절한 검출기뿐만 아니라 다른 모든 검출기에서 각 단일 스테인드 셀 샘플의 형광 신호를 평가하여 적절한 보상을 검증합니다. 정지 게이트를 10,000개의 라이브 싱글 이벤트로 설정하고 소프트웨어에 기록합니다.
    7. 모든 컨트롤(단일 세포 서스펜션 및 구슬)이 처리되면 먼저 각 샘플의 부피를 측정하고 기록하여 모든 실험 샘플을 준비합니다. 이러한 측정은 5.1.11 단계에서 설명된 바와 같이 FAP와 의원을 정확하게 정량화하는 데 사용됩니다. 그런 다음 50 μL의 정밀 계산 구슬을 넣고 2-3번 위아래로 파이프를 통해 부드럽게 섞습니다.
    8. 첫 번째 실험 샘플을 간략하게 실행하여 계수 비드 집단의 식별을 확인합니다. 이 인구는 FSC-A 대 SSC-A플롯(그림 3A,적색 상자)의 일반 세포 집단과 는 별개의 작은 클러스터로 나타납니다. 계산 구비드 인구 주위에 게이트를 만듭니다. 그런 다음 저속으로 사이토미터를 통해 처리하여 각 실험 샘플에 대한 데이터를 수집합니다. 정지 게이트를 10,000개의 카운트 비드 이벤트로 설정하고 기록합니다.
      참고: 구슬계산은 모든 검출기에서 형광이기 때문에 SSC-A와 검출기를 평가하는 추가 플롯을 설정하여 구슬 계산을 식별할 수 있습니다.
    9. 모든 샘플이 처리된 후 적절한 프로토콜을 사용하여 사이토미터를 청소하십시오. 분석을 위해 모든 데이터를 내보냅니다.
    10. 적절한 흐름 세포 분석 소프트웨어에서 모든 데이터 파일을 엽니다. 5.1.2 단계에서 설명한 대로 데이터 수집에 사용되는 게이팅 전략을 설정합니다. 데이터 수집(예: 스테디에이징, 생존 가능성, 단일 얼룩, FMO 컨트롤)과 동일한 순서로 컨트롤을 검사하여 게이팅 전략을 다시 검증합니다. FMO 컨트롤을 사용하여 정확한 게이트를 설정하면 모든 실험 샘플에 게이트를 적용합니다. 원시 데이터를 정량화를 위한 스프레드시트로 내보냅니다.
    11. 계산 구슬을 사용하여 각 실험 샘플에서 FAP 및 MP 수를 계산합니다.
      figure-protocol-8701
      여기서, 획득된 셀 카운트는 취득 소프트웨어에 관련 세포 집단(예: FAP 또는 의원)의 기록된 이벤트의 수입니다; 획득한 비드 카운트는 획득 소프트웨어에서 구슬을 계산하는 기록된 이벤트 수입니다. 구슬 볼륨 계산은 5.1.7 단계에 추가된 비드 솔루션 계산의 양입니다. 샘플 볼륨은 구슬 을 계는 첨가하기 전에 각 염색 된 실험 샘플의 부피입니다.; 비드 농도는 μL 용액당 구슬의 수입니다. 이 값은 제품 데이터 시트에서 찾을 수 있습니다.
  2. FACS - 세포 배양을 위한 선별
    참고: 이 프로토콜은 11-14색을 동시에 구별할 수 있는 4개의 레이저(UV, 바이올렛, 블루, 레드)가 장착된 세포 선별기에서 FACS를 수행합니다. 실험용 샘플 스테인링(섹션 4) 및 유동 세포측정 프로토콜을 따르면 아래 설명된 1단계에서 3단계를 제외하고 FACS 워크플로우를 최적화하십시오.
    1. 실험 샘플에서 세포의 농도를 7 x 106 세포/mL로 정렬하여 FAP 및 MP의 견고한 수율을 생성합니다.
    2. 세포 농도가 현저한 증가를 설명하기 위해, 실험 샘플에서 모든 항체 농도를 두 배로 정렬한다.
    3. 최종 스테인드 셀 샘플을 40 μM 셀 스트레이너 캡을 5mL 폴리스티렌 튜브에 부착하여 세포 응집량을 줄이고 정렬 수율을 증가시면 바로 정렬합니다.
    4. 세포 선별기에서 직접 단일, 라이브 래트 FAP 및 의원을 수집하여 멸균 1mL, 100% 태아 소 혈청(FBS)을 포함하는 5mL 폴리프로필렌 수집 튜브로 수집합니다. 정렬이 완료될 때까지 셀을 얼음 위에 보관하십시오.
      참고: 오프사이트 위치에서 FACS를 수행하는 경우 정렬된 모든 셀을 얼음과 고정된 지붕으로 전송합니다.
    5. 멸균 생물 안전 캐비닛 (BSC)에서 작업, 적절한 성장 매체 (예를 들어, FAP 성장 미디어 (FAP GM) 정렬 FAP, 그리고 MP 성장 매체 (MP GM) 정렬 된 의원을위한, 그리고 원심 분리기 500 x g, 4 °C에서 7 min을 제거 가능한 7 min.
    6. 적절한 성장 매체와 플레이트의 1mL에서 펠릿을 멸균, 콜라겐 코팅 12mm 유리 커버슬립/후속 면역스테인링에 대한 잘 함유된 12웰 플레이트로 재장판한다(섹션 6 참조).
      참고: 콜라겐에 대한 면역 세포화학 염색이 있는 경우, 플레이트는 콜라겐 코팅 대신 멸균, 라미닌 코팅 12mm 유리 커버슬립/웰을 포함하는 12개의 웰 플레이트로 세포를 분류하였다. 즉시 분리된 전조자의 면역 세포화학 실험이 필요한 경우, 종자 FAP와 의원은 cm2당 15,000개의 세포밀도로 6.1단계로 직접 진행한다. 종전배의 경우 전구 분화를 유도하기 위해, cm2당5,000개의 세포밀도에서 종자 FAP, 그리고 CM2당7,500세포의 밀도로 의원을 종자 FAP한다.
    7. 세포 배양인에서 세포를 37°C 및 5%CO2에서 배양한다. 문화에서 72 h 후, 미디어의 절반을 변경합니다. 이후 2-4d마다 미디어를 완전히 변경합니다.
    8. 심낭개발을 유도하기 위해 9일째에 MP 분화(MD) 배지로 국회의원 배양을 전환한다. 지방세포를 유도하기 위해, FAP 배양을 10일째에 FAP 성 분화(AD) 배지로 전환한다.
    9. 섬유신생을 유도하기 위해, FAP는 배양 중 가변시간에 섬유생성 분화(FD) 배지로 전환될 수 있거나, 또는 대안적으로, 격리 후 FD 미디어로 직접 시드될 수 있다(단계 5.2.6) (모든 미디어 레시피에 대한 보충 파일 참조).

6. 배양 된 FAP 및 의원의 면역 세포 화학

  1. 세포 정렬의 유효성을 검사하고 FAP 및 MP 배양의 순도를 입증하려면 PDGFRα (FAP 마커), Pax-7 (근육 줄기 [위성] 세포 마커), 섬유 아스트론 특정 단백질 (FSP-1, 섬유 아세포 마커), 페리핀-1 (플린-1, 아디포티마커), 콜라겐 타입 1 (Col1a1, 섬유증의 지표), 마이오스 헤비 체인 (MHC 성숙)을 포함하는 세포 형 특정 마커를 가진 면역 스테인.
    1. 갓 선별된 세포의 면역 염색을 위해 실온에서 3분 동안 200 x g의 12웰 플레이트원심분리기를 하여 커버슬립/웰에 세포를 쉽게 준수합니다. 이 단계는 장기 문화에 필요하지 않습니다. 문화 매체를 제거합니다.
    2. FSP-1을 가진 면역 염색을 위해, 4°C에서 2 분 동안 1 mL 100% 메탄올 (MeOH)로 세포를 고정합니다. PDGFRα, 플린-1, Pax7 또는 Col1a1에 대한 면역 염색시, 실온에서 15분 동안 1x PBS에서 1mL 4% PFA로 세포 배양을 수정한다. MHC 면역 염색은 어느 고정도를 용인합니다.
      참고: 메탄올 고정 셀의 경우 6.2단계를 건너뛰고 6.3단계로 진행합니다.
  2. 4% PFA를 흡인하고 1배 PBS로 세포 배양을 3-4회 빠르게 세척합니다. 1x PBS에 1mM 글리신을 넣고 실온에서 10분 동안 배양하여 잔류 PFA를 비활성화합니다. 1x PBS로 1-2회 흡입및 세척합니다.
    참고: 세포는 1x PBS의 2mL에 이 단계에서 방치할 수 있으며, 집착 필름으로 싸서 최대 7-10일 동안 4°C로 보관할 수 있다.
  3. 세척 후, 1x PBS에 0.1% Triton-X의 1mL를 추가하고 세포막을 충혈하기 위해 20 분 동안 배양하십시오.
  4. 1x PBS의 1-2 mL로 우물을 2-3 번 씻은 다음 실온에서 1 시간 동안 1 x PBS + 3 % BSA의 1 mL로 세포를 차단합니다.
  5. 1x PBS + 3% BSA(PDGFRα 1:100, 팍스7 깔끔한, FSP-1 1:50, 플린-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 μg/mL)로 희석된 1차 항체의 파이펫 80 μL이 파라필름 을 탭하여 이동식 컨테이너에 테이프로 붙인다. 멸균 미세 포셉을 사용하여 커버슬립을 우물 밖으로 조심스럽게 들어 올리고 항체 용액의 방울에 반전시면 됩니다. 항체 용액의 증발을 피하기 위해 플라스틱 필름에 젖은 두 개의 종이 타월과 커버 용기로 커버 슬립을 인큐베이션하십시오. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
    참고: 염색 커버는 우물 내부에 염색하는 것보다 항체(~80 μL)를 적게 활용합니다(최소 500μL).
  6. 2일째에는 실온에서 30분 동안 커버립을 그대로 둡니다. 집게를 신중하게 바르고 커버를 각각 의 우물(세포를 위로 향하게 하는 세포)로 다시 2-3회 세척하고, 1x PBS1-2mL로 2-3회 세척하여 가능한 한 많은 1차 항체를 제거한다.
  7. 1차 항체 염색과 동일한 염색 기술을 사용하여, 염소 안티래빗 알렉사 플루어 488 이차 항체(1:400)를 가진 얼룩 세포는 FSP-1, 플린-1, Col1a1, 또는 PDGFRα 및 염소 항마우스 알렉사 플루어 555 이차 항체(1:300)를 검출한다. 실온에서 1시간 동안 세포를 배양하고 세포가 빛으로부터 보호됩니다.
  8. 실온에서 2-4 분 동안 Hoechst (1:10,000)를 사용하여 우물로 세포를 반환하고 세포를 배양하십시오. 여분의 Hoechst를 제거하기 위하여 2 분 마다 1x PBS로 또 다른 2-3 시간을 세척합니다.
  9. 마운트 커버립을 유리 슬라이드에 마운트커버리핑을 사용하여 페이드 형광 장착 매체를 사용하고 실온에서 밤새 건조슬라이드를 남깁니다. 어두운 4 °C에 장착 된 커버립을 저장합니다.

7. 오일 레드 O (ORO) 배양 FAP및 의원의 염색

  1. 세포막의 투과화로 비특이적/바람직하지 않은 비-비 염색 귀착될 수 있기 때문에 비-투과성 세포에 ORO 염색을 수행. 염색을 하기 전에 ORO 작업 재고를 준비하고(레시피에 대한 보충 파일 참조) 실온에서 20분 동안 배양하십시오.
  2. 20분 후, 용해되지 않은 골재를 제거하기 위해 0.2 μm 필터를 사용하여 용액을 필터링합니다.
  3. 잘에서 미디어를 흡인하고 10 % 중립 버퍼 포머린 (10 % NBF)의 1 mL을 추가합니다. 실온에서 5분 동안 배양하십시오.
    참고: 세포 합류로 인해 웰/커버슬립에서 해제될 수 있습니다. 솔루션을 흡입/추가할 때 주의하십시오.
  4. 흡인 및 신선한 10 % NBF의 1 mL을 추가하고 실온에서 적어도 1 h에 대한 인큐베이션.
    참고: 세포가 하룻밤 사이에 10% NBF에 남을 수 있기 때문에 프로토콜은 이 시점에서 중지될 수 있습니다.
  5. 60%의 이소프로판올 1mL로 한 번 빠르게 씻은 다음, 흡인을 하고 우물이 완전히 건조(약 2분)되도록 합니다.
  6. 우물당 400 μL 오일 Red O 작업 재고를 추가하고 실온에서 10 분 동안 배양하여 플레이트 벽에 ORO를 피하십시오.
  7. 오일 레드 O를 모두 제거하고 dH2O로 4 회 빠르게 씻어 내보겠습니다.
    참고: 스테인드 웰에 커버립이 포함되어 있는 경우 6.9단계에서 설명된 것과 동일한 기술을 사용하여 마운트합니다.
  8. 이미지는 밝은 필드 현미경을 사용하여 커버립 또는 잘 염색 된 커버립을 장착.

8. 모순과 기재 쥐 위장 혈증 섹션의 조직 염색

  1. 피그리리우스 레드 (PSR)
    1. PSR 염색을 수행 5 μm 두께, 포르말린 고정 파라핀 임베디드 (FFPE) 쥐 위트종양 히스토로지학적 섹션은 이전에 설명된 바와 같이40.
  2. 오일 레드 O (ORO)
    1. 5 μm 두께의 고정된 5μm-냉동 쥐 위장술 학적 섹션은 10 분 동안 PFA 4 % PFA로, 1 분 동안 60 % 이소 프로필 알코올로 배양하십시오.
    2. 12 분 동안 ORO 작업 재고와 얼룩. 60% 이소프로필 알코올을 1분 동안 인큐베이션하고, 다용성 마운팅 미디어를 사용하여 커버립에 dH2O. 마운트에서 10분 간 세척합니다.
  3. Sca-1 및 라미닌 조직 형광 면역 조직 화학 (IHC)
    1. 5 μm 두께의 이조판-냉동 쥐 위트로테미혈증 연성 섹션에서 형광 IHC를 수행합니다.
    2. 5 분 동안 1 x PBS에서 샘플을 수분, 10 분 동안 4 % PFA에 수정 한 다음 조직 IF 차단 솔루션 (보충 파일참조)에서 샘플을 90 분 동안 배양하십시오.
    3. 1x PBS + 0.05% Tween에서 하룻밤 사이에 희석된 항-Sca-1 1 차성 항체(1:500)를 가진 배양.
    4. 2일째에는 1x PBS + 0.05% 트웬에서 각각 5분 동안 3회 세척한 다음 염소 안티래빗 알렉사 플루어 555(1:500)에서 1시간 동안 인큐베이션을 합니다.
    5. 다시 씻어 (이전과 같이), 1 h에 대한 차단 용액으로 인큐베이션 한 다음 1 x PBS + 0.05 % Tween에서 희석 된 안티 라미닌 원차 항체 (1:500)를 1 h에 추가하십시오.
    6. 다시 씻어 (이전과 같이), 다음 염소 안티 토끼 알렉사 플루어 488 (1:500)에서 배양 1 시간 (라미닌).
    7. 다시 씻은 다음 DAPI(1:10,000)에서 4분 동안 배양합니다. 페이드 방지 마운팅 매체를 사용하여 커버립에 세척하고 장착하십시오.

결과

Sca-1 및 VCAM-1을 포함한 새로운 항체 패널을 사용하여 유동 세포측정을 통해 FAP 및 의원을 식별
쥐 근육에서 FAP를 식별하기위한 게이팅 전략은 CD31 (내피) 및 CD45 (혈토포이틱)의 게이트가 있는 마우스29의흐름 세포 측정 프로토콜을 기반으로하고 FAPs 마커 Sca-1 및 MpPs 마커 ITGA7의 형광 프로파일을 검사합니다. 쥐 Sca-1 및 ITGA7에 ?...

토론

쥐 근육에 대 한 최적화 된, 검증 된 FAP 격리 프로토콜은 생물학적 또는 기술적 인 이유로 마우스에서 가능 하지 않는 부상 모델을 공부 하고자 하는 연구자에 대 한 필수적이다. 예를 들어, 마우스는 만성 국소, 또는 장기 기형 과 같은 신경 퇴행성 상해를 연구하는 최적 동물 모델이 아닙니다. 생물학적으로, 마우스의 짧은 수명과 급속한 노화는 노화의 혼란스러운 요인으로부터 의결로 인한 근육...

공개

저자는 공개 할 충돌이 없습니다.

감사의 말

우리는 오타와 대학과 생물 의학 에 대한 키난 연구 센터 (KRC), 세인트 마이클스 병원 유니티 건강 토론토의 전문 지식과 이 원고에 제시 된 흐름 세포측정 / FACS 프로토콜의 최적화에 대한 지도에 감사드립니다 흐름 세포 측정 핵심 시설에 감사드립니다. 이 작품은 JB에 디자인 새로운 아이디어 2018 기금 (MbDNI-2018-01)에 의해 의학에 의해 투자되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL Polypropylene Round-Bottom TubeFalcon352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer CapFalcon352235
10 cm cell culture dishesSarstedt83.3902
12-well cell culture plateThermoFisher130185
12 mm glass coverslips, No.2VWR89015-724
10 mL SyringeBeckton Dickenson302995
15 mL centrifuge tubesFroggaBio91014
20 gauge needleBeckton Dickenson305176
25mL Serological pipetteSarstedt86.1685.001
40µm cell strainerFisher Scientific22363547
50mL centrifuge tubesFroggaBioTB50
AbC Total Antibody Compensation Beads ThermoFisherA10497
Ammonium Chloride, Reagent GradeBioshopAMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µgBiotium92307
Aquatex Aqueous Mounting MediumMerck108562
Biolaminin 411 LNBiolaminaLN411
Bovine Serum Albumin (BSA)BioshopALB001
Calcium ChlorideBioshopCCL444.500
Collagenase Type IIGibco17101015
CountBright Plus Absolute Counting BeadsThermoFisherC36995
DexamethasoneMillipore SigmaD4902
DispaseGibco17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Gibco11995-065(+)4.5 g/L D-Glucose
(+)L-Glutamine
(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTAFisherScientificS311
FACSClean SolutionBeckton Dickenson340345
FACSDiva SoftwareBeckton Dickenson--
FACSRinse SolutionBeckton Dickenson340346
Fetal Bovine SerumSigmaF1051
Flow Cytometry Sheath FluidBeckton Dickenson342003
FlowJo SoftwareBeckton Dickenson--
Fluorescent Mounting MediumDakoS302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibodyInvitrogenA21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibodyInvitrogenA11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibodyInvitrogenA21429
Goat SerumGibco16210-064
Ham's F10 MediaThermoFisher 11550043(+) Phenol Red
(+) L-Glutamine
(-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)Multicell311-513-CL
Heat Inactivated Horse SerumGibco26050-088
HemocytometerReichertN/A
HEPES, minimum 99.5% titrationSigmaH3375
Horse SerumThermoFisher16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1)Cell Signaling8915LF
Humulin RLillyHI0210
IBMXMillipore SigmaI5879Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
IsopropanolSigmaI9516Also known as 2-propanol
Lewis Rat, FemaleCharles River Kingston004 (Strain Code)200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop CytometerBeckton Dickenson--
MicrocentrifugeEppendorfEP-5417R
MoFlo XDP Cell SorterBeckman Coulter--
Mouse Anti-CD31::FITC AntibodyAbcamab33858Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC AntibodyBiolegend202205Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE AntibodyBiolegend200403Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/AAlso known as MF20
Mouse Anti-Pax7 AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 %SigmaHT501128
Oil Red OMillipore SigmaO0625
PE-Cy7 Conjugation KitAbcamab102903
Penicillin-StreptomycinSigma P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)Gibco10010-023(-)Calcium Chloride
(-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent GradeBioshopPBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) AntibodyInvitrogenMA5-32347FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 AntibodyAbcamab203254
Rabbit Anti-Laminin AntibodySigmaL9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 AntibodyAbcamab3526
Rabbit Anti-Sca-1 AntibodyMillipore SigmaAB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I AntibodyAbcamab260043Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha AntibodyAbcamab203491
Recombinant Human FGF-basicGibcoPHG0266
Sodium AzideSigmaS2002
Triton-X-100Fisher ScientificBP151
TroglitazoneMillipore SigmaT2573
Tween-20BioshopTWN510

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