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要約

このプロトコルは、ラット骨格筋から線維-異量体形成前駆体(FAPs)および筋原性前駆腫(MP)を単離する方法を概説する。筋肉損傷モデルにおけるラットの利用は、分析のための萎縮性筋肉からの組織の可用性の増加と、自由に動く動物の筋力と歩行を評価するための検証された方法のより大きなレパートリーを提供する。

要約

線維-異形成前駆体(FAPs)は、筋形成前駆腫(MP)と共に、筋恒常性、傷害、および修復において重要な役割を果たす骨格筋の中に存在する間質細胞である。FAPsの同定および単離のための現在のプロトコルは、フローサイトメトリー/蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用し、これまでの 生体内機能 を評価する研究はマウスのみで行われてきた。ラットの大きな固有のサイズは、骨格筋傷害モデルにおけるFAPsのより包括的な分析を可能にします, 特に重度の萎縮性筋肉で、または研究者が複数の下流アッセイを行うためにかなりの組織質量を必要とする場合.ラットはさらに、動物の沈下や犠牲を必要としない筋肉機能アッセイの選択肢を増やし、連続評価を可能にすることで罹患率と動物の使用を最小限に抑えます。マウスに最適化されたフローサイトメトリー/FACSプロトコルは、種特異的であり、特に市販の抗体の特性によって制限される。それらはラットまたは非常に線維性の筋肉からFAPsを分離するために最適化されていません。.表面マーカーCD31、CD45、Sca-1、およびVCAM-1の微分発現に依存して、健康なラット骨格筋と両方からのFAPsとMPの同定と分離のためのフローサイトメトリー/FACSプロトコルが開発された。ラット特異的として、フローサイトメトリー検証された一次抗体は厳しく制限され、Sca-1を標的とする抗体の社内コンジュゲーションが行われた。このプロトコルを用いて、Sca-1の結合が成功することが確認され、FACS分離されたFAPsおよびMPの細胞培養および免疫染色によって、FAPsおよびMPのフローサイトメトリック同定が検証された。最後に、新しいFAPsのタイムコースを長期(14週間)ラット脱樹モデルで報告します。この方法は、研究者が新しい動物モデルでFAPsを研究する能力を提供する。

概要

線維-異形成前駆細胞(FAPs)は、筋肉恒常性、修復、再生に重要な役割を果たす骨格筋中の常駐多能前駆細胞の集団であり、逆に、筋肉損傷に対する病理学的応答を媒介する。その名の通り、FAPはもともと線維芽細胞および脂肪細胞1に分化する可能性のある前駆体集団として同定され、慢性傷害および疾患における骨格筋の線維脂肪浸潤の主要なメディエーターであると言われた。さらなる研究は、FAPsが骨形成および軟骨形成の追加可能であることを明らかにした2、3、4。したがって、それらは間葉または間質前駆子3、5、6、7、8として文献でより広く公示されている。急性骨格筋損傷において、FAPsは、活性化された筋肉衛星細胞およびそれらの下流筋性前駆細胞(MP)の対応する1、9、10に有利な環境を提供するために一過性増殖することによって再生筋形成を間接的に助ける。正常な再生と並行して、FAPsはアポトーシスを受け、その数値をベースラインレベル1、9、10、11に戻します。対照的に、慢性筋損傷では、FAPはプロアポトーシス信号を上書きし、持続性9、10、11および異常な筋肉修復をもたらす。

IN Vivo研究では、現在までに1、7、9、10、11、12、13、14までのマウス動物モデルを利用した、FAPsが筋肉応答を媒介する細胞および分子機構を評価する。遺伝子組み換えマウスはこれらの分析に使用するための強力なツールですが、動物の小さなサイズは、外傷性脱化などの筋肉萎縮が深遠である長期的な局所的な傷害モデルでの研究のための組織の可用性を制限します。さらに、筋力と身体機能の測定には、ex vivoまたはマウスの終了を必要とするその際の測定、または筋肉収縮性能15、16、17、18、19、20の評価を可能にする手術および/または全身麻酔薬を必要とするインビボ法が必要です。 .ラットでは、十分に検証され、世界的に利用された筋肉機能分析、歩行分析などのより複雑な運動行動(例えば、坐骨機能指数、CatWalk分析)の分析に加えて存在し、目を覚まし、動物21、22、23、24で起こって行われる.これはさらに動物実験における最小の罹患率の原理、および使用される研究動物の数を最適化する。ラットはそれによって、FAPsの調査官に、タンパク質および細胞分析のためのより大きな負傷した筋肉容積の追加の柔軟性および警報動物における筋肉複合体静的および動的機能活性および行動の連続評価を行う能力を提供する。

FAPsは、フローサイトメトリーと蛍光活性化細胞分類(FACS)を使用して、主に全筋サンプルから同定され、単離されています。これらは、サイズ、粒度、および細胞表面または細胞内マーカー25の特異的組み合わせなどの特徴に基づいて複数の特定細胞集団を同定することができるレーザーベースのアッセイである。これは、骨格筋などの器官系の研究において非常に有利であり、恒常性および再生は複雑で多因子的なプロセスであり、多くの細胞タイプによって調整される。精細な研究では、マウス骨格筋1のフローサイトメトリック法を使用して、MPと同様にFAPsを同定した。彼らは、内皮(CD31)、造血薬(CD45)、または筋原性(Integrin-α7[ITGA7])由来の細胞に特異的な表面抗原を欠いていたが、間葉系幹細胞マーカーSca-1(幹細胞抗原1)1および線維化細胞細胞に分化された表面抗原を欠いていたため、FAPsが本質的に間葉系であることを実証した。他の研究は、代替幹細胞マーカーの発現に基づいて筋肉中間葉系前駆細胞の分離に成功したことを示した、血小板由来増殖因子受容体α(PDGFRα)2、7、8およびさらなる分析は、これらは、FAPs3と同じ細胞集団である可能性が高いことを明らかにした。正の選択マーカーとしてSca-1またはPDGFRαのいずれかを使用してフローサイトメトリーで一般的に識別される1,9, 10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 .PDGFRαの使用はヒト組織に対して優先的であるが、マウスSca-1の直接的なヒトホモロゲーとしては、まだ32を同定していない。さらに、他の細胞表面タンパク質は、MP(例えば、VCAM−1)のマーカーとして報告されており、FAPsの分離33の間に筋形成系統の細胞の指標としてITGA7に代わる可能性がある。

フローサイトメトリー/FACSは骨格筋1、9、10、11、13、29におけるFAPsの役割と病原性ポテンシャルを研究するための強力な方法論であるが、それは技術的に必要な試薬の特異性と最適化によって制限される。フローサイトメトリック同定とFAPsの単離はマウス動物モデル1、9、10、11、29で開発され、実施されているため、他のモデル生物の中でのFAPsの研究を希望する研究者にとっては課題となっています。処理対象の最適な組織サイズや、試薬や抗体の特異性や入手可能性など、多くの要因は、使用する種によって異なります。

新しい動物モデルでFAPsを研究するための技術的な障壁に加えて、それらは主に急性の有毒な設定で研究されています - 通常、筋肉内化学注射または心毒を介して。FAPsの長期的なダイナミクスの評価は、主にデュシェンヌの筋ジストロフィーの評価に限定され、mdxマウスモデル9、10、11、および肩筋筋症に対して同時腱管切れと脱用が行われる大規模なローテーターカフ涙などの組み合わせ筋損傷のモデル.慢性外傷性脱児の唯一の侮辱に対するFAPsの反応は、重工業、農業、および出生時外傷(上腕神経叢損傷)34、35、36、37で重大な罹患率を有する職場における事故において一般的に起こり、顕著な罹患率を有する、しばしば短期間の期間11、38に限定される。

ラットの腫性および線維性骨格筋の健康から、また重度の萎縮性および線維性骨格筋から、FAPおよびMPを同定し、単離する方法について述べる。まず、組織消化およびフローサイトメトリー染色プロトコルを用いたCD31-/CD45-/Sca-1-FAおよびCD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+MPの同定が実証され、その後の知見の検証は、FACS分離細胞の培養および免疫細胞化学染色を通じて行われる。この方法を用いて、ラットにおける長期隔離された脱用傷害モデルにおける新規のFA時間コースも報告する。

プロトコル

この議定書を実施する調査官は、地元の動物倫理委員会/ケア委員会の許可を受ける必要があります。すべての動物の仕事は、セントマイケルズ病院ユニティヘルストロント動物ケア委員会(ACC #918)によって承認され、カナダ動物ケア評議会(CCAC)が定めたガイドラインに従って行われました。フローサイトメトリープロトコルの概略を 図1に示します。下流のアプリケーションが FACS とその後の細胞培養である場合、すべてのステップは適切な無菌技術で完了する必要があります。

1. 筋肉の収穫

  1. 局所の生体および動物倫理委員会のガイドラインに従って適切な麻酔薬と犠牲を使用してラットを麻酔します。このプロトコルは、例として、成人雌ルイスラット(200〜250g)から胃頭筋を収穫する。ラットを2-3%イオブルランを用いて麻酔し、T61の心臓内注射によって屠殺した。
  2. 動物が犠牲になったら、後肢全体を剃って筋肉の位置を容易にし、収穫された組織の毛皮汚染を最小限に抑えます。
  3. 無菌メスを使用して、皮膚に2つの切開を行います:足首関節の円周の周りの最初の周りと足首から股関節への後肢の内側の正中線上の2番目。
  4. 皮膚と表面筋層を剥離して、大腿骨の内側および内側顆に由来し、アキレス腱で挿入する基礎となる胃腸炎を明らかにする。
  5. 鈍い解剖を使用して胃腸を周囲の組織から分離し、腱でのみ筋肉を取り扱い、クラッシュ傷害を避ける。
  6. 鋭いはさみでアキレス腱をできるだけ遠位に移すことによって、胃腸を挿入から分離する。切断したら、鉗子でアキレス腱をつかみ、下敷きの骨から胃腸を静かに剥がします。それでも筋肉を片手に鉗子で保持し、胃食道の2つの起源を見つけ、内側と内側の大腿骨顆で切断する。
  7. できるだけ多くの血液を除去するために、無菌のガーゼに対して優しく切除された胃腸をブロットします。無菌表面の筋肉をトリミングし、余分な結合組織だけでなく、アキレス腱を削除します。
  8. 重量ボートに筋肉を入れ、精密スケールを使用して重量を量る。このプロトコルは、200〜600 mgの範囲の湿った体重で筋肉を消化するように最適化されています。オペレータは、必要に応じて、他の下流アッセイのために過剰な収穫された組織を細分化することができる。
  9. さらに、流量サイトメトリーに使用する収穫した筋肉をさらに3~4個(約1〜2cm3)に分け、氷冷1x PBSに沈水します。すべてのサンプルが収穫されるまで氷の上で冷たく保ちます。

2. 筋肉の消化

  1. PBSから筋肉を取り除き、無菌10cm細胞培養皿に入れます。そっと裂け、そして、部分がおよそ3-4 mm3になるまで鉗子でティッシュを軽く引き裂き、できるだけ多くの結合組織を取り除く。十分にみじん切りにしたら、6 mL DMEM + 1% ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を含む無菌50 mL円錐状チューブに移します。
  2. コラゲナーゼII溶液(ストック濃度4800 U/mL)の365 μLに300 mMCaCl2溶液の10 μLを加え、コラゲナーゼ酵素を活性化します。活性化コラゲラーゼII溶液を、組織スラリーを含む50 mL円錐管に加えます。最終的なコラゲローゼII濃度は250 U/mLです。
  3. 37°C、240 x gで1時間シェーカーにチューブをインキュベートし、15分ごとに手動で旋回して、チューブの側面に付着した組織を取り除くようにします。
  4. 1時間後、シェーカーからチューブを取り出し、サンプルごとに100 μL(4,800 U/mL)と50μLのディスパーゼ(4.8 U/mL)を加えます。
  5. 溶液が均質になるまで血清学的ピペットを15〜20回使用したピペットサンプル。複数のサンプルを処理する場合は、サンプルのクロスコンタミネーションを避けるために、各サンプルに個別の滅菌ピペットを使用してください。
  6. 37°Cと240 x gで30分間シェーカーに再びインキュベートします。15分後、サンプルを手で振って、チューブの側面から付着組織を外します。

3. 単一細胞懸濁液の生成

  1. 10 G針の10 mLシリンジを通してサンプルをゆっくりと剪断し、10サイクルで使用します。
    注:1サイクルは、注射器に筋肉溶液を取り込み、チューブに戻す必要があります。過度の泡立ちが細胞死を余しにする可能性が高い39の原因となるため、剪断をゆっくりと完了して気泡を最小限に抑えるようにしてください。
  2. 40 μmのセルストレーナーを無菌50 mL円錐形チューブに置き、5 mL DMEM + 10% FBS + 1% P/Sを湿潤させます。
  3. ピペット1 mLのサンプルを細胞ストレーナーを介して一度に。
  4. 10%FBSと1%P/SでDMEMをストレーナーでピペットして、チューブ内の総容積を25mLにして、細胞ストレーナーを洗浄します。
  5. サンプル25 mLを15°Cの2つの15 mL円錐形管と遠心分離機に均等に分割し、400 x g で15分間分します。
    注:筋肉溶液を2つの15 mL円錐形チューブに分割すると、遠心分離後の細胞回復が1本のチューブと比較して向上します。
  6. 上清を吸引し、赤血球を除去するために7分間室温で1mL 1x RBCリシスバッファー( 補足ファイルを参照)にペレットを再懸濁します。
  7. 9 mLの洗浄バッファー(補足ファイルを参照)で体積を10 mLに、スピンチューブを400 x g、15°Cで15分間持ち上げてください。
  8. 上清を吸引し、1mLの洗浄バッファーに再懸濁してペレットを再結合する。
  9. 適切な量の細胞を別の1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移し、トリパンブルー染料と混ぜます。ヘモサイトメーターを用いて、光顕微鏡で生細胞を数える。

4. フローサイトメトリーの抗体染色

注:Sca-1抗体は、製造者の指示に従って、フローサイトメトリー/FACS実験の前にAPCに結合する必要があります。コンジュゲートのバッチごとにパフォーマンスを検証する必要があります (図 2)。最終的な結合は-20°Cの20 μLアリコートで貯えることができるし、3週間安定している。完全な活用プロトコルについては、補足ファイルを参照してください。

  1. フローサイトメトリーの場合、実験サンプルあたり1〜2 x 106 細胞を無菌1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。洗浄バッファーで最大 1 mL のボリュームを持ち、氷の上に置きます。
  2. 各実験に対して、次の必須コントロールを設定します: i) uns染色および ii) 生存率コントロールは、ライブセルの母集団を正確に選択します。iii) 蛍光マイナス 1 (FMO) CD31-/CD45- 画分、FAPs、および MP の正確なゲートを設定する単一細胞懸濁液の制御;iv)チャネル間の蛍光波波及びを補正する単染色補償ビーズ。
    1. すべての細胞コントロールについて、アリコート5 x 105 - 1 x 106 細胞を1mLの洗浄バッファー内で1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに入れ、氷の上に置く。
    2. ビーズコントロールの場合、1.5 mLマイクロ遠心チューブに正補正ビーズ(1滴あたり1.5 x 105ビーズ)を1滴追加します。コントロールの完全な補完は 、表 1に示されています。
      注:実験が初めて行われる場合は、単一細胞懸濁液(染色されていない、生存率、単染色補償ビーズおよびFMOコントロールに加えて)に対して各共役抗体に対して単染色制御を実行し、細胞内の陽性染色集団を評価し、補償ビーズで観察された染色を検証します。補償ビーズと単一細胞懸濁液に単染色を行うことで、すべての結合したばかりのSca-1::APC調製を検証します。染色コントロールの完全なリストについては、 表 1 を参照してください。
  3. 生存率制御を準備するには、細胞の体積の半分を「生存率」チューブから新しい1.5 mLマイクロ遠心分離管に移します。このチューブに「デッド」というラベルを付けます。
  4. 65°Cで「デッド」チューブを2〜3分間インキュベートして細胞を殺し、氷の上に置きます。2〜3分後、生存率制御チューブに残った生細胞と死んだ細胞を再結合する。この細胞の集団は、補償値(必要に応じて)を設定し、生存性染料のゲートを適切に設定するために使用されます。
  5. 500 x gで単細胞懸濁液(実験サンプルおよびコントロール)を遠心分離し、4°Cで5分間。
  6. 上清を吸引し、細胞ペレットを100 μLの洗浄バッファーに再懸濁します。
  7. 実験試料または対照に応じて、抗体を添加する。抗体の組み合わせと量については、染色マトリックス(表2)を参照してください。
  8. 各サンプルを軽くフリックして完全な混合を確認し、暗闇の中で氷の上で15分間インキュベートします。補償ビーズの場合は、暗闇の中で室温で15分間インキュベートします。
  9. 単一細胞懸濁液実験および制御サンプルの場合は、900 μLの洗浄バッファーを追加して、ボリュームを 1 mL まで上げてください。補償ビードコントロールの場合は、900 μLの1x PBSでボリュームを1 mLに上げてください。
  10. 遠心分離機単細胞懸濁液サンプルは500xg、4°Cで5分間用いた。 遠心分離機補償ビードは300 x g、4°Cで5分間コントロールします。
  11. すべての単一細胞懸濁液サンプルでは、吸引し、300 μLの洗浄バッファーに上清と再懸濁セルの細胞ペレットを廃棄します。補償ビードコントロールの場合、吸引し、上清を捨て、ペレットを1x PBSの300 μLで再中断し、負の補償ビーズを1滴(〜1.5 x 105)加えます。
  12. すべての単一細胞懸濁液サンプルを氷の上にアルミニウム箔の下に保管し、フローサイトメトリック取得に進みます。補償ビードコントロールも光から保護する必要がありますが、室温で維持することができます。
    注: 実験エンドポイントがフローサイトメトリーによるFAPs識別である場合は、手順5.1.1-5.1.11に従ってください。エンドポイントが培養および染色のために FACS を介して細胞分離である場合は、手順 5.2.1-5.2.9 およびセクション 6-7 に従ってください。

5. フローサイトメトリーと蛍光活性化細胞分類(FACS)

  1. フローサイトメトリー
    注:このプロトコルは、10の異なる色を同時に区別することができる405 nm、488 nm、および640 nmレーザーを装備したベンチトップフローサイトメーターを採用しています。バンドパスフィルタおよびこのプロトコルで使用される関連するフルオロクロムは、450/50(SYTOXブルー)、530/30(FITC)、575/25(PE)、および670/30(APC)です。各検出器の電圧は次のとおりです: FSC 700;SSC 475;フィット360;PE 460;PE-Cy7 600;シトークスブルー360;APC 570。使用前にフローサイトメーターまたは細胞選別機の適切な動作についてトレーニングを受けていることを確認してください。
    1. サイトメーターが使用前に10〜20分間オンにされ、それぞれ30〜45 sの清潔、すすがり、シース液溶液でシース液溶液を順次洗浄してプライミングされていることを確認してください。dH 2 O. dH2O. を使用して、十分な量のシース流体を貯蔵容器に追加して、取得中の適切なサンプルフローを維持します。
    2. 図 3に示すように、ギャティング戦略を設定して、図 3 に示した、MP と MP を識別します。
      注: FAPs と MP は、次の階層的な格子化戦略によって識別されます: i) SSC-A 対 FSC-A (側セル散乱領域対前方細胞散乱領域対別セル対デブリス) ii) FSC-W vs FSC-H (前方細胞散乱) FSCパラメータのダブレットからシングルを識別するための幅と前方セル散乱高さ、iii)SSC-W対SSC-H(サイドセル散乱幅対側セル散乱高さ対SSCパラメータのダブレットからシングルを識別する) iv) SSC-A 対 SYTOX ブルー (ライブとデッドシングルを区別するため)、v) SSC-A 対 CD31/45:::FITC (CD31+ および CD45+ セルをさらなる分析から除外する)、および vi) Sca-1:::APC vs VCAM-1::P E から CD31-/CD45- (リネージ;Lin-)個体数(ISPとMPの識別)。FAP は CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- イベントとして識別され、MP は CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ イベントとして識別されます。
    3. まず、各単染色補償ビードコントロールを低速でサイトメーターを介して実行し、チャネル間の蛍光波及び蛍光の補償値を生成します。独自の検出器(SCa-1:::APC単染色ビーズのSSC-A対APC)および他のすべての検出器で各制御の蛍光シグナルを比較することによって補償を評価します。適切な検出器には2つの異なる集団(1つは陰性、もう1つは正のシグナル)があり、他のすべての検出器には負の集団のみが存在するはずです。停止ゲートを 10,000 個の補正ビード イベントに設定し、データを記録します。
      注:各サンプルの取得の間に、サンプルからサンプルへの汚染を避けるために、10〜20秒間サイトメーターを通してdH2Oを実行するようにしてください。
    4. 次に、未染色および生存率制御サンプルを処理し、生きた単一細胞に適切にゲートします。停止ゲートを 10,000 個のシングルイベントに設定し、データを記録します。
      注:染色されていないサンプルを除き、各単一細胞懸濁液サンプルの取得前に約5分、SYTOXブルー生存性染料(300 μMの作業濃度を1 mMストック溶液から希釈)を各サンプルに加え、軽くフリックして混合(最終濃度1μM)します。
    5. 次に、残りの単一細胞懸濁液対照試料を取得する。各 FMO 制御を、適切なプロットを使用して、適切な区画を評価します (図 3)。例えば、CD31+CD45 FMOのFITC信号を評価して、CD31/CD45-ゲートが正確であることを確認します。最適な例を図 3Gに示します。プロトコルが初めて実行される場合は、FMO コントロールを取得する前に、セルに対して単一の染色コントロールを実行する必要があります。
    6. 適切な検出器および他のすべての検出器で、各単染色された細胞サンプルの蛍光シグナルを評価し、適切な補償を検証します。停止ゲートを10,000のライブシングルイベントに設定し、ソフトウェアに記録します。
    7. すべてのコントロール(単一細胞懸濁液およびビーズ)が処理されたら、まず各サンプルの体積を測定し、記録することによって、すべての実験サンプルを準備します。これらの測定値は、ステップ 5.1.11 で説明されているように、FAPs と MP を正確に定量するために使用されます。その後、50 μLの精密カウントビーズを加え、上下に2〜3回ピペットで軽く混ぜます。
    8. 最初の実験サンプルを簡単に実行して、カウントビードの個体数の識別を検証します。この母集団は、FSC-AとSSC-Aプロットの一般的な細胞集団とは別の小さな別個のクラスタとして表示されます(図3A、赤色のボックス)。カウントビードの母集団の周囲にゲートを作成します。次に、細胞量計を低速で処理して、実験サンプルごとのデータを取得します。停止ゲートを 10,000 個のカウントビード イベントとレコードに設定します。
      注:調査官は、カウントビーズがすべての検出器で蛍光を受けているため、SSC-Aと検出器のいずれかを評価する追加のプロットを設定することで、カウントビーズを別の方法で識別することができます。
    9. すべてのサンプルが処理されたら、適切なプロトコルを使用してサイトメーターを清掃してください。分析のためにすべてのデータをエクスポートします。
    10. 適切なフローサイトメトリー解析ソフトウェア上のすべてのデータファイルを開きます。ステップ 5.1.2 で説明されているように、データ取得に使用する格言戦略を設定します。データ取得と同じ順序でコントロールを調べ(例えば、未染色、生存率、単一染色、FMO制御)、ゲージ戦略を再検証する。FMO コントロールを使用して正確なゲートを設定したら、すべての実験サンプルにゲートを適用します。未加工データをスプレッドシートとしてエクスポートして定量化します。
    11. カウントビードを使用して、各実験サンプルのFAおよびMPの数を計算します。
      figure-protocol-8136
      ここで、取得したセル数は、取得ソフトウェア上の関連する細胞集団(例えば、FAまたはMP)の記録されたイベントの数です。取得されたビーズカウントは、取得ソフトウェア上のビーズをカウントする記録されたイベントの数です。ビーズの体積を数えるステップ 5.1.7 で追加されたカウントビードソリューションの量です。サンプルボリュームは、ビーズを数える前の各染色された実験サンプルの体積です。ビーズ濃度は、μL溶液あたりのビーズの数です。この値は製品データシートにあります。
  2. FACS - 細胞培養のためのソート
    注:このプロトコルは、同時に11-14色を区別することができる4レーザー(UV、バイオレット、ブルー、レッド)を装備したセルソーター上のFACSを実行します。FACS ワークフローを最適化するには、下記の手順 1 ~ 3 を除き、実験サンプル染色 (セクション 4) とフロー サイトメトリー プロトコルに従ってください。
    1. 実験サンプル中の細胞濃度を7 x 106細胞/mLに分類して、FAPsとMPの堅牢な収率を生成します。
    2. この細胞濃度の有意な増加を考慮して、分類される実験サンプル中の全ての抗体濃度を2倍にする。
    3. 仕分けの直前に5 mLポリスチレンチューブに取り付けられた40 μMの細胞ストレーナーキャップを通して最終的な染色セルサンプルを処理し、細胞の凝集を減らし、ソート収率を高めます。
    4. 1 mLの無菌、100%牛血清(FBS)を含む5 mLポリプロピレンコレクションチューブに細胞選別機から直接、単一の生きたラットのFAPsとMPを収集します。並べ替えが完了するまで、細胞を氷の上に置きます。
      注: オフサイトの場所で FACS を実行する場合は、氷上および安全な覆われたコンテナーに並べ替えられたセルをすべて転送します。
    5. 無菌バイオセーフティキャビネット(BSC)で働き、ソートされたFAPs用の適切な成長培地(例えば、FAP成長培地(FAP GM)、ソートされたMP用MP成長培地(MP GM)でソートされた細胞の体積を7 mLまで持ち込み、500xgの補足ファイルを参照し、7分間の遠心分離機を7分間で除去し、可能な限り多くの洗浄バッファーを除去します。
    6. 適切な成長培地およびプレートの1 mLのペレットを、その後の免疫染色のために無菌、コラーゲンコーティングされた12mmガラスカバースリップ/ウェルを含む12ウェルプレートに再懸濁します(セクション6参照)。
      注:コラーゲンの免疫細胞化学染色の場合、プレートは、コラーゲンコーティングの代わりに、無菌、ラミニンコーティングされた12mmガラスカバースリップ/ウェルを含む12ウェルプレートに細胞を選別しました。すぐに単離された前駆物質の免疫細胞化学実験が必要な場合、1cm2当たり15,000細胞の密度で種のFAPsとMPを、ステップ6.1に直接進みます。前駆細胞分化を誘導する長期培養のために、播種のFAPsはcm2あたり5,000細胞の密度で、およびMPはcmあたり7,500細胞/cm2の密度で。
    7. 細胞培養インキュベーターで37°Cおよび5%CO2で細胞をインキュベートする。培養時間が72時間後、メディアの半分を変更します。2-4 dの後にメディアを完全に変更してください。
    8. 筋細胞の発達を誘導するために、培養9日目にMP分化(MD)培地にMP培養を切り替える。アディポサイトを誘導するには、培養10日目にファップ培養液をFAPアディポ原性分化(AD)培地に切り替える。
    9. 線維形成を誘導するために、培養中に可変時間にFAPsを線維化分化(FD)培地に切り替えてもよいし、あるいは、分離後のFD培地に直接播種してもよい(ステップ5.2.6)(すべての培地レシピについては 補足ファイル を参照)。

6. 培養したFAPSとMPの免疫細胞化学

  1. 細胞の並べ替えを検証し、FAPs および MP カルチャの純度を実証するには、 PDGFRα(FAPsマーカー)、Pax-7(筋幹[衛星]細胞マーカー)、線維芽細胞特異的タンパク質(FSP-1、線維芽細胞マーカー)、ペリリピン-1(プリン-1、脂肪細胞マーカー)、コラーゲンタイプ1(Col1a1、線維症の指標)、ミオスイン重鎖(MHC、成熟ミオックテ)を含む免疫染色剤。
    1. 選別された細胞の免疫染色では、12ウェルプレートを室温で3分間200 x gで遠心分離し、カバースリップ/ウェルへの細胞の付着を容易にします。このステップは、長期文化には必要ありません。カルチャ メディアを削除します。
    2. FSP-1による免疫染色の場合、4°Cで2分間1mL100%メタノール(MeOH)を有する細胞を固定します。 PDGFRα、プリン-1、Pax7またはCol1a1に対する免疫染色の場合、室温で1x PBSで1mL4%PFAで細胞培養を15分間固定します。MHC免疫染色は、いずれかの固定性を許容する。
      メモ: メタノール固定セルの場合、ステップ 6.2 をスキップして、ステップ 6.3 に進みます。
  2. 吸引4%PFAを、1x PBSで細胞培養物を3~4回素早く洗浄した。1x PBSに100mMグリシンを1mL加え、室温で10分間インキュベートして残留PFAを不活性化します。吸引し、1x PBSで1〜2回洗浄します。
    注:細胞は、1x PBSの2 mLでこの段階で残すことができます, クリングフィルムに包まれ、7-10日間の最大で4°Cで保存.
  3. 洗浄後、1x PBSに0.1%トリトン-Xを1mL加え、20分間インキュベートして細胞膜を透過させます。
  4. 1-2 mLの1x PBSで2〜3回ウェルを洗浄し、室温で1時間1倍の1x PBS + 3%BSAの1mLで細胞をブロックします。
  5. ピペット80μLの一次抗体を1x PBS+3%BSA(PDGFRα 1:100、Pax7 neat、FSP-1 1:50、プリン-1 1:400、Col1a1 1:250、MHC 3 μg/mL)に1個のパラフィルムに切り替え、移動容器にテープでつないだ。滅菌微細鉗子を使用して、慎重にウェルからカバースリップを持ち上げ、抗体溶液の滴に反転します。抗体溶液の蒸発を避けるために、2枚の濡れたペーパータオルとカバー容器をプラスチックフィルムにインキュベートします。4°Cで一晩インキュベートする。
    注:カバーリップをよく取り出す場合、ウェル内で染色する(最小500 μL)よりも抗体(約80 μL)が少なくなります。
  6. 2日目には、カバースリップを室温で30分間温めます。鉗子を慎重に使用し、カバースリップをそれぞれのウェル(上を向いている細胞)に戻し、1〜2 mLの1x PBSで2〜3回洗浄し、それぞれ2分間洗浄して、できるだけ多くの一次抗体を除去します。
  7. 一次抗体染色と同様の染色法を用いて、ヤギ抗ウサギアレクサフルオール488二次抗体(1:400)を有する染色細胞を検出し、FSP-1、プリン-1、Col1a1、またはPDGFRαおよびヤギ抗マウスアレクサFluor555二次抗体(1:300)を検出してMHCまたはPax-7を検出する。室温で細胞を1時間インキュベートし、細胞を光から保護します。
  8. 細胞をウェルに戻し、室温で2〜4分間、Hoechst(1:10,000)で細胞をインキュベートします。細胞を1x PBSで2〜3回それぞれ2分間洗浄し、余分なHoechstを除去します。
  9. アンチフェード蛍光実装媒体を使用してガラススライドにカバースリップを取り付け、スライドを室温で暗闇の中で一晩乾燥させます。暗闇の中で4°Cでカバースリップを取り付けました。

7. オイルレッドO(ORO)培養されたFAPsとMPの染色

  1. 細胞膜の透過化は非異形成細胞タイプの非特異的/望ましくない染色をもたらす可能性があるとして、非透過細胞に対してORO染色を行う。染色を行う前に、ORO作業ストックを準備し(レシピについては 補足ファイルを参照)、室温で20分間インキュベートします。
  2. 20分後、0.2 μmフィルターを使用して溶液をフィルターし、未溶解の凝集を除去します。
  3. よくから培地を吸引し、10%中性緩衝ホルマリン(10%NBF)の1 mLを加える。室温で5分間インキュベートします。
    注:細胞の合流は井戸/カバースリップから持ち上がる可能性がある。ソリューションを吸引/追加する場合は注意してください。
  4. 吸引し、1mLの新鮮な10%NBFを加え、室温で少なくとも1時間インキュベートします。
    注: セルは一晩で 10% NBF に残すことができるので、プロトコルはこの時点で停止することができます。
  5. 60%イソプロパノールの1 mLで1mLでウェルを1回素早く洗い、吸引し、井戸を完全に乾燥させます(約2分)。
  6. 井戸あたり400 μLオイルレッドO作業ストックを追加し、室温で10分間インキュベートし、プレートの壁にOROをピペット化しないようにします。
  7. オイルレッドOをすべて取り外し、dH2Oで4回素早く洗浄します。
    注: 染色されたウェルにカバースリップが含まれている場合は、ステップ 6.9 で説明したのと同じ手法を使用してマウントします。
  8. 画像は、明視野顕微鏡を使用してカバースリップまたは染色されたいずれかの方法を示します。

8. 逆側および脱税ラット胃腸切片の組織染色

  1. ピクロシリウスレッド (PSR)
    1. 5μm厚のホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)ラット胃腸組織学的切片にPSR染色を行う40.
  2. オイルレッドO(オロ)
    1. 5μm厚のイソペンタン凍結ラット胃腸組織切片を4%PFAに10分間固定し、60%イソプロピルアルコール中で1分間インキュベートする。
    2. ORO作業ストックで12分間ステイン。60%イソプロピルアルコールで1分間インキュベートし、水溶性の取り付け媒体を使用してカバースリップに10分間洗浄します。
  3. Sca-1およびラミニン組織蛍光免疫組織化学(IHC)
    1. 5μm厚のイソペンタン冷凍ラット胃腸組織学的切片に蛍光IHCを行います。
    2. 1x PBSで5分間のサンプルを水和し、4%PFAに10分間固定し、90分間組織IFブロッキング溶液中のサンプルをインキュベートします( 補足ファイルを参照)。
    3. 抗Sca-1一次抗体(1:500)を1x PBS+0.05%トウィーンで一晩4°Cでインキュベートする。
    4. 2日目には、1x PBS + 0.05% Tweenでそれぞれ5分間3回洗浄し、ヤギの抗ウサギアレクサフルオール555(1:500)で1時間インキュベートします。
    5. 再度(前と同様に)洗浄し、ブロッキング溶液を1時間インキュベートし、1x PBS+ 0.05%Tweenで1時間希釈した抗ラミニン一次抗体(1:500)を加えます。
    6. (以前と同様に)もう一度洗い、ヤギの抗ウサギアレクサフルーオール488(1:500)で1時間(ラミニン)インキュベートします。
    7. もう一度(以前と同様に)洗い、DAPI(1:10,000)で4分間インキュベートします。アンチフェードマウントメディアを使用してカバーリップに洗浄して取り付けます。

結果

Sca-1およびVCAM-1を含む新規抗体パネルを用いたフローサイトメトリーによるFAおよびMPの同定
ラット筋のFAPsを同定するためのゲーティング戦略は、マウス29のフローサイトメトリープロトコルに基づいており、CD31(内皮)およびCD45(造血)陽性細胞(系統[Lin]と呼ばれます)のゲートであり、リンジ陰性(Lin-陰性)からのFAPsマーカ?...

ディスカッション

ラットの筋肉のための最適化された、検証されたFAPs分離プロトコルは、生物学的または技術的な理由のためにマウスで実現不可能な傷害モデルを研究したい研究者にとって不可欠です。例えば、マウスは、慢性局所的、または長期脱退などの神経変性傷害を研究するための最適な動物モデルではない。生物学的には、マウスの短い寿命と急速な老化は、老化の交絡因子からの脱用による筋肉...

開示事項

著者らは開示する矛盾はない。

謝辞

オタワ大学のフローサイトメトリーコア施設と、セントマイケルズ病院ユニティヘルストロントのセントマイケルズ病院ユニティヘルストロントのフローサイトメトリーコア施設に、この原稿に記載されているフローサイトメトリー/FACSプロトコルの最適化に関する専門知識とガイダンスに感謝します。この作品は、デザインによる医学による新しいアイデア2018ファンド(MbDNI-2018-01)からJBに資金提供されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL Polypropylene Round-Bottom TubeFalcon352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer CapFalcon352235
10 cm cell culture dishesSarstedt83.3902
12-well cell culture plateThermoFisher130185
12 mm glass coverslips, No.2VWR89015-724
10 mL SyringeBeckton Dickenson302995
15 mL centrifuge tubesFroggaBio91014
20 gauge needleBeckton Dickenson305176
25mL Serological pipetteSarstedt86.1685.001
40µm cell strainerFisher Scientific22363547
50mL centrifuge tubesFroggaBioTB50
AbC Total Antibody Compensation Beads ThermoFisherA10497
Ammonium Chloride, Reagent GradeBioshopAMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µgBiotium92307
Aquatex Aqueous Mounting MediumMerck108562
Biolaminin 411 LNBiolaminaLN411
Bovine Serum Albumin (BSA)BioshopALB001
Calcium ChlorideBioshopCCL444.500
Collagenase Type IIGibco17101015
CountBright Plus Absolute Counting BeadsThermoFisherC36995
DexamethasoneMillipore SigmaD4902
DispaseGibco17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Gibco11995-065(+)4.5 g/L D-Glucose
(+)L-Glutamine
(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTAFisherScientificS311
FACSClean SolutionBeckton Dickenson340345
FACSDiva SoftwareBeckton Dickenson--
FACSRinse SolutionBeckton Dickenson340346
Fetal Bovine SerumSigmaF1051
Flow Cytometry Sheath FluidBeckton Dickenson342003
FlowJo SoftwareBeckton Dickenson--
Fluorescent Mounting MediumDakoS302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibodyInvitrogenA21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibodyInvitrogenA11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibodyInvitrogenA21429
Goat SerumGibco16210-064
Ham's F10 MediaThermoFisher 11550043(+) Phenol Red
(+) L-Glutamine
(-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)Multicell311-513-CL
Heat Inactivated Horse SerumGibco26050-088
HemocytometerReichertN/A
HEPES, minimum 99.5% titrationSigmaH3375
Horse SerumThermoFisher16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1)Cell Signaling8915LF
Humulin RLillyHI0210
IBMXMillipore SigmaI5879Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
IsopropanolSigmaI9516Also known as 2-propanol
Lewis Rat, FemaleCharles River Kingston004 (Strain Code)200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop CytometerBeckton Dickenson--
MicrocentrifugeEppendorfEP-5417R
MoFlo XDP Cell SorterBeckman Coulter--
Mouse Anti-CD31::FITC AntibodyAbcamab33858Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC AntibodyBiolegend202205Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE AntibodyBiolegend200403Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/AAlso known as MF20
Mouse Anti-Pax7 AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 %SigmaHT501128
Oil Red OMillipore SigmaO0625
PE-Cy7 Conjugation KitAbcamab102903
Penicillin-StreptomycinSigma P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)Gibco10010-023(-)Calcium Chloride
(-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent GradeBioshopPBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) AntibodyInvitrogenMA5-32347FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 AntibodyAbcamab203254
Rabbit Anti-Laminin AntibodySigmaL9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 AntibodyAbcamab3526
Rabbit Anti-Sca-1 AntibodyMillipore SigmaAB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I AntibodyAbcamab260043Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha AntibodyAbcamab203491
Recombinant Human FGF-basicGibcoPHG0266
Sodium AzideSigmaS2002
Triton-X-100Fisher ScientificBP151
TroglitazoneMillipore SigmaT2573
Tween-20BioshopTWN510

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