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摘要

该协议概述了一种从大鼠骨骼肌中分离纤维脂肪源性祖细胞（FAPs）和肌源性祖细胞（MPs）的方法。在肌肉损伤模型中利用大鼠为分析提供了来自萎缩肌的组织可用性的增加，以及用于评估自由移动动物的肌肉力量和步态的更多经过验证的方法。

摘要

纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）是骨骼肌中的常驻间质细胞，与肌原祖细胞（MPs）一起在肌肉稳态，损伤和修复中起关键作用。目前用于FAPs鉴定和分离的方案使用流式细胞术/荧光激活细胞分选（FACS），迄今为止 在体内 评估其功能的研究仅在小鼠中进行。大鼠较大的固有尺寸允许对骨骼肌损伤模型中的FAPs进行更全面的分析，特别是在严重萎缩的肌肉中，或者当研究人员需要大量的组织质量进行多次下游测定时。大鼠还提供了更多不需要动物镇静或牺牲的肌肉功能测定选择，从而通过进行连续评估来最大限度地减少发病率和动物使用。针对小鼠优化的流式细胞术/ FACS方案具有物种特异性，特别是受市售抗体特性的限制。它们尚未针对将FAPs与大鼠或高度纤维化肌肉分离进行优化。基于表面标志物CD31，CD45，Sca-1和VCAM-1的差异表达，开发了一种流式细胞术/ FACS方案，用于从健康和去神经化大鼠骨骼肌中鉴定和分离FAPs和MP。由于大鼠特异性，流式细胞术验证的一抗受到严重限制，因此进行了靶向Sca-1的抗体的内部偶联。使用该协议，确认了成功的Sca-1偶联，并通过细胞培养和FACS分离的FAP和MP的免疫染色来验证FAP和MP的流式细胞术鉴定。最后，我们在延长（14周）大鼠去神经支配模型中报告了一种新的FAPs时间过程。这种方法为研究人员提供了在新型动物模型中研究FAPs的能力。

引言

纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）是骨骼肌中常驻的多能祖细胞群，在肌肉稳态，修复和再生中起关键作用，相反，还介导对肌肉损伤的病理反应。顾名思义，FAPs最初被确定为具有分化成成纤维细胞和脂肪细胞1的潜力的祖细胞群体，并且据称是慢性损伤和疾病中骨骼肌纤维脂肪浸润的关键介质。进一步的研究表明，FAPs还具有成骨和软骨形成2，3，4的能力。因此，它们在文献中被更广泛地标记为间充质或基质祖3，5，6，7，8。在急性骨骼肌损伤中，FAPs通过短暂增殖间接帮助再生肌生成，为激活的肌肉卫星细胞及其下游肌原祖（MPs）对应物1，9，10提供有利的环境。在成功再生的同时，FAPs经历凋亡，使其数量恢复到基线水平1，9，10，11。相反，在慢性肌肉损伤中，FAPs会覆盖促凋亡信号，这导致它们持续存在9，10，11和异常的肌肉修复。

评估FAPs介导肌肉反应的细胞和分子机制的体内研究利用了迄今为止的小鼠动物模型1，7，9，10，11，12，13，14。虽然基因工程小鼠是用于这些分析的强大工具，但动物的小尺寸限制了在长期局部损伤模型中研究的组织可用性，其中肌肉萎缩可能是深刻的，例如创伤性去神经支配。此外，肌肉力量和身体功能的测量需要需要终止小鼠的离体或原位测量，或需要手术和/或全身麻醉的体内方法，以评估肌肉收缩性能15，16，17，18，19，20.在大鼠中，除了对更复杂的运动行为（例如步态分析，例如坐骨神经痛功能指数，CatWalk分析）的分析之外，还存在经过良好验证和全球利用的肌肉功能分析，并在清醒和自发移动的动物中进行21，22，23，24.这还优化了动物实验中最低发病率的原则，以及使用的研究动物的数量。因此，大鼠为FAPs研究者提供了更大的损伤肌肉体积的灵活性，用于蛋白质和细胞分析，并且能够对警觉动物中的肌肉复合物静态和动态功能活动和行为进行连续评估。

FAPs主要分别使用流式细胞术和荧光激活细胞分选（FACS）从全肌肉样品中鉴定和分离。这些是基于激光的测定，能够根据特征特征（例如大小，粒度以及细胞表面或细胞内标记物的特定组合）鉴定多个特定细胞群25。这在骨骼肌等器官系统的研究中非常有利，因为稳态和再生是由大量细胞类型协调的复杂多因素过程。一项开创性的研究确定了FAPs以及MP，在小鼠骨骼肌中使用流式细胞术方法1。他们证明FAPs本质上是间充质的，因为它们缺乏来自内皮（CD31），造血（CD45）或肌源性（整合素-α7 [ITGA7]）起源的细胞特异性的表面抗原，但表达间充质干细胞标志物Sca-1（干细胞抗原1）1并在培养物中分化成纤维化和脂肪生成细胞。其他研究表明，基于替代干细胞标志物，血小板衍生的生长因子受体α（PDGFRα）2，7，8的表达，成功分离肌肉间充质祖细胞，进一步的分析显示这些可能与FAPs3相同。FAPs现在通常在流式细胞术中使用Sca-1或PDGFRα作为阳性选择标记物1，9，10，11，12，13，14，26，27，28，29，30，31.PDGFRα的使用对人体组织是首选的，然而，作为小鼠Sca-1的直接人类同系物尚未被鉴定32。此外，其他细胞表面蛋白已被报道为MP的标志物（例如，VCAM-1），为ITGA7提供了一种潜在的替代方案，作为FAPs分离期间肌源谱系细胞的指标33。

虽然流式细胞术/FACS是研究FAPs在骨骼肌1、9、10、11、13、29中的作用和致病潜力的强大方法，但它在技术上受到其所需试剂的特异性和优化的限制。由于流式细胞术鉴定和分离FAPs已经在小鼠动物模型1、9、10、11、29中得到开发和进行，这给希望在其他模式生物中研究FAPs的研究人员带来了挑战。许多因素 - 例如要处理的最佳组织尺寸，以及试剂和/或抗体特异性和可用性 - 因所用物种而异。

除了在新型动物模型中研究FAPs的技术障碍外，它们在很大程度上是在急性有毒环境中研究的 - 通常通过肌内化学注射或心脏毒素。对FAPs长期动力学的评估主要限于评估杜氏肌营养不良症，使用mdx小鼠模型9，10，11和组合肌肉损伤模型，如巨大的肩袖撕裂，其中同时在肩部肌肉组织上进行肌腱横断和去神经支配26，27，28.FAPs对慢性创伤性去神经支配的唯一侮辱的反应，在重工业，农业和出生创伤（臂丛神经损伤）34，35，36，37中常见的工作场所事故中发生，具有显着的发病率，尚未得到很好的表征，通常仅限于短期时间范围11，38。

我们描述了一种从大鼠的健康以及严重萎缩和纤维化骨骼肌中识别和分离FAPs和MP的方法。首先，使用组织消化和流式细胞术染色方案鉴定CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1-FAPs和CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+MPs，并通过对FACS分离的细胞进行培养和免疫细胞化学染色，随后对我们的发现进行验证。使用这种方法，我们还在大鼠的长期孤立去神经支配损伤模型中报告了一种新的FAPs时程。

研究方案

执行该协议的调查人员必须获得当地动物伦理委员会/护理委员会的许可。所有动物工作均由圣迈克尔医院团结健康多伦多动物护理委员会（ACC #918）批准，并根据加拿大动物护理委员会（CCAC）制定的指导方针进行。流式细胞术方案的示意图如图 1所示。如果下游应用是FACS和随后的细胞培养，则应使用适当的无菌技术完成所有步骤。

1. 肌肉收割

  1. 根据当地动物饲养场和动物伦理委员会指南，使用适当的麻醉剂和牺牲对大鼠进行麻醉。例如，该协议从成年雌性刘易斯大鼠（200-250g）收获腓肠肌。使用2-3%异氟醚麻醉大鼠，并通过心内注射T61来处死大鼠。
  2. 一旦动物被处死，剃掉整个后肢，以促进肌肉的位置，并尽量减少收获组织的毛皮污染。
  3. 使用无菌手术刀，在皮肤上做两个切口:第一个切口在踝关节的周长周围，第二个在从脚踝到臀部的后肢内侧的中线。
  4. 剥离皮肤和浅表肌肉层，露出下方的腓肠肌，它起源于股骨的内侧和外侧髁，插入跟腱。
  5. 使用钝性夹层将腓肠肌与周围组织分开，仅通过肌腱处理肌肉，以避免挤压伤。
  6. 用锋利的剪刀将跟腱尽可能远端切除，将腓肠肌腱与其插入分开。切开后，用镊子抓住跟腱，轻轻地将腓肠肌从下层骨上剥离。仍然用一只手用镊子握住肌肉，找到腓肠肌的两个起源，并在内侧和外侧股骨髁处切开。
  7. 将切除的腓肠肌轻轻擦拭在无菌纱布上，以尽可能多地去除血液。修剪无菌表面上的肌肉，去除任何多余的结缔组织以及跟腱。
  8. 将肌肉放在称重艇中，并使用精密秤称重。该协议经过优化，可消化湿重为200-600毫克的肌肉。如果需要，操作员可以将多余的收获组织细分为其他下游检测。
  9. 轻轻地进一步将收获的肌肉分成3-4个较小的块（约1-2 cm3），并浸没在冰冷的1x PBS中。在冰上保持冷藏，直到所有样品都收获完毕。

2. 肌肉消化

  1. 从PBS中取出肌肉，并置于无菌的10cm细胞培养皿中。用镊子轻轻撕开并切碎组织，直到碎片约3-4毫米3，去除尽可能多的结缔组织。一旦完全切碎，转移到含有6 mL DMEM + 1%青霉素/链霉素（P / S）的无菌50 mL锥形管中。
  2. 将10μL300mM CaCl2溶液加入365μL胶原酶II溶液（储备浓度4800 U / mL）以激活胶原酶酶。将活化的胶原酶II溶液加入含有组织浆液的50mL锥形管中。最终胶原酶 II 浓度为 250 U/mL。
  3. 将管子在37°C，240 x g的摇摇杯中孵育1小时，确保每15分钟手动旋转一次，以移走粘附在管子侧面的任何组织。
  4. 1小时后，从摇摇杯中取出试管，并为每个样品加入以下内容:100μL胶原酶II（4，800 U / mL）和50μLDispase（4.8 U / mL）。
  5. 使用血清学移液器移液样品15-20次，直到溶液均质。如果处理多个样品，请为每个样品使用单独的无菌移液器，以避免样品交叉污染。
  6. 在37°C和240×g的振荡器中再次孵育30分钟。 15分钟后，用手摇动样品，将粘附组织从管的侧面移开。

3. 单细胞悬浮液的产生

  1. 用 20 G 针头通过 10 mL 注射器缓慢剪切样品 10 个循环。
    注意:一个周期涉及将肌肉溶液吸收到注射器中，然后将其注射回管中。确保通过缓慢完成剪切来最小化任何气泡，因为过多的泡沫会导致额外的细胞死亡39。
  2. 将40μm细胞过滤器放在无菌的50mL锥形管上，并通过移液5mL DMEM + 10%FBS和1%P / S将其润湿。
  3. 通过细胞过滤器一次移取1mL样品。
  4. 通过过滤器用10%FBS和1%P / S移液DMEM来洗涤细胞过滤器，以使管中的总体积达到25mL。
  5. 将25mL样品平分成两个15mL锥形管，并在15°C，400×g下离心15分钟。
    注意:与单管相比，将肌肉溶液分成两个15 mL锥形管可确保离心后更好的细胞恢复。
  6. 在室温下吸出上清液并将沉淀重新悬浮在1mL 1x红细胞裂解缓冲液（参见 补充文件）中7分钟以消除红细胞。
  7. 用9 mL洗涤缓冲液（见补充文件）将体积调高至10 mL，并在400 x g，15°C下旋转管15分钟。
  8. 通过重新悬浮在1mL洗涤缓冲液中吸出上清液并重新组合沉淀。
  9. 将适当体积的细胞转移到单独的1.5mL微量离心管中，并与台盼蓝染料混合。使用血细胞计数器在光学显微镜上计数活细胞。

4. 流式细胞术的抗体染色

注意:根据制造商的说明，在流式细胞术/FACS 实验之前，Sca-1 抗体必须与 APC 偶联。必须验证每批偶联物的性能（图2）。最终偶联可以在-20°C下储存在20μL等分试样中，并稳定三周。有关完全共轭协议，请参阅补充文件。

  1. 对于流式细胞术，将每个实验样品1-2×106 个细胞转移到无菌的1.5mL微量离心管中。用洗涤缓冲液将容量提高至 1 mL，然后放在冰上。
  2. 对于每个实验，设置以下必需的对照:i）未染色和ii）活力对照，以准确选择活细胞群;iii）单细胞悬浮液上的荧光减一（FMO）对照，为CD31-/CD45-级分、FAP和MP设置准确的门;iv）单染色补偿珠，以校正通道之间的荧光溢出。
    1. 对于所有细胞对照，在1.5 mL微量离心管中的1 mL洗涤缓冲液中等分5 x 10 5 - 106个细胞，并置于冰上。
    2. 对于磁珠对照，将1滴正补偿微珠（每滴约1.5 x10 5颗微珠）加入每个标记的1.5 mL微量离心管。 表 1中列出了完整的控件。
      注意:如果实验是首次进行，请在单细胞悬浮液（除了未染色的、活力的、单染色的补偿球和FMO对照外）上对每种偶联抗体进行单染色对照，以评估细胞中阳性染色群体并验证在补偿微珠上观察到的染色。通过对补偿微珠和单细胞悬浮液进行单染色来验证每个新鲜偶联的Sca-1::APC制备。有关染色对照的完整列表，请参阅表1。
  3. 为了准备活力控制，将一半体积的细胞从"活力"管转移到新的1.5mL微量离心管中。将此管标记为"死"。
  4. 将"死"管在65°C下孵育2-3分钟以杀死细胞，然后放在冰上。2-3分钟后，将死细胞与存活控制管中剩余的活细胞重新组合。该细胞群将用于设置补偿值（如果需要）并正确设置活性染料的门。
  5. 将单细胞悬浮液（实验样品和对照）在500×g，4°C下离心5分钟。
  6. 吸出上清液并将细胞沉淀重新悬浮在100μL洗涤缓冲液中。
  7. 根据实验样品或对照组添加抗体。请参阅染色基质（表2）以获取有关抗体组合和量的信息。
  8. 轻轻轻拂每个样品，以确保完全混合并在黑暗中的冰上孵育15分钟。对于补偿珠，在室温下在黑暗中孵育15分钟。
  9. 对于单细胞悬浮液实验和对照样品，通过加入900μL洗涤缓冲液将体积调高至1mL。对于补偿微球控制，用900 μL的1x PBS将体积调高至1 mL。
  10. 将单细胞悬浮液样品在500×g，4°C下离心5分钟。 离心机补偿珠在300×g，4°C下控制5分钟。
  11. 对于所有单细胞悬浮样品，吸出并弃去上清液，并将细胞沉淀重新悬浮在300μL洗涤缓冲液中。对于补偿微粒对照，吸出并丢弃上清液，将沉淀重新悬浮在300μL的1x PBS中，然后加入1滴（〜1.5×105）负补偿微珠。
  12. 将所有单细胞悬浮液样品保存在铝箔下的冰上，然后进行流式细胞仪采集。补偿珠控制装置也应避光，但可以保持在室温下。
    注意:如果实验终点是通过流式细胞术鉴定FAPs，请遵循步骤5.1.1-5.1.11。如果终点是通过FACS分离细胞以进行培养和染色，请遵循步骤5.2.1-5.2.9和第6-7节。

5. 流式细胞术和荧光激活细胞分选（FACS）

  1. 流式细胞术
    注:本方案采用配备405 nm、488 nm和640 nm激光器的台式流式细胞仪，能够同时区分10种不同的颜色。该协议中使用的带通滤光片及其相关荧光染料如下:450/50（SYTOX蓝），530/30（FITC），575/25（PE）和670/30（APC）。每个探测器的电压如下:FSC 700;SSC 475;FITC 360;PE 460;聚乙烯-氰7 600;SYTOX 蓝 360;APC 570.在使用前，确保您接受过流式细胞仪或细胞分选仪正确操作的培训。
    1. 确保在使用前将细胞仪打开10-20分钟，并通过用清洁，冲洗和鞘液溶液依次清洁30-45秒来启动。最后用dH2O冲洗，确保将足够体积的护套液添加到储存容器中，以在整个采集过程中保持适当的样品流量。
    2. 设置门控策略以识别 FAC 和 MP，如图 3所示。
      注意:FAP和MP通过以下分层门控策略识别:i）SSC-A与FSC-A（侧细胞散射面积与前置细胞散射面积，以分隔细胞与碎片），ii）FSC-W与FSC-H（前向细胞散射宽度与前向细胞散射高度，以区分FSC参数中的双线链），iii）SSC-W与SSC-H（侧细胞散射宽度与侧细胞散射高度，以区分SSC参数中的双线态）， iv） SSC-A vs SYTOX Blue （以區分活的與死的背心）， v） SSC-A vs CD31/45::FITC （從進一步的分析中排除 CD31+ 和 CD45+ 細胞），以及 vi） Sca-1::APC vs VCAM-1::P E 來自 CD31-/CD45- （血系;Lin-）人口（FAP和MP的身份）。FAPs被识别为CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1-事件，MP被识别为CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+事件。
    3. 首先通过细胞仪以低速运行每个单染色补偿微球控制，以生成补偿值，用于校正通道之间的任何荧光溢出。通过比较每个对照器自身检测器（例如，SCA-1::APC 单染色珠的 SSC-A 与 APC）以及所有其他检测器中的荧光信号来评估补偿。在适当的检测器中应该有两个不同的群体（一个为阴性，一个具有阳性信号），而在所有其他探测器中只有一个阴性群体。将停止门设置为10，000个补偿珠事件并记录数据。
      注意:在采集每个样品之间，确保通过细胞仪运行dH2O 10-20秒，以避免样品间污染。
    4. 接下来处理未染色和活力的对照样品，以正确门禁活的单细胞。将停止门设置为 10，000 个单线态事件并记录数据。
      注意:在采集每个单细胞悬浮液样品（未染色样品除外）前约5分钟，向每个样品中加入1μLSYTOX Blue活性染料（从1mM储备溶液稀释的300μM工作浓度），轻轻轻地混合（最终浓度1μM）。
    5. 然后获取剩余的单细胞悬浮液对照样品。在门控策略中用适当的图评估每个FMO对照（图3）。例如，评估 CD31+CD45 FMO 的 FITC 信号，以确保 CD31-/CD45- 门的准确性。一个最佳示例如图 3G所示。如果首次执行该方案，则应在获取FMO对照之前运行细胞上的单染色对照。
    6. 在适当的检测器以及所有其他检测器中评估每个单染色细胞样品的荧光信号，以验证适当的补偿。将停止门设置为 10，000 个实时单线态事件，并在软件上记录。
    7. 处理完所有对照（单细胞悬浮液和磁珠）后，通过首先测量和记录每个样品的体积来制备所有实验样品。这些测量值将用于准确量化 FAP 和 MP，如步骤 5.1.11 中所述。然后，加入50μL精密计数微球，并通过上下移液2-3次轻轻混合。
    8. 简要运行第一个实验样本，以验证计数珠群的鉴定。该群体在FSC-A与SSC-A图上显示为一个与一般细胞群分开的小而独特的簇（图3A，红框）。在计数珠子种群周围创建一个门。然后通过低速通过细胞仪处理每个实验样品的数据。将停止门设置为 10，000 个计数珠事件并记录。
      注意:研究人员可以通过设置额外的绘图来评估SSC-A与任何检测器，从而识别计数微球，因为计数微球在所有检测器中都是荧光的。
    9. 处理完所有样品后，使用适当的实验方案清洁细胞仪。导出所有数据进行分析。
    10. 在适当的流式细胞术分析软件上打开所有数据文件。设置用于数据采集的门控策略，如步骤 5.1.2 中所述。以与数据采集相同的顺序检查对照（例如，未染色、活力、单染色，然后是FMO对照），以重新验证门控策略。使用FMO对照设置精确门后，将门应用于所有实验样品。将原始数据导出为电子表格以进行量化。
    11. 使用计数珠计算每个实验样品中的FAP和MP的数量:
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      其中，获得细胞计数是采集软件上相关细胞群（例如FAP或MP）的记录事件的数量;采集的磁珠计数是采集软件上记录的计数珠子的事件数;计数珠体积是步骤5.1.7中添加的计数珠溶液的体积;样品体积是添加计数珠之前每个染色的实验样品的体积。磁珠浓度是每μL溶液的磁珠数;此值可在产品数据表上找到。
  2. FACS - 细胞培养的分选
    注意:该协议在配备4种激光（UV，紫色，蓝色，红色）的细胞分选机上执行FACS，能够同时区分11-14种颜色。遵循实验样品染色（第4节）和流式细胞术方案，但下面描述的步骤1至3除外，以优化FACS工作流程:
    1. 将要分选的实验样品中细胞的浓度提高到7 x 106个细胞/ mL，以产生FAP和MP的稳定产量。
    2. 为了解释细胞浓度的显着增加，要分类的实验样品中的所有抗体浓度加倍。
    3. 在分选之前，立即通过贴在5 mL聚苯乙烯管上的40μM细胞过滤器盖处理最终染色的细胞样品，以减少细胞结块并提高分选产量。
    4. 直接从细胞分选机收集单个活鼠FAP和MP到含有1mL无菌100%胎牛血清（FBS）的5mL聚丙烯收集管中。将细胞放在冰上，直到分类完成。
      注:如果在场外位置进行流式细胞流动反应，请将所有分类的细胞转移到冰上和安全的有盖容器中。
    5. 在无菌生物安全柜（BSC）中工作，使用适当的生长培养基（例如，用于分选的FAP的FAP生长培养基（FAP GM）和用于分选MP的MP生长培养基（MP GM））使分选细胞的体积达到7 mL;参见食谱的补充文件），并在500 x g，4°C下离心7分钟，以尽可能多地去除残留的洗涤缓冲液。
    6. 将沉淀重悬于1mL适当生长培养基和板中，放入含有无菌，胶原包衣的12mm玻璃盖玻片/孔的12孔板中，以进行随后的免疫染色（见第6节）。
      注意:如果对胶原蛋白进行免疫细胞化学染色，将板将细胞分类到含有无菌，层粘连蛋白包被的12毫米玻璃盖玻片/孔的12孔板中，而不是胶原包被。如果需要立即分离的祖细胞的免疫细胞化学实验，则以每cm2的15，000个细胞的密度进行种子FAP和MP，并直接进入步骤6.1。对于诱导祖细胞分化的长期培养物，每厘米2的密度为5，000个细胞的种子FAPs和密度为每厘米27，500个细胞的MP。
    7. 在细胞培养箱中以37°C和5%CO2孵育细胞。培养72小时后，更换一半的培养基。之后每 2-4 天完全更换一次介质。
    8. 为了诱导肌细胞发育，在培养的第9天将MP培养物切换到MP分化（MD）培养基。为了诱导脂肪细胞，在培养的第10天将FAPs培养物切换到FAP脂肪性分化（AD）培养基。
    9. 为了诱导纤维化，FAPs可以在培养过程中的可变时间切换到纤维化分化（FD）培养基，或者可以在分离后直接接种到FD培养基中（步骤5.2.6）（所有培养基配方参见 补充文件 ）。

6. 培养的FAP和MP的免疫细胞化学

  1. 为了验证细胞分选并证明FAPs和MP培养物的纯度，使用细胞类型特异性标记物进行免疫染色，包括PDGFRα（FAPs标记），Pax-7（肌肉干[卫星]细胞标记），成纤维细胞特异性蛋白（FSP-1，成纤维细胞标记），Perilipin-1（Plin-1，脂肪细胞标记），胶原1型（Col1a1，纤维化指标），肌球蛋白重链（MHC，成熟肌细胞标记物）。
    1. 对于新鲜分拣的细胞的免疫染色，在室温下以200×g离心12孔板3分钟，以促进细胞粘附到盖玻片/孔中。对于长期培养，此步骤不是必需的。移除培养基。
    2. 对于使用FSP-1进行免疫染色，用1mL 100%甲醇（MeOH）在4°C下固定细胞2分钟。 如果对PDGFRα，Plin-1，Pax7或Col1a1进行免疫染色，请在室温下用1mL 4%PFA在1x PBS中固定细胞培养物15分钟。MHC 免疫染色可耐受任一固定剂。
      注意:对于甲醇固定细胞，请跳过步骤6.2并继续步骤6.3。
  2. 吸出 4% PFA，并用 1x PBS 快速洗涤细胞培养物 3-4 次。在1x PBS中加入1mL 100mM甘氨酸，并在室温下孵育10分钟以灭活残留的PFA。吸出并用1x PBS洗涤1-2次。
    注意:细胞可以在此阶段留在2 mL的1x PBS中，包裹在保鲜膜中并在4°C下储存最多7-10天。
  3. 洗涤后，在1x PBS中加入1mL0.1%Triton-X，孵育20分钟以透化细胞膜。
  4. 用1-2 mL的1x PBS洗涤孔2-3次，然后在室温下用1mL的1x PBS + 3%BSA在每孔中阻断细胞1小时。
  5. 将80μL一抗以1x PBS + 3%BSA（PDGFRα 1:100，Pax7纯，FSP-1 1:50，Plin-1 1:400，Col1a1 1:250，MHC 3μg/ mL）稀释到一块贴在移动容器上的副膜上。使用无菌细镊子，小心地将盖玻片从孔中取出，倒置到抗体溶液的液滴上。用两张湿纸巾孵育盖玻片，并将容器盖在塑料薄膜中，以避免抗体溶液蒸发。在4°C下孵育过夜。
    注意:与孔内染色（最小500μL）相比，从孔中染色盖玻片使用更少的抗体（〜80μL）。
  6. 第2天，将盖玻片在室温下放置30分钟以加热。使用镊子小心地向右移走并将盖玻片移回各自的孔（细胞朝上），并用1-2 mL的1x PBS洗涤2-3次，每次2分钟，以去除尽可能多的一抗。
  7. 使用与一抗染色相同的染色技术，用山羊抗兔Alexa Fluor 488二抗（1:400）染色细胞，以检测FSP-1，Plin-1，Col1a1或PDGFRα和山羊抗小鼠Alexa Fluor 555二抗（1:300）以检测MHC或Pax-7。在室温下孵育细胞1小时，并保持细胞免受光照。
  8. 将细胞返回孔中，并在室温下用Hoechst（1:10，000）孵育细胞2-4分钟。用1x PBS洗涤细胞2-3次，每次2分钟，以除去多余的Hoechst。
  9. 使用防褪色荧光安装介质将盖玻片安装到载玻片上，并使载玻片在室温下在黑暗中干燥过夜。将安装的盖玻片存放在4°C的黑暗中。

7. 培养的FAPs和MP的油红O（ORO）染色

  1. 对非透化细胞进行ORO染色，因为细胞膜的透化可导致非脂肪性细胞类型的非特异性/不希望的染色。在开始染色之前，准备一个ORO工作储备（参见食谱的 补充文件）并在室温下孵育20分钟。
  2. 20分钟后，使用0.2μm过滤器过滤溶液，以除去任何未溶解的聚集体。
  3. 从孔中吸取培养基，加入1 mL 10%中性缓冲福尔马林（10%NBF）。在室温下孵育5分钟。
    注意:细胞汇合可能导致从孔/盖玻片中抬起。吸气/添加溶液时要小心。
  4. 吸出并加入1 mL新鲜的10%NBF，并在室温下孵育至少1小时。
    注意:此时可以停止该协议，因为细胞可以在10%NBF中过夜。
  5. 用1mL 60%异丙醇快速洗涤孔一次，然后吸出并让孔完全干燥（约2分钟）。
  6. 每孔加入400μL油红O工作液，并在室温下孵育10分钟，确保避免移液板壁上的任何ORO。
  7. 除去所有油红O，用dH2O快速清洗孔4次。
    注:如果染色的孔中含有盖玻片，请使用步骤 6.9 中所述的相同技术进行安装。
  8. 使用明场显微镜对安装的盖玻片或染色的孔进行成像。

8. 对侧和去神经凋亡大鼠腓肠肌切片的组织染色

  1. Picrosirius Red （PSR）
    1. 如前所述，对5μm厚，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）大鼠腓肠肌组织学切片进行PSR染色。
  2. 油红 O （ORO）
    1. 将5μm厚的异戊烷冷冻大鼠腓肠肌组织切片固定在4%PFA中10分钟，在60%异丙醇中孵育1分钟。
    2. 用ORO工作底液染色12分钟。在60%异丙醇中孵育1分钟，在dH2O中洗涤10分钟，使用水溶性安装介质安装在盖玻片上。
  3. Sca-1 和层粘连蛋白组织荧光免疫组化 （IHC）
    1. 对5μm厚的异戊烷冷冻大鼠腓肠肌组织学切片进行荧光IHC。
    2. 将样品在1x PBS中水合5分钟，在4%PFA中固定10分钟，然后将样品在组织IF封闭溶液中孵育90分钟。
    3. 用抗Sca-1一抗（1:500）在4°C下稀释在1x PBS + 0.05%吐温中孵育过夜。
    4. 在第2天，在1x PBS + 0.05%吐温中洗涤三次，每次5分钟，然后在山羊抗兔Alexa Fluor 555（1:500）中孵育1小时。
    5. 再次洗涤（如以前一样），用封闭溶液孵育1小时，然后加入抗层粘连蛋白一抗（1:500），在1x PBS + 0.05%吐温中稀释1小时。
    6. 再次洗涤（像以前一样），然后在山羊抗兔Alexa Fluor 488（1:500）中孵育1小时（用于层粘连蛋白）。
    7. 再次洗涤（像以前一样），然后在DAPI（1:10，000）中孵育4分钟。使用防褪色安装介质清洗并安装到盖玻片上。

结果

使用包括 Sca-1 和 VCAM-1 在内的新型抗体组合，通过流式细胞术鉴定 FAP 和MP
用于识别大鼠肌肉中FAPs的门控策略基于小鼠29的流式细胞术方案，其门控CD31（内皮）和CD45（造血）阳性细胞（称为谱系[Lin]），并检查来自谱系阴性（Lin-）群体的FAPs标志物Sca-1和MP标记ITGA7的荧光谱。在缺乏市售的荧光团偶联和流式细胞术验证的大鼠Sca...

讨论

对于希望研究由于生物学或技术原因在小鼠中不可行的损伤模型的研究人员来说，针对大鼠肌肉的优化，经过验证的FAPs分离方案至关重要。例如，小鼠不是研究慢性局部或神经退行性损伤（如长期去神经支配）的最佳动物模型。从生物学上讲，小鼠的短寿命和快速衰老使得由于衰老混杂因素的去神经支配而难以准确描绘肌肉特征。从技术角度来看，由于严重萎缩导致的肌肉质量急剧减少不足以进...

披露声明

作者没有冲突要披露。

致谢

我们要感谢渥太华大学的流式细胞术核心设施和基南生物医学科学研究中心（KRC），多伦多圣迈克尔斯医院Unity Health在优化本手稿中介绍的流式细胞术/ FACS方案方面的专业知识和指导。这项工作由医学设计新想法2018年基金（MbDNI-2018-01）资助给JB。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL Polypropylene Round-Bottom TubeFalcon352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer CapFalcon352235
10 cm cell culture dishesSarstedt83.3902
12-well cell culture plateThermoFisher130185
12 mm glass coverslips, No.2VWR89015-724
10 mL SyringeBeckton Dickenson302995
15 mL centrifuge tubesFroggaBio91014
20 gauge needleBeckton Dickenson305176
25mL Serological pipetteSarstedt86.1685.001
40µm cell strainerFisher Scientific22363547
50mL centrifuge tubesFroggaBioTB50
AbC Total Antibody Compensation Beads ThermoFisherA10497
Ammonium Chloride, Reagent GradeBioshopAMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µgBiotium92307
Aquatex Aqueous Mounting MediumMerck108562
Biolaminin 411 LNBiolaminaLN411
Bovine Serum Albumin (BSA)BioshopALB001
Calcium ChlorideBioshopCCL444.500
Collagenase Type IIGibco17101015
CountBright Plus Absolute Counting BeadsThermoFisherC36995
DexamethasoneMillipore SigmaD4902
DispaseGibco17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Gibco11995-065(+)4.5 g/L D-Glucose
(+)L-Glutamine
(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTAFisherScientificS311
FACSClean SolutionBeckton Dickenson340345
FACSDiva SoftwareBeckton Dickenson--
FACSRinse SolutionBeckton Dickenson340346
Fetal Bovine SerumSigmaF1051
Flow Cytometry Sheath FluidBeckton Dickenson342003
FlowJo SoftwareBeckton Dickenson--
Fluorescent Mounting MediumDakoS302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibodyInvitrogenA21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibodyInvitrogenA11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibodyInvitrogenA21429
Goat SerumGibco16210-064
Ham's F10 MediaThermoFisher 11550043(+) Phenol Red
(+) L-Glutamine
(-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)Multicell311-513-CL
Heat Inactivated Horse SerumGibco26050-088
HemocytometerReichertN/A
HEPES, minimum 99.5% titrationSigmaH3375
Horse SerumThermoFisher16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1)Cell Signaling8915LF
Humulin RLillyHI0210
IBMXMillipore SigmaI5879Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
IsopropanolSigmaI9516Also known as 2-propanol
Lewis Rat, FemaleCharles River Kingston004 (Strain Code)200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop CytometerBeckton Dickenson--
MicrocentrifugeEppendorfEP-5417R
MoFlo XDP Cell SorterBeckman Coulter--
Mouse Anti-CD31::FITC AntibodyAbcamab33858Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC AntibodyBiolegend202205Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE AntibodyBiolegend200403Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/AAlso known as MF20
Mouse Anti-Pax7 AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 %SigmaHT501128
Oil Red OMillipore SigmaO0625
PE-Cy7 Conjugation KitAbcamab102903
Penicillin-StreptomycinSigma P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)Gibco10010-023(-)Calcium Chloride
(-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent GradeBioshopPBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) AntibodyInvitrogenMA5-32347FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 AntibodyAbcamab203254
Rabbit Anti-Laminin AntibodySigmaL9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 AntibodyAbcamab3526
Rabbit Anti-Sca-1 AntibodyMillipore SigmaAB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I AntibodyAbcamab260043Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha AntibodyAbcamab203491
Recombinant Human FGF-basicGibcoPHG0266
Sodium AzideSigmaS2002
Triton-X-100Fisher ScientificBP151
TroglitazoneMillipore SigmaT2573
Tween-20BioshopTWN510

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