Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבודד אבות פיברו-אדיפוגניים (FAPs) ואבים מיוגניים (MPs) משרירי השלד של חולדה. ניצול החולדה במודלים של פגיעה בשרירים מספק זמינות רקמות מוגברת משריר אטרופי לניתוח ורפרטואר גדול יותר של שיטות מאומתות להערכת כוח השריר וההליכה בבעלי חיים הנעים חופשיים.

Abstract

אבות פיברו-אדיפוגניים (FAPs) הם תאים ביניים המתגוררים בשריר השלד, שיחד עם אבות מיוגניים (חברי פרלמנט) ממלאים תפקיד מפתח בהומאוסטזיס שרירים, פציעה ותיקון. הפרוטוקולים הנוכחיים לזיהוי FAPs ובידוד משתמשים בציטומטריה של זרימה/מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנטיות (FACS) ומחקרים המעריכים את תפקודם ב-vivo עד כה בוצעו אך ורק בעכברים. הגודל הטבוע הגדול יותר של החולדה מאפשר ניתוח מקיף יותר של FAPs במודלים לפגיעה בשרירי השלד, במיוחד בשריר ניוון חמור או כאשר החוקרים דורשים מסת רקמה משמעותית כדי לבצע בדיקות מרובות במורד הזרם. החולדה מספקת בנוסף מבחר גדול יותר של בדיקות תפקודיות שרירים שאינן דורשות סדציה או הקרבה של בעלי חיים, ובכך מזעור התחלואה והשימוש בבעלי חיים על ידי הפעלת הערכות סדרתיות. פרוטוקולי ציטומטריית הזרימה/FACS הממוטבים לעכברים הם ספציפיים למינים, במיוחד מוגבלים על ידי המאפיינים של נוגדנים זמינים מסחרית. הם לא עברו אופטימיזציה להפרדת FAPs מעכברוש או שריר סיבי מאוד. פרוטוקול ציטומטריית זרימה /FACS לזיהוי ובידוד של FAPs וחברי פרלמנט משריר השלד של חולדה בריא ופגום פותח, תוך הסתמכות על הביטוי הדיפרנציאלי של סמני פני השטח CD31, CD45, Sca-1 ו- VCAM-1. מכיוון שנוגדנים ראשיים מאומתים בציטומטריה של זרימה מוגבלים מאוד, בוצעה הטיות פנימיות של הנוגדן שמכוון ל-Sca-1. באמצעות פרוטוקול זה, הטיות מוצלחות של Sca-1 אושרו, וזיהוי ציטומטרי של FAPs וחברי פרלמנט אומת על ידי תרבית תאים וחיסון של FAPs וחברי פרלמנט מבודדים FACS. לבסוף, אנו מדווחים על קורס זמן FAPs חדשני במודל גינה ממושכ (14 שבועות) חולדה. שיטה זו מספקת לחוקרים את היכולת לחקור FAPs במודל בעלי חיים חדשני.

Introduction

תאי אב פיברו-אדיפוגניים (FAPs) הם אוכלוסייה של תאי אב רב-תכליתיים בשריר השלד הממלאים תפקיד קריטי בהומאוסטזיס שרירים, תיקון והתחדשות, ומנגד, גם מתווכים תגובות פתולוגיות לפגיעה בשרירים. כפי שהשם מרמז, FAPs זוהו במקור כאוכלוסייה ילידית עם פוטנציאל להבדיל לתוך פיברובלסטים אדיפוציטים1, היו אמורים להיות המתווכים העיקריים של חדירה פיברו-שומני של שריר השלד בפציעה כרונית ומחלות. מחקר נוסף גילה כי FAPs מסוגלים בנוסף אוסטוגנזה וכונדרוגנזה2,3,4. לכן, הם נרשמים באופן רחב יותר בספרות כמו אבות mesenchymal או סטרומי3,5,6,7,8. בפגיעה חריפה בשריר השלד, FAPs בעקיפין לסייע myogenesis התחדשות על ידי התפשטות חולפת כדי לספק סביבה נוחה עבור תאי לווין שריר מופעל שלהם במורד הזרם myogenic אבות (MPs) עמיתיהם1,9,10. במקביל להתחדשות מוצלחת, FAPs עוברים אפופטוזיס, מחזירים את מספרם לרמות בסיסיות1,9,10,11. לעומת זאת, בפציעה כרונית בשריר, FAPs לעקוף אותות פרו-אפופטוטיים, אשר התוצאההיא ההתמדהשלהם 9,10,11 ותיקון שרירים חריג.

במחקרים של vivo המעריכים את המנגנונים התאיים והמולקולריים שבאמצעותם FAPs מתווכים תגובות שרירים השתמשו במודלים של בעלי חיים מורינים עד כה1,7,9,10,11,12,13,14. בעוד עכברים מהונדסים גנטית הם כלים רבי עוצמה לשימוש ניתוחים אלה, הגודל הקטן של החיה מגביל את זמינות הרקמות למחקר במודלים פציעה מקומית לטווח ארוך שבו ניוון שרירים יכול להיות עמוק, כגון denervation טראומטי. יתר על כן, מדידת כוח השריר ותפקוד פיזי דורשת ex vivo או מדידות במקום המחייבות סיום של העכבר, או בשיטות vivo הדורשות ניתוח ו/או הרדמה כללית כדי לאפשר הערכה של ביצועי התכווצותשרירים 15,16,17,18,19,20 . בחולדות, ניתוחים תפקודיים שרירים מאומתים היטב ומנוצלים ברחבי העולם, בנוסף לניתוחים להתנהגויות מוטוריות מורכבות יותר כגון ניתוח הליכה (למשל, מדד תפקודים סיאטיים, ניתוח מסלול) קיימים ומבוצעים בבעלי חיים ערים ונועים באופן ספונטני21,22,23,24 . זה גם מייעל את העקרונות של תחלואה מינימלית בניסויים בבעלי חיים, ומספרי בעלי החיים במחקר בשימוש. החולדה ובכך מספקת לחוקר FAPs את הגמישות הנוספת של נפח שרירים פגוע גדול יותר עבור ניתוחי חלבון ותאים ואת היכולת לבצע הערכות סדרתיות של פעילות והתנהגויות תפקודיות סטטיות ודינמיות מורכבות שרירים, בחיה המתריעה.

FAPs זוהו בעיקר ובודדו מדגימות שרירים שלמות באמצעות ציטומטריית זרימה ומיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) בהתאמה. אלה הם בדיקות מבוססות לייזר המסוגלות לזהות אוכלוסיות תאים ספציפיות מרובות בהתבסס על תכונות אופייניות כגון גודל, פירוט, ושילוב ספציפי של פני תא או סמנים תאיים25. זה יתרון רב במחקר של מערכת איברים כגון שריר השלד, כמו הומאוסטזיס והתחדשות הם תהליכים מורכבים, רב-גורמיים מתואמים על ידי שפע של סוגי תאים. מחקר מכונן זיהה FAPs, כמו גם חברי פרלמנט, באמצעות שיטות ציטומטריות זרימה בשריר השלד של העכבר1. הם הוכיחו כי FAPs הם mesenchymal בטבע, כפי שהם חסרים אנטיגנים פני השטח ספציפי לתאים מן אנדותל (CD31), hematopoietic (CD45), או מיוגניים (Integrin-α7 [ITGA7]) מקורות, אבל ביטא את סמן תא גזע mesenchymal Sca-1 (אנטיגן תא גזע1) 1 מובחן לתאים פיברוגניים אדיפוגניים בתרבות. מחקרים אחרים הדגימו בידוד מוצלח של אבות מזנכימלים בשריר בהתבסס על ביטוי של סמן תאי גזע חלופי, קולטן גורם גדילה נגזר טסיות דם אלפא (PDGFRα)2,7,8 וניתוח נוסף גילה אלה צפויים להיות אותה אוכלוסיית תאים כמו FAPs3. FAPs מזוהים כעת בציטומטריית זרימה באמצעות Sca-1 או PDGFRα כסמן בחירה חיובי1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . השימוש PDGFRα הוא מועדף על רקמה אנושית עם זאת, כמו הומולוג אנושי ישיר של מורין Sca-1 עדיין לא זוהה32. בנוסף, חלבונים אחרים על פני התא דווחו כסמנים של חברי פרלמנט (למשל, VCAM-1), המספקים חלופה פוטנציאלית ל- ITGA7 כאינדיקטור לתאי שושלת מיוגנית במהלך בידוד FAPs33.

בעוד cytometry זרימה / FACS היא מתודולוגיה רבת עוצמה לחקר התפקיד ואת הפוטנציאל הפתוגניים של FAPs בשריר השלד1,9,10,11,13,29, הוא מוגבל מבחינה טכנית על ידי הספציפיות והאופטימיזציה של ריאגנטים הנדרשים שלה. מאז זיהוי ציטומטרי זרימה ובידוד של FAPs פותח ונערך במודלים של חיות עכבר1,9,10,11,29, זה מציב אתגרים עבור חוקרים המעוניינים לחקור FAPs באורגניזמים מודל אחרים. גורמים רבים - כגון גודל רקמות אופטימלי לעיבוד, כמו גם ריאגנט ו / או ייחודיות נוגדנים וזמינות - שונים בהתאם למין המשמש.

בנוסף למחסומים הטכניים לחקר FAPs במודל בעלי חיים חדשני, הם נחקרו במידה רבה בסביבה חריפה ורעילה - בדרך כלל באמצעות הזרקה כימית תוך שרירית או cardiotoxin. הערכת הדינמיקה ארוכת הטווח של FAPs מוגבלת בעיקר להערכה בניוון השרירים של דושן, באמצעות עכבר mdx מודל9,10,11, ומודלים של פגיעה שרירים משולבת כגון קרע מסיבי בשרוול סיבוב שבו טרנספר גיד בו זמנית ו denervation מבוצע על שריריהכתף 26,27,28 . התגובה של FAPs לעלבון הבלעדי של denervation טראומטי כרוני, תופעה שכיחה בתאונות במקום העבודה בתעשייה כבדה, בחקלאות, ובטראומות לידה (פגיעת מקלעת ברכיאלית)34,35,36,37עםתחלואה משמעותית, לא היה מאופיין היטב, לעתים קרובות מוגבל למסגרת זמן לטווח קצר11,38.

אנו מתארים שיטה לזיהוי ובידוד של FAPs וחברי פרלמנט משריר שלד בריא, כמו גם ניוון וסיברוטי חמור בחולדה. ראשית, זיהוי של CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs ו- CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ חברי פרלמנט באמצעות עיכול רקמות ופרוטוקול הכתמת ציטומטריה של זרימה מוצג ואימות לאחר מכן של הממצאים שלנו מתבצע באמצעות תרבית והכתמה חיסונית של תאים מבודדים FACS. באמצעות שיטה זו, אנו מדווחים גם על קורס זמן חדש של FAPs במודל פגיעה מבודד לטווח ארוך בחולדה.

Protocol

חוקרים המבצעים פרוטוקול זה חייבים לקבל אישור מוועדת האתיקה / ועדת הטיפול המקומית שלהם בבעלי חיים. כל עבודות בעלי החיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של בית החולים סנט מייקל בטורונטו (ACC #918) ובוצעו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים (CCAC). תרשים של פרוטוקול ציטומטריית הזרימה מוצג באיור 1. אם היישום במורד הזרם הוא FACS ותרבות התאים הבאים, יש להשלים את כל השלבים בטכניקה אספטית מתאימה.

1. קצירת שרירים

  1. מרדים חולדות באמצעות הרדמה מתאימה והקרבה על פי הנחיות ויבריום מקומיות ואתיקה של בעלי חיים. פרוטוקול זה קוצר את שריר gastrocnemius מחולדות לואיס נקבה בוגרת (200-250 גרם), כדוגמה. חולדות היו מרדים באמצעות 2-3% Isoflurane והוקרבו על ידי הזרקה תוך לבבית של T61.
  2. לאחר שבעל החיים הוקרב, לגלח את כל אחורי כדי להקל על המיקום של השריר ולמזער זיהום פרווה של הרקמה שנקטפה.
  3. באמצעות אזמל סטרילי, לעשות שני חתכים בעור: הראשון סביב היקף מפרק הקרסול והשני עד קו האמצע של ההיבט המתיי של האחורי מהקרסול לירך.
  4. לקלף את העור ואת שכבות השרירים שטחי לחשוף את gastrocnemius הבסיסי, שמקורו ב condyles המתיידל לרוחב של עצם הירך ומכניס בגיד אכילס.
  5. השתמש ב ניתוח קהה כדי להפריד את gastrocnemius מן הרקמה שמסביב, טיפול בשריר רק על ידי הגיד כדי למנוע פגיעה למחוץ.
  6. להפריד את gastrocnemius מן החדרתו על ידי חציית גיד אכילס בצורה מזוקקת ככל האפשר עם מספריים חדים. לאחר חיתוך, לתפוס את גיד אכילס עם מלקחיים בעדינות לקלף את gastrocnemius את העצם underlaying. עדיין מחזיק את השריר עם מלקחיים ביד אחת, לאתר את שני המקורות של gastrocnemius לחתוך את condyles הירך המהופלי לרוחב.
  7. כתם gastrocnemius excised בעדינות נגד חתיכת גזה סטרילית כדי להסיר דם רב ככל האפשר. לקצץ את השריר על משטח סטרילי ולהסיר כל רקמת חיבור עודף, כמו גם את גיד אכילס.
  8. מניחים את השריר בסירת שקילה ומשקלים באמצעות סולם מדויק. פרוטוקול זה מותאם לעיכול שרירים עם משקל רטוב הנע בין 200-600 מ"ג. מפעילים עשויים להקנות רקמות עודפות שנקטפו לבדיקות במורד הזרם, אם תרצה.
  9. יש לחלק בעדינות את השריר שנקטף כדי לשמש לציטומטריית זרימה ל-3-4 חתיכות קטנות יותר (כ-1-2 ס"מ3)ולשקוע ב-PBS 1x קר כקרח. שמור קר על קרח עד שכל הדגימות נקצרו.

2. עיכול שרירים

  1. הסר את השריר מ- PBS ומניחים בצלחת תרבית תאים סטרילית של 10 ס"מ. קרע בעדינות ורקמת טחון עם מלקחיים עד חתיכות הם כ 3-4 מ"מ3, הסרת רקמת חיבור ככל האפשר. לאחר טחון ביסודיות, להעביר צינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל המכיל 6 מ"ל DMEM + 1% פניצילין / סטרפטומיצין (P /S).
  2. הוסיפו 10 מיקרו-אל של תמיסת CaCl2 של 300 מ"מ ל-365 מיקרול של תמיסת קולגנאז II (ריכוז מלאי 4800 U/ML) כדי להפעיל את האנזים קולגנאז. הוסיפו את תמיסת הקולגנאז II הפעילה לצינור החרוטי 50 מ"ל המכיל את תרחיף הרקמות. ריכוז הקולגנאז II הסופי הוא 250 U/mL.
  3. צינורות דגירה בשייקר במשך 1 שעות ב 37 °C (37 °F), 240 x g, הקפדה להסתובב באופן ידני כל 15 דקות כדי לעקור כל רקמה כי יש דבק בצד של הצינור.
  4. לאחר שעה אחת, להסיר צינורות משייקר ולהוסיף את הדברים הבאים לכל מדגם: 100 μL של Collagenase II (4,800 U / mL) ו 50 μL של Dispase (4.8 U / mL).
  5. דגימות פיפטה באמצעות פיפטה סרולוגית 15-20 פעמים עד שהפתרון הומוגני. במקרה של עיבוד דגימות מרובות, השתמש בצינור סטרילי נפרד עבור כל דגימה כדי למנוע זיהום צולב לדוגמה.
  6. דגירה שוב בשייקר במשך 30 דקות ב 37 °C (7 °F) ו 240 x g. לאחר 15 דקות, לנער דגימות ביד כדי לעקור רקמה דבק את הצד של הצינור.

3. יצירת השעיית תא בודד

  1. לאט לאט לגזור דגימות דרך מזרק 10 מ"ל עם מחט 20 G במשך 10 מחזורים.
    הערה: מחזור אחד כרוך לוקח פתרון שריר לתוך מזרק, והזרקת אותו בחזרה לתוך הצינור. הקפד למזער את כל הבועות על ידי השלמת גיזום לאט, כמו קצף מוגזם יכול לגרום למוות תאים נוסף39.
  2. מניחים מסננת תאים 40 מיקרומטר על צינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל והרטיבו אותו על ידי צנרת 5 מ"ל DMEM + 10% FBS ו 1% P /S.
  3. פיפטה 1 מ"ל של המדגם בכל פעם דרך מסננת התא.
  4. לשטוף את מסננת התא על ידי pipetting DMEM עם 10% FBS ו 1% P /S דרך מסננת להביא את הנפח הכולל בצינור ל 25 מ"ל.
  5. לפצל 25 מ"ל של המדגם באופן שווה לשני צינורות חרוט 15 מ"ל צנטריפוגה ב 15 °C (70 °F), 400 x g במשך 15 דקות.
    הערה: פיצול פתרון השריר לשני צינורות חרוטיים 15 מ"ל מבטיח התאוששות תאים טובה יותר לאחר צנטריפוגה לעומת צינור יחיד.
  6. שאפו את supernatant ולהשעות מחדש את הכדור 1 מ"ל 1x RBC חיץ תמיסת RBC (ראה קובץ משלים) בטמפרטורתהחדר במשך 7 דקות כדי לחסל אריתרוציטים.
  7. העלה את עוצמת הקול ל-10 מ"ל עם 9 מ"ל של מאגר כביסה(ראה קובץ משלים) וצינורות ספין ב-400 x גרם,15 °C (70 °F) למשך 15 דקות.
  8. שאפו את כדורי העל והרקומבין על ידי השעיה מחדש במאגר כביסה של מ"ל אחד.
  9. העבר נפח מתאים של תאים לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל נפרד ומערבבים עם צבע כחול טריפן. לספור תאים חיים על מיקרוסקופ אור באמצעות hemocytometer.

4. כתמי נוגדנים לציטומטריית זרימה

הערה: נוגדן Sca-1 חייב להיות מצומד ל- APC לפני ניסויי ציטומטריה /FACS של זרימה, בהתאם להוראות היצרן. יש לאמת את הביצועים עבור כל אצווה של מצומדים(איור 2). הטיות סופיות ניתן לאחסן ב 20 aliquots μL ב -20 °C (70 °F) והם יציבים במשך שלושה שבועות. עיין בקובץ המשלים לקבלת פרוטוקול הטיות מלא.

  1. עבור ציטומטריית זרימה, להעביר 1-2 x 106 תאים לכל מדגם ניסיוני לצינור microcentrifuge סטרילי 1.5 מ"ל. העלה את עוצמת הקול עד מ"ל אחד עם חיץ כביסה והנח על הקרח.
  2. עבור כל ניסוי, הגדר את הפקדים הנדרשים הבאים: i) בקרות הכדאיות הלא נגועות ו- ii) כדי לבחור במדויק עבור אוכלוסיית התאים החיים; iii) פלואורסצנטיות מינוס פקד אחד (FMO) על מתלים של תאים בודדים כדי להגדיר שערים מדויקים עבור CD31-/CD45- שברים, FAPs וחברי פרלמנט; ו-4) חרוזי פיצוי מוכתמים בודדים לתיקון דליפת פלואורסצנטיות בין הערוצים.
    1. עבור כל פקדי התא, aliquot 5 x 105 - 1 x 106 תאים ב 1 מ"ל של חוצץ לשטוף בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל ומניחים על קרח.
    2. עבור פקדי חרוזים, הוסף טיפה אחת של חרוזי פיצוי חיוביים (~ 1.5 x 105 חרוזים לכל טיפה) לכל צינור מיקרוצנטריפוגה עם תווית של 1.5 מ"ל. ההשלמה המלאה של הפקדים מופיעה בטבלה 1.
      הערה: אם הניסוי מתבצע בפעם הראשונה, הפעל בקרות מוכתמות אחת עבור כל נוגדן מצומד על מתלים של תאים בודדים (בנוסף לחרוזים לא מוכתמים, בעלי כדאיות, חרוזי פיצוי מוכתמים יחידים ובקרות FMO) כדי להעריך את האוכלוסייה המוכתמת החיובית בתאים ולאמת את חרוזי הפיצוי שנצפו על חרוזי פיצוי. אמת כל הכנה של Sca-1::APC מצומדת זה עתה על-ידי ביצוע כתמים בודדים על חרוזי פיצויים ומתלים של תאים בודדים. עיין בטבלה 1 לקבלת רשימה מלאה של פקדי כתמים.
  3. כדי להכין את בקרת הכדאיות, להעביר מחצית מנפח התאים מן הצינור "הכדאיות" לצינור microcentrifuge חדש 1.5 מ"ל. תייג את הצינור הזה "מת".
  4. לדגור צינור "מת" ב 65 °C (65 °F) במשך 2-3 דקות כדי להרוג את התאים, ולאחר מכן למקם על קרח. לאחר 2-3 דקות, לשלב מחדש תאים מתים עם תאים חיים שנותרו בצינור בקרת הכדאיות. אוכלוסייה זו של תאים תשמש כדי להגדיר ערכי פיצוי (במידת הצורך) ולהגדיר כראוי שערים עבור צבע הכדאיות.
  5. צנטריפוגה השעיות תא יחיד (דגימות ניסיוניות ובקרות) ב 500 x גרם,4 °C (5 דקות).
  6. שאפו את כדורי התאים השעייתיים-על-טבעיים ב-100 מיקרו-אל.
  7. הוסף נוגדנים, בהתאם לדגימה הניסיונית או לשליטה. עיין במטריצת הכתמים (טבלה 2) לקבלת מידע על שילובי נוגדנים וכמויות.
  8. מזיזים בעדינות כל דגימה כדי להבטיח ערבוב מלא ודגרה על קרח בחושך במשך 15 דקות. עבור חרוזי פיצוי, דגירה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 15 דקות.
  9. עבור דגימות ניסיוניות ובקרה של השעיית תא יחיד, העלה את עוצמת הקול ל- 1 מ"ל על-ידי הוספת מאגר כביסה של 900 μL. עבור פקדי חרוזים פיצוי, להעלות את עוצמת הקול ל 1 מ"ל עם 900 μL של 1x PBS.
  10. דגימות מתלה תא יחיד צנטריפוגה ב 500 x גרם,4 °C (5 דקות). צנטריפוגות פיצוי חרוזים פקדים ב 300 x גרם,4 °C (5 דקות).
  11. עבור כל דגימות השעיית תא יחיד, לשאוף ולהשליך supernatant ולהשעות מחדש את גלולה התא במאגר 300 μL לשטוף. עבור פקדי חרוז פיצוי, לשאוף ולהשליך את supernatant, להשעות מחדש את הכדור ב 300 μL של 1x PBS, ולאחר מכן להוסיף 1 טיפה (~ 1.5 x 105) של חרוזי פיצוי שליליים.
  12. שמור את כל דגימות השעיית תא יחיד על קרח תחת רדיד אלומיניום ולהמשיך לזרום רכישה ציטומטרית. בקרות חרוזי פיצוי צריכות להיות מוגנות גם מפני אור אך ניתן לשמור עליהן בטמפרטורת החדר.
    הערה: אם נקודת קצה ניסיונית היא זיהוי FAPs לפי ציטומטריית זרימה, אנא בצע את השלבים 5.1.1-5.1.11. אם נקודת הקצה היא בידוד תאים באמצעות FACS לתרבות וכתמים, אנא בצע את השלבים 5.2.1-5.2.9 וסעיפים 6-7.

5. ציטומטריית זרימה ומיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנטיות (FACS)

  1. ציטומטריית זרימה
    הערה: פרוטוקול זה משתמש cytometer זרימה benchtop מצויד 405 ננומטר, 488 ננומטר, ו 640 ננומטר לייזרים המסוגלים להבחין בו זמנית 10 צבעים שונים. מסנני Bandpass והפלואורכרום הקשורים שלהם המשמשים בפרוטוקול זה הם כדלקמן: 450/50 (כחול SYTOX), 530/30 (FITC), 575/25 (PE) ו- 670/30 (APC). המתחים עבור כל גלאי הם כדלקמן: FSC 700; אס.סי. 475; FITC 360; PE 460; PE-Cy7 600; SyTOX כחול 360; נגמ"ש 570. ודא שאתה מאומן על הפעולה הנכונה של cytometer הזרימה או סדרן התא לפני השימוש.
    1. ודאו שהציטומטר הופעל במשך 10-20 דקות לפני השימוש, ומוכנות על ידי ניקוי רציף עם פתרונות נוזלי נדן נקיים, שטופים ונדן למשך 30-45 כל אחד. סיים בשטיפה עם dH2O. ודא כי נפח נאות של נוזל נדן נוספה למיכל האחסון כדי לשמור על זרימת דגימה נאותה לאורך כל הרכישה.
    2. הגדר את אסטרטגיית הג'יטינג לזיהוי FAPs וחברי פרלמנט כמסווג באיור 3.
      הערה: FAPs וחברי פרלמנט מזוהים על-ידי אסטרטגיית הג'יטינג הירארכית הבאה: i) SSC-A לעומת FSC-A (אזור פיזור תא צד לעומת אזור פיזור תאים קדמיים לתאים נפרדים לעומת פסולת), ii) FSC-W לעומת FSC-H (רוחב פיזור תאים קדימה לעומת גובה פיזור תאים קדימה כדי להפלות סינגלים מכפילים בפרמטר FSC), iii) SSC-W לעומת SSC-H (רוחב פיזור תא צד לעומת גובה פיזור תא צד כדי להפלות סינגלים מכפילים בפרמטר SSC), iv) SSC-A לעומת SYTOX כחול (להבחין בין סינגלים חיים לעומת מתים), v) SSC-A לעומת CD31/45::FITC (כדי לא לכלול CD31+ ו- CD45 + תאים מניתוח נוסף), ו vi) Sca-1::APC לעומת VCAM-1::P E מה- CD31-/CD45- (שושלת; אוכלוסיית לין-) (זיהוי של FAPs וחברי פרלמנט). FAPs מזוהים כאירועי CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- וחברי פרלמנט מזוהים כאירועי CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+.
    3. הפעל תחילה כל בקרת חרוזי פיצוי מוכתמת אחת דרך הציטומטר במהירות נמוכה כדי ליצור ערכי פיצוי המשמשים לתיקון כל דליפת פלואורסצנטיות בין הערוצים. להעריך פיצוי על ידי השוואת אות פלואורסצנטי של כל פקד בגלאי שלה (למשל, SSC-A לעומת APC עבור חרוזים מוכתמים יחידים Sca-1::APC) כמו גם כל גלאים אחרים. צריכות להיות שתי אוכלוסיות נפרדות (אחת עם שלילי ואחת עם אות חיובי) בגלאי המתאים ורק אוכלוסייה שלילית בכל הגלאים האחרים. הגדר את שער העצירה ל-10,000 אירועי חרוזי פיצוי ורשום את הנתונים.
      הערה: בין רכישת כל מדגם, הקפד להפעיל dH2O דרך cytometer במשך 10-20 שניות כדי למנוע זיהום מדגם לדגימה.
    4. התהליך הבא דגימות בקרת קיימא ולא נגועות לשער כראוי על תאים בודדים חיים. הגדר את שער העצירה ל- 10,000 אירועי יחידים ותיעד נתונים.
      הערה: כ 5 דקות לפני הרכישה של כל מדגם השעיה תא יחיד למעט המדגם לא נגוע, להוסיף 1 μL של צבע הכדאיות כחול SYTOX (ריכוז עבודה 300 μM מדולל מ 1 mM פתרון מלאי) לכל מדגם להחליק בעדינות לערבב (ריכוז סופי 1 μM).
    5. לאחר מכן לרכוש את דגימות בקרת השעיית תא יחיד הנותרות. הערכת כל בקרת FMO עם העלילה המתאימה באסטרטגיית הגטינג(איור 3). לדוגמה, להעריך את אות FITC של CD31 + CD45 FMO כדי להבטיח שער CD31-/CD45 מדויק. דוגמה אופטימלית מוצגת באיור 3G. אם הפרוטוקול מבוצע בפעם הראשונה, יש להפעיל פקדים עם כתם יחיד בתאים לפני רכישת פקדי FMO.
    6. להעריך את האות הפלואורסצנטי של כל דגימת תא מוכתם יחיד בגלאי המתאים שלה, כמו גם בכל הגלאים האחרים כדי לאמת פיצוי הולם. הגדר את שער העצירה ל-10,000 אירועי סינגל חיים והקלט בתוכנה.
    7. לאחר שכל הפקדים (השעיות וחרוזים של תאים בודדים) עובדו, הכינו את כל הדגימות הניסיוניות על ידי מדידה ראשונה והקלטת עוצמת הקול של כל דגימה. מדידות אלה ישמשו לכימות מדויק של FAPs וחברי פרלמנט, כמתואר בשלב 5.1.11. לאחר מכן, להוסיף 50 μL של חרוזים ספירה מדויקת לערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה 2-3 פעמים.
    8. הפעל בקצרה את המדגם הניסיוני הראשון כדי לאמת זיהוי של אוכלוסיית חרוזי הספירה. אוכלוסייה זו מופיעה כאשכול קטן ומובהק נפרד מאוכלוסיית התאים הכללית בחלקת FSC-A לעומת SSC-A(איור 3A, תיבה אדומה). צור שער סביב אוכלוסיית החרוזים הספירה. לאחר מכן לרכוש נתונים עבור כל מדגם ניסיוני על ידי עיבוד דרך cytometer על מהירות נמוכה. הגדר את שער העצירה ל-10,000 אירועי חרוזים ותיעד.
      הערה: החוקרים עשויים לזהות חרוזי ספירה לחילופין על ידי הגדרת חלקה נוספת להערכת SSC-A לעומת כל אחד מהגלאים, שכן חרוזי הספירה הם פלואורסצנטיים בכל הגלאים.
    9. לאחר שכל הדגימות עובדו, נקו את הציטומטר באמצעות הפרוטוקולים המתאימים. יצא את כל הנתונים לניתוח.
    10. פתח את כל קבצי הנתונים בתוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה מתאימה. הגדר את אסטרטגיית הגטינג כפי שהיא משמשת לרכישת נתונים כמתואר בשלב 5.1.2. בדוק פקדים באותו סדר כמו ברכישת נתונים (למשל, לא מוכתם, כדאיות, כתם יחיד, ואז פקדי FMO) כדי לאמת מחדש את אסטרטגיית הג'יטינג. לאחר שערים מדויקים נקבעו באמצעות פקדי FMO, להחיל את השערים על כל הדגימות הניסיוניות. יצא נתונים גולמיים כגליונות אלקטרוניים לכימות.
    11. חשב את מספר ה- FAPs וחברי פרלמנט בכל מדגם ניסיוני באמצעות חרוזי הספירה:
      figure-protocol-13150
      כאשר, ספירת תאים שנרכשה היא מספר האירועים המתועדת של אוכלוסיית תאים רלוונטיים (למשל FAPs או חברי פרלמנט) בתוכנת הרכישה; ספירת חרוזים שנרכשה היא מספר האירועים המתועדים של ספירת חרוזים בתוכנת הרכישה; ספירת חרוזים נפח הוא הנפח של פתרון חרוז ספירה הוסיף בשלב 5.1.7; נפח מדגם הוא הנפח של כל מדגם ניסיוני מוכתם לפני הוספת חרוזים ספירה.; ריכוז חרוזים הוא מספר החרוזים לפתרון μL; ערך זה נמצא בגליון הנתונים של המוצר.
  2. FACS - מיון לתרבות תאים
    הערה: פרוטוקול זה מבצע FACS על סדרן תאים מצויד 4 לייזרים (UV, סגול, כחול, אדום) המסוגל להבחין בו זמנית 11-14 צבעים. פעל בהתאם להכתמת הדגימה הניסיונית (סעיף 4) ופרוטוקול ציטומטריית הזרימה, למעט שלבים 1 עד 3 המסווגים להלן, כדי למטב את זרימת העבודה של FACS:
    1. הגדל את ריכוז התאים בדגימות הניסיוניות שיש למיין ל- 7 x 106 תאים/מ"ל כדי ליצור תשואות חזקות של FAPs וחברי פרלמנט.
    2. כדי להסביר את העלייה המשמעותית בריכוז התאים, להכפיל את כל ריכוזי הנוגדנים בדגימות הניסוי להיות ממוין.
    3. לעבד את דגימות התא המוכתם הסופי באמצעות מכסה מסננת תא 40 מיקרומטר המודבקת לצינור פוליסטירן 5 מ"ל מיד לפני המיון כדי להפחית את גושי התא ולהגדיל את תשואות המיון.
    4. לאסוף FAPs עכברוש יחיד, חי וחברי פרלמנט ישירות מממיין התא לתוך צינור איסוף פוליפרופילן 5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של סטרילי, 100% סרום בקר עוברי (FBS). שמור תאים על קרח עד המיון הושלם.
      הערה: אם אתם מבצעים FACS במיקום מחוץ לאתר, העבירו את כל התאים הממוינים על קרח ובמכל מאובטח ומכוסה.
    5. עבודה בארון בטיחות ביולוגי סטרילי (BSC), להביא נפח של תאים ממוינים עד 7 מ"ל עם מדיית צמיחה מתאימה (למשל, מדיה צמיחה FAP (FAP GM) עבור FAPs ממוינים, ומדיית צמיחה MP (MP GM) עבור חברי פרלמנט ממוינים; ראה קובץ משלים למתכונים) וצנטריפוגה ב 500 x g, 4 °C במשך 7 דקות כדי להסיר כמה שיותר חיץ כביסה שיורית ככל האפשר.
    6. כדורי resuspend ב 1 מ"ל של מדיה צמיחה מתאימה צלחת לתוך צלחת 12 טוב המכיל סטרילי, מצופה קולגן 12 מ"מ זכוכית מכסה / גם עבור חיסונים הבאים (ראה סעיף 6).
      הערה: אם מכתים אימונוציטוכימיה קולגן, לוחות ממוינים תאים לתוך צלחת 12 היטב המכילה כיסוי זכוכית סטרילי, מצופה למינין 12 מ"מ / טוב, במקום מצופה קולגן. אם נדרשים ניסויי אימונוציטוכימיה של אבות מבודדים באופן מיידי, FAPs זרעים וחברי פרלמנט בצפיפות של 15,000 תאים לס"מ2 ולהמשיך ישירות לשלב 6.1. עבור תרביות ארוכות טווח כדי לגרום בידול אבות, FAPs זרע בצפיפות של 5,000 תאים לס"מ2, וחברי פרלמנט בצפיפות של 7,500 תאים לס"מ2.
    7. דגירה תאים ב 37 °C ו 5% CO2 באינקובטור תרבית התא. אחרי 72 שעות בתרבות, לשנות חצי מהתקשורת. שנה מדיה באופן מלא כל 2-4 d לאחר מכן.
    8. כדי לגרום להתפתחות מיוצייט, החליפו תרבויות חברי פרלמנט לבידול MP (MD) מדיום ביום התשיעי לתרבות. כדי לגרום לאדיפוציטים, החלף תרביות FAPs למדיום בידול אדיפוגני של FAP (AD) ביום העשירי של התרבות.
    9. כדי לגרום לפירוגנזה, FAPs עשויים לעבור למדיית בידול פיברוגני (FD) בזמנים משתנים במהלך התרבות, או לחילופין, עשויים להיות ייזרעים ישירות למדיית FD לאחר בידוד (שלב 5.2.6) (ראה קובץ משלים עבור כל מתכוני המדיה).

6. אימונוציטוכימיה של FAPs תרבותיים וחברי פרלמנט

  1. כדי לאמת מיון תאים ולהדגים טוהר של FAPs ותרבויות חברי פרלמנט, חיסונים עם סמנים ספציפיים מסוג התא כולל PDGFRα (סמן FAPs), Pax-7 (גזע שריר [לווין] סמן תא), חלבון ספציפי פיברובלסט (FSP-1, סמן פיברובלסט), Perilipin-1 (פלין-1, סמן אדיפוציט), קולגן סוג 1 (Col1a1, אינדיקטור של פיברוזיס), שרשרת כבדה מיוסין (MHC, סמן מיוציטים בוגר).
    1. עבור חיסון של תאים ממוינים טריים, צנטריפוגה צלחת 12-well ב 200 x g במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר כדי להקל על הדבקות של תאים כיסוי / טוב. צעד זה אינו הכרחי לתרבויות ארוכות טווח. הסר מדיית תרבות.
    2. עבור חיסונים עם FSP-1, לתקן תאים עם 1 מ"ל 100% מתנול (MeOH) במשך 2 דקות ב 4 °C (70 °F). אם אתם מחסן עבור PDGFRα, Plin-1, Pax7 או Col1a1, תקן את תרביות התאים עם 1 מ"ל 4% PFA ב-1x PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. MHC חיסונים סובלים או קבוע.
      הערה: עבור תאים קבועים מתנול, דלג על שלב 6.2 והמשיך לשלב 6.3.
  2. שאפו 4% PFA ושטפו במהירות תרביות תאים 3-4 פעמים עם PBS 1x. הוסף 1 מ"ל של 100 mM גליצין ב 1x PBS ודגר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאימת PFA שיורית. שאפו ושטפו 1-2 פעמים עם PBS 1x.
    הערה: תאים ניתן להשאיר בשלב זה 2 מ"ל של 1x PBS, עטוף בסרט הדבקה ומאוחסן ב 4 °C (7-10 ימים לכל היותר.
  3. לאחר הכביסה, הוסיפו 1 מ"ל של טריטון-X 0.1% ב-1x PBS ודגרו במשך 20 דקות כדי לפרוע לקרום התא.
  4. לשטוף בארות 2-3 פעמים עם 1-2 מ"ל של 1x PBS ואז לחסום תאים עם 1 מ"ל של 1x PBS + 3% BSA לבאר עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.
  5. Pipette 80 μL של נוגדן ראשוני מדולל ב 1x PBS + 3% BSA (PDGFRα 1:100, Pax7 מסודר, FSP-1 1:50, פלין-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 מיקרוגרם / מ"ל) על פיסת parafilm מודבק למיכל נייד. בעזרת מלקחיים דקים סטריליים, הרימו בזהירות את הכיסוי מהבאר והפוך לירידה של תמיסה נוגדנית. כיסויי דגירה עם שתי חתיכות רטובות של מגבת נייר ומיכל כיסוי בסרט פלסטיק כדי למנוע אידוי של פתרון הנוגדנים. דגירה לילה ב 4 °C (5 °F).
    הערה: כתמים מכסים מתוך הבאר משתמש פחות נוגדן (~ 80 μL) מאשר כתמים בתוך הבאר (500 מינימום μL).
  6. ביום 2, להשאיר כיסויים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות כדי להתחמם. באמצעות מלקחיים בזהירות ימינה ולהעביר כיסויים בחזרה לבארות שלהם (תאים מול למעלה) ולשטוף 2-3 פעמים עם 1-2 מ"ל של 1x PBS במשך 2 דקות כל אחד כדי להסיר נוגדן ראשוני ככל האפשר.
  7. באמצעות אותה טכניקת הכתמה כמו עם כתמי נוגדנים ראשוניים, כתם תאים עם אנטי ארנב עז אלכסה פלור 488 נוגדן משני (1:400) כדי לזהות FSP-1, פלין-1, Col1a1, או PDGFRα ו עיזים נגד עכבר אלכסה פלור 555 נוגדן משני (1:300) כדי לזהות MHC או Pax-7. לדגור על תאים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ולשמור על תאים מוגנים מפני אור.
  8. להחזיר תאים לבאר ולדגירה תאים עם Hoechst (1:10,000) במשך 2-4 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף תאים עוד 2-3 פעמים עם 1x PBS במשך 2 דקות כל אחד כדי להסיר עודף Hoechst.
  9. הרכבה מכסה על מגלשות זכוכית באמצעות מדיום הרכבה פלואורסצנטי אנטי-דהוי ומשאירים שקופיות להתייבש למשך הלילה בחושך בטמפרטורת החדר. יש לאחסן כיסויים רכובים ב-4 מעלות צלזיוס בחושך.

7. שמן אדום O (ORO) כתמים של FAPs תרבותי וחברי פרלמנט

  1. בצע מכתים ORO על תאים שאינם מחלחלים, כמו permeabilization של קרום התא יכול לגרום כתמים לא ספציפיים / לא רצויים של סוגי תאים לא אדיפוגניים. לפני תחילת הכתמים, להכין מלאי עבודה ORO (ראה קובץ משלים למתכון) ודגר בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
  2. לאחר 20 דקות, לסנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר כדי להסיר כל אגרגטים לא פתורים.
  3. שאפו מדיה מבאר והוסיפו 1 מ"ל של 10% פורמלין חוצץ נייטרלי (10% NBF). דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: השפעה על התאים עלולה לגרום להרמה מהבאר/כיסוי. יש לדאוג בעת שאיפה / הוספת פתרונות.
  4. שאפו והוסיפו 1 מ"ל של 10% NBF טריים ודגרה לפחות שעה בטמפרטורת החדר.
    הערה: ניתן להפסיק את הפרוטוקול בשלב זה, מכיוון שניתן להשאיר תאים ב- 10% NBF למשך הלילה.
  5. לשטוף במהירות את בארות פעם אחת עם 1 מ"ל של 60% איזופרופנול, ולאחר מכן לשאוף ולאפשר בארות להתייבש לחלוטין (כ 2 דקות).
  6. הוסף 400 μL שמן אדום O עובד מלאי לבאר ודגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, הקפדה להימנע כל צינור כל ORO על קירות הצלחת.
  7. הסר את כל O אדום שמן במהירות לשטוף את הבאר 4 פעמים עם dH2O.
    הערה: אם בארות מוכתמות מכילות כיסויים, הר באותה טכניקה כמתואר בשלב 6.9.
  8. תמונה רכובה על כיסויים או הבאר המוכתמת באמצעות מיקרוסקופ בהיר.

8. כתמי רקמות של מקטעי גסטרוקנמיוס חולדה מנוגדים ומוקשים

  1. פירוסיריוס אדום (PSR)
    1. בצע כתמי PSR על 5 מיקרומטר עבה, פורמלין קבוע פרפין מוטבע (FFPE) חולדה גסטרוקנמיוס קטעים היסטולוגיים כפי שתואר בעבר40.
  2. שמן אדום O (ORO)
    1. תקן 5 מיקרומטר עבה איזופנטן חולדה קפואה גסטרוקנמיוס קטעים היסטולוגיים ב 4% PFA במשך 10 דקות, דגירה ב 60% אלכוהול איזופרופיל במשך 1 דקות.
    2. כתם עם מלאי עבודה ORO במשך 12 דקות. דגירה ב 60% אלכוהול איזופרופיל במשך 1 דקות, לשטוף במשך 10 דקות ב dH2O. הר על כיסויים באמצעות מדיה הרכבה מסיס במים.
  3. סקא-1 ורקמת למינין אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית (IHC)
    1. בצע IHC פלואורסצנטי על 5 מיקרומטר עובי איזופנטן קפוא חולדה גסטרוקנמיוס קטעים היסטולוגיים.
    2. לחות דגימות ב 1x PBS במשך 5 דקות, לתקן 4% PFA במשך 10 דקות ולאחר מכן לדגירה דגימות פתרון חסימת רקמה אם (ראה קובץ משלים)במשך 90 דקות.
    3. דגירה עם נוגדן ראשי נגד Sca-1 (1:500) מדולל ב-1x PBS + 0.05% טווין ב-4 מעלות צלזיוס בלילה.
    4. ביום 2, לשטוף שלוש פעמים ב 1x PBS + 0.05% Tween במשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן דגירה נגד ארנב עז אלכסה פלור 555 (1:500) עבור 1 שעה.
    5. לשטוף שוב (כמו קודם), דגירה עם פתרון חסימה עבור 1 שעה, ולאחר מכן להוסיף נוגדן ראשי אנטי למינין (1:500) מדולל ב 1x PBS + 0.05% Tween עבור 1 שעה.
    6. לשטוף שוב (כמו קודם), ואז לדגור על עז נגד ארנב אלכסה פלור 488 (1:500) עבור 1 שעה (עבור למינין).
    7. לשטוף שוב (כמו קודם) ואז לדגור ב DAPI (1:10,000) במשך 4 דקות. יש לשטוף ולהרכיב על כיסויים באמצעות מדיום נגד עמעום.

תוצאות

זיהוי FAPs וחברי פרלמנט באמצעות ציטומטריית זרימה באמצעות לוח נוגדנים חדשני כולל Sca-1 ו- VCAM-1
אסטרטגיית הגינג לזיהוי FAPs בשריר החולדה מבוססת על פרוטוקולי ציטומטריית זרימה בעכבר29, אשר שער על CD31 (אנדותל) ו CD45 (hematopoietic) תאים חיוביים (המכונה שושלת ה...

Discussion

פרוטוקול בידוד FAPs מותאם ומאומת לשרירי חולדות חיוני לחוקרים המעוניינים לחקור מודלים לפציעות שאינם אפשריים בעכבר מסיבות ביולוגיות או טכניות. לדוגמה, עכברים אינם מודל בעלי חיים אופטימלי שבו לחקור פגיעות מקומיות כרוניות, או ניווניות כגון denervation לטווח ארוך. מבחינה ביולוגית, תוחלת החיים הקצרה...

Disclosures

למחברים אין קונפליקטים לחשוף.

Acknowledgements

ברצוננו להודות למתקני הליבה של ציטומטריית הזרימה באוניברסיטת אוטווה ולמרכז המחקר קינן למדעים ביו-רפואיים (KRC), לבית החולים סנט מייקלס בריאות מאוחדת טורונטו על המומחיות וההדרכה שלהם באופטימיזציה של פרוטוקול ציטומטריית הזרימה / FACS המוצג בכתב יד זה. עבודה זו מומנה על ידי רפואה על ידי קרן עיצוב רעיונות חדשים 2018 (MbDNI-2018-01) ל- JB.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL Polypropylene Round-Bottom TubeFalcon352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer CapFalcon352235
10 cm cell culture dishesSarstedt83.3902
12-well cell culture plateThermoFisher130185
12 mm glass coverslips, No.2VWR89015-724
10 mL SyringeBeckton Dickenson302995
15 mL centrifuge tubesFroggaBio91014
20 gauge needleBeckton Dickenson305176
25mL Serological pipetteSarstedt86.1685.001
40µm cell strainerFisher Scientific22363547
50mL centrifuge tubesFroggaBioTB50
AbC Total Antibody Compensation Beads ThermoFisherA10497
Ammonium Chloride, Reagent GradeBioshopAMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µgBiotium92307
Aquatex Aqueous Mounting MediumMerck108562
Biolaminin 411 LNBiolaminaLN411
Bovine Serum Albumin (BSA)BioshopALB001
Calcium ChlorideBioshopCCL444.500
Collagenase Type IIGibco17101015
CountBright Plus Absolute Counting BeadsThermoFisherC36995
DexamethasoneMillipore SigmaD4902
DispaseGibco17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Gibco11995-065(+)4.5 g/L D-Glucose
(+)L-Glutamine
(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTAFisherScientificS311
FACSClean SolutionBeckton Dickenson340345
FACSDiva SoftwareBeckton Dickenson--
FACSRinse SolutionBeckton Dickenson340346
Fetal Bovine SerumSigmaF1051
Flow Cytometry Sheath FluidBeckton Dickenson342003
FlowJo SoftwareBeckton Dickenson--
Fluorescent Mounting MediumDakoS302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibodyInvitrogenA21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibodyInvitrogenA11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibodyInvitrogenA21429
Goat SerumGibco16210-064
Ham's F10 MediaThermoFisher 11550043(+) Phenol Red
(+) L-Glutamine
(-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)Multicell311-513-CL
Heat Inactivated Horse SerumGibco26050-088
HemocytometerReichertN/A
HEPES, minimum 99.5% titrationSigmaH3375
Horse SerumThermoFisher16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1)Cell Signaling8915LF
Humulin RLillyHI0210
IBMXMillipore SigmaI5879Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
IsopropanolSigmaI9516Also known as 2-propanol
Lewis Rat, FemaleCharles River Kingston004 (Strain Code)200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop CytometerBeckton Dickenson--
MicrocentrifugeEppendorfEP-5417R
MoFlo XDP Cell SorterBeckman Coulter--
Mouse Anti-CD31::FITC AntibodyAbcamab33858Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC AntibodyBiolegend202205Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE AntibodyBiolegend200403Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/AAlso known as MF20
Mouse Anti-Pax7 AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 %SigmaHT501128
Oil Red OMillipore SigmaO0625
PE-Cy7 Conjugation KitAbcamab102903
Penicillin-StreptomycinSigma P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)Gibco10010-023(-)Calcium Chloride
(-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent GradeBioshopPBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) AntibodyInvitrogenMA5-32347FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 AntibodyAbcamab203254
Rabbit Anti-Laminin AntibodySigmaL9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 AntibodyAbcamab3526
Rabbit Anti-Sca-1 AntibodyMillipore SigmaAB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I AntibodyAbcamab260043Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha AntibodyAbcamab203491
Recombinant Human FGF-basicGibcoPHG0266
Sodium AzideSigmaS2002
Triton-X-100Fisher ScientificBP151
TroglitazoneMillipore SigmaT2573
Tween-20BioshopTWN510

References

  1. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12, 153-163 (2010).
  2. Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
  3. Uezumi, A., Ikemoto-Uezumi, M., Tsuchida, K. Roles of nonmyogenic mesenchymal progenitors in pathogenesis and regeneration of skeletal muscle. Frontiers in Physiology. 5, 1-11 (2014).
  4. Biswas, A. A., Goldhamer, D. J. FACS fractionation and differentiation of skeletal-muscle resident multipotent Tie2+ progenitors. Methods in Molecular Biology. 1460, 255-267 (2016).
  5. Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1-10 (2019).
  6. Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46 (2), 135-143 (2018).
  7. Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
  8. Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. Journal of Cell Science. 124 (21), 3654-3664 (2011).
  9. Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
  10. Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  11. Madaro, L., et al. Denervation-activated STAT3-IL-6 signalling in fibro-adipogenic progenitors promotes myofibres atrophy and fibrosis. Nature Cell Biology. 20 (8), 917-927 (2018).
  12. Heredia, J. E., et al. Type 2 innate signals stimulate fibro/adipogenic progenitors to facilitate muscle regeneration. Cell. 153 (2), 376-388 (2013).
  13. Fiore, D., et al. Pharmacological blockage of fibro/adipogenic progenitor expansion and suppression of regenerative fibrogenesis is associated with impaired skeletal muscle regeneration. Stem Cell Research. 17 (1), 161-169 (2016).
  14. Kang, X., et al. Interleukin-15 facilitates muscle regeneration through modulation of fibro/adipogenic progenitors. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 1-11 (2018).
  15. Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., Mcmillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e2782 (2011).
  16. Iyer, S. R., Valencia, A. P., Hernández-Ochoa, E. O., Lovering, R. M. In vivo assessment of muscle contractility in animal studies. Methods in Molecular Biology. 1460, 293-307 (2016).
  17. Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487 (2016).
  18. Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50183 (2013).
  19. Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. (71), e50036 (2013).
  20. Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696 (2019).
  21. Iohom, G., et al. Long-term evaluation of motor function following intraneural injection of ropivacaine using walking track analysis in rats. British Journal of Anaesthesia. 94 (4), 524-529 (2005).
  22. Brown, C. J., et al. Self-evaluation of walking-track measurement using a sciatic function index. Microsurgery. 10 (3), 226-235 (1989).
  23. Bozkurt, A., et al. CatWalk gait analysis in assessment of functional recovery after sciatic nerve injury. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 91-98 (2008).
  24. Deumens, R., Jaken, R. J. P., Marcus, M. A. E., Joosten, E. A. J. The CatWalk gait analysis in assessment of both dynamic and static gait changes after adult rat sciatic nerve resection. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 120-130 (2007).
  25. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 2018, 1-11 (2018).
  26. Jensen, A. R., et al. Neer Award 2018: Platelet-derived growth factor receptor α co-expression typifies a subset of platelet-derived growth factor receptor β-positive progenitor cells that contribute to fatty degeneration and fibrosis of the murine rotator cuff. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 27 (7), 1149-1161 (2018).
  27. Mosich, G. M., et al. Non-fibro-adipogenic pericytes from human embryonic stem cells attenuate degeneration of the chronically injured mouse muscle. JCI Insight. 4 (24), (2019).
  28. Lee, D., et al. HMGB2 is a novel adipogenic factor that regulates ectopic fat infiltration in skeletal muscles. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  29. Low, M., Eisner, C., Rossi, F. Fibro/Adipogenic Progenitors (FAPs): Isolation by FACS and Culture. Muscle Stem Cells: Methods and Protocols. , 179-189 (2017).
  30. Giuliani, G., et al. SCA-1 micro-heterogeneity in the fate decision of dystrophic fibro/adipogenic progenitors. Cell Death and Disease. 12 (1), 1-24 (2021).
  31. Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
  32. Upadhyay, G. Emerging role of lymphocyte antigen-6 family of genes in cancer and immune cells. Frontiers in Immunology. 10, 819 (2019).
  33. Boscolo Sesillo, F., Wong, M., Cortez, A., Alperin, M. Isolation of muscle stem cells from rat skeletal muscles. Stem Cell Research. 43, 101684 (2020).
  34. Ciaramitaro, P., et al. Traumatic peripheral nerve injuries: Epidemiological findings, neuropathic pain and quality of life in 158 patients. Journal of the Peripheral Nervous System. 15 (2), 120-127 (2010).
  35. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of upper and lower extremity peripheral nerve injuries in a population of patients with multiple injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45 (1), (1998).
  36. Malik, S. Traumatic peripheral neuropraxias in neonates: A case series. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (10), 10-12 (2014).
  37. Smith, B. W., Daunter, A. K., Yang, L. J. S., Wilson, T. J. An update on the management of neonatal brachial plexus palsy-replacing old paradigms a review. JAMA Pediatrics. 172 (6), 585-591 (2018).
  38. Rebolledo, D. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle fibrosis is mediated by CTGF/CCN2 independently of TGF-β. Matrix Biology. 82, 20-37 (2019).
  39. Walls, P. L. L., McRae, O., Natarajan, V., Johnson, C., Antoniou, C., Bird, J. C. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  40. Yuen, D. A., et al. Culture-modified bone marrow cells attenuate cardiac and renal injury in a chronic kidney disease rat model via a novel antifibrotic mechanism. PLOS One. 5 (3), 9543 (2010).
  41. Fukada, S. I. The roles of muscle stem cells in muscle injury, atrophy and hypertrophy. Journal of Biochemistry. 163 (5), 353-358 (2018).
  42. Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 1-11 (2017).
  43. Chapman, M. A., Mukund, K., Subramaniam, S., Brenner, D., Lieber, R. L. Three distinct cell populations express extracellular matrix proteins and increase in number during skeletal muscle fibrosis. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 312 (2), 131-143 (2016).
  44. Hillege, M., Galli Caro, R., Offringa, C., de Wit, G., Jaspers, R., Hoogaars, W. TGF-β regulates Collagen Type I expression in myoblasts and myotubes via transient Ctgf and Fgf-2 Expression. Cells. 9 (2), 375 (2020).
  45. Kafadar, K. A., Yi, L., Ahmad, Y., So, L., Rossi, F., Pavlath, G. K. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
  46. Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50657 (2013).
  47. Carlson, B. M. The biology of long-term denervated skeletal muscle. European Journal of Translational Myology. 24 (1), (2014).
  48. Kennedy, E., et al. Embryonic rat vascular smooth muscle cells revisited - A model for neonatal, neointimal SMC or differentiated vascular stem cells. Vascular Cell. 6 (1), 1-13 (2014).
  49. Pannérec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development (Cambridge). 140 (14), 2879-2891 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

172FACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved