大鼠骨骼肌中纤维-脂肪源性祖细胞（FAPs）和肌源性祖细胞（MPs）的鉴定、分离和表征

摘要

该协议概述了一种从大鼠骨骼肌中分离纤维脂肪源性祖细胞（FAPs）和肌源性祖细胞（MPs）的方法。在肌肉损伤模型中利用大鼠为分析提供了来自萎缩肌的组织可用性的增加，以及用于评估自由移动动物的肌肉力量和步态的更多经过验证的方法。

摘要

纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）是骨骼肌中的常驻间质细胞，与肌原祖细胞（MPs）一起在肌肉稳态，损伤和修复中起关键作用。目前用于FAPs鉴定和分离的方案使用流式细胞术/荧光激活细胞分选（FACS），迄今为止 在体内 评估其功能的研究仅在小鼠中进行。大鼠较大的固有尺寸允许对骨骼肌损伤模型中的FAPs进行更全面的分析，特别是在严重萎缩的肌肉中，或者当研究人员需要大量的组织质量进行多次下游测定时。大鼠还提供了更多不需要动物镇静或牺牲的肌肉功能测定选择，从而通过进行连续评估来最大限度地减少发病率和动物使用。针对小鼠优化的流式细胞术/ FACS方案具有物种特异性，特别是受市售抗体特性的限制。它们尚未针对将FAPs与大鼠或高度纤维化肌肉分离进行优化。基于表面标志物CD31，CD45，Sca-1和VCAM-1的差异表达，开发了一种流式细胞术/ FACS方案，用于从健康和去神经化大鼠骨骼肌中鉴定和分离FAPs和MP。由于大鼠特异性，流式细胞术验证的一抗受到严重限制，因此进行了靶向Sca-1的抗体的内部偶联。使用该协议，确认了成功的Sca-1偶联，并通过细胞培养和FACS分离的FAP和MP的免疫染色来验证FAP和MP的流式细胞术鉴定。最后，我们在延长（14周）大鼠去神经支配模型中报告了一种新的FAPs时间过程。这种方法为研究人员提供了在新型动物模型中研究FAPs的能力。

引言

纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）是骨骼肌中常驻的多能祖细胞群，在肌肉稳态，修复和再生中起关键作用，相反，还介导对肌肉损伤的病理反应。顾名思义，FAPs最初被确定为具有分化成成纤维细胞和脂肪细胞¹的潜力的祖细胞群体，并且据称是慢性损伤和疾病中骨骼肌纤维脂肪浸润的关键介质。进一步的研究表明，FAPs还具有成骨和软骨形成^2，3，4的能力。因此，它们在文献中被更广泛地标记为间充质或基质祖3，5，6，7，8。在急性骨骼肌损伤中，FAPs通过短暂增殖间接帮助再生肌生成，为激活的肌肉卫星细胞及其下游肌原祖（MPs）对应物^1，9，10提供有利的环境。在成功再生的同时，FAPs经历凋亡，使其数量恢复到基线水平

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研究方案

执行该协议的调查人员必须获得当地动物伦理委员会/护理委员会的许可。所有动物工作均由圣迈克尔医院团结健康多伦多动物护理委员会（ACC #918）批准，并根据加拿大动物护理委员会（CCAC）制定的指导方针进行。流式细胞术方案的示意图如图 1所示。如果下游应用是FACS和随后的细胞培养，则应使用适当的无菌技术完成所有步骤。

1. 肌肉收割

1. 根据当地动物饲养场和动物伦理委员会指南，使用适当的麻醉剂和牺牲对大鼠进行麻醉。例如，该协议从成年雌性刘易斯大鼠（200-250g）收获腓肠肌。使用2-3%异氟醚麻醉大鼠，并通过心内注射T61来处死大鼠。
2. 一旦动物被处死，剃掉整个后肢，以促进肌肉的位置，并尽量减少收获组织的毛皮污染。
3. 使用无菌手术刀，在皮肤上做两个切口:第一个切口在踝关节的周长周围，第二个在从脚踝到臀部的后肢内侧的中线。
4. 剥离皮肤和浅表肌肉层，露出下方的腓肠肌，它起源于股骨的内侧和外侧髁，插入跟腱。
5. 使用钝性夹层将腓肠肌与周围组织分开，仅通过肌腱处理肌肉，以避免挤压伤。
6. 用锋利的剪刀将跟腱尽可能远端切除，将腓肠肌腱与其插入分开。切开后，用镊子抓住跟腱，轻轻地将腓肠肌从下层骨上剥离。仍然用一只手用镊子握住肌肉，找到腓肠肌的两个起源，并在内侧和外侧股骨髁处切开。
7. 将切除的腓肠肌轻轻擦拭在无....

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结果

使用包括 Sca-1 和 VCAM-1 在内的新型抗体组合，通过流式细胞术鉴定 FAP 和MP
用于识别大鼠肌肉中FAPs的门控策略基于小鼠²⁹的流式细胞术方案，其门控CD31（内皮）和CD45（造血）阳性细胞（称为谱系[Lin]），并检查来自谱系阴性（Lin-）群体的FAPs标志物Sca-1和MP标记ITGA7的荧光谱。在缺乏市售的荧光团偶联和流式细胞术验证的大鼠Sca.......

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讨论

对于希望研究由于生物学或技术原因在小鼠中不可行的损伤模型的研究人员来说，针对大鼠肌肉的优化，经过验证的FAPs分离方案至关重要。例如，小鼠不是研究慢性局部或神经退行性损伤（如长期去神经支配）的最佳动物模型。从生物学上讲，小鼠的短寿命和快速衰老使得由于衰老混杂因素的去神经支配而难以准确描绘肌肉特征。从技术角度来看，由于严重萎缩导致的肌肉质量急剧减少不足以进.......

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap	Falcon	352235
10 cm cell culture dishes	Sarstedt	83.3902
12-well cell culture plate	ThermoFisher	130185
12 mm glass coverslips, No.2	VWR	89015-724
10 mL Syringe	Beckton Dickenson	302995
15 mL centrifuge tubes	FroggaBio	91014
20 gauge needle	Beckton Dickenson	305176
25mL Serological pipette	Sarstedt	86.1685.001
40µm cell strainer	Fisher Scientific	22363547
50mL centrifuge tubes	FroggaBio	TB50
AbC Total Antibody Compensation Beads	ThermoFisher	A10497
Ammonium Chloride, Reagent Grade	Bioshop	AMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µg	Biotium	92307
Aquatex Aqueous Mounting Medium	Merck	108562
Biolaminin 411 LN	Biolamina	LN411
Bovine Serum Albumin (BSA)	Bioshop	ALB001
Calcium Chloride	Bioshop	CCL444.500
Collagenase Type II	Gibco	17101015
CountBright Plus Absolute Counting Beads	ThermoFisher	C36995
Dexamethasone	Millipore Sigma	D4902
Dispase	Gibco	17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)	Gibco	11995-065	(+)4.5 g/L D-Glucose (+)L-Glutamine (+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTA	FisherScientific	S311
FACSClean Solution	Beckton Dickenson	340345
FACSDiva Software	Beckton Dickenson	--
FACSRinse Solution	Beckton Dickenson	340346
Fetal Bovine Serum	Sigma	F1051
Flow Cytometry Sheath Fluid	Beckton Dickenson	342003
FlowJo Software	Beckton Dickenson	--
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody	Invitrogen	A21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody	Invitrogen	A11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody	Invitrogen	A21429
Goat Serum	Gibco	16210-064
Ham's F10 Media	ThermoFisher	11550043	(+) Phenol Red (+) L-Glutamine (-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)	Multicell	311-513-CL
Heat Inactivated Horse Serum	Gibco	26050-088
Hemocytometer	Reichert	N/A
HEPES, minimum 99.5% titration	Sigma	H3375
Horse Serum	ThermoFisher	16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1)	Cell Signaling	8915LF
Humulin R	Lilly	HI0210
IBMX	Millipore Sigma	I5879	Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
Isopropanol	Sigma	I9516	Also known as 2-propanol
Lewis Rat, Female	Charles River Kingston	004 (Strain Code)	200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer	Beckton Dickenson	--
Microcentrifuge	Eppendorf	EP-5417R
MoFlo XDP Cell Sorter	Beckman Coulter	--
Mouse Anti-CD31::FITC Antibody	Abcam	ab33858	Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC Antibody	Biolegend	202205	Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE Antibody	Biolegend	200403	Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	N/A	Also known as MF20
Mouse Anti-Pax7 Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 %	Sigma	HT501128
Oil Red O	Millipore Sigma	O0625
PE-Cy7 Conjugation Kit	Abcam	ab102903
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)	Gibco	10010-023	(-)Calcium Chloride (-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent Grade	Bioshop	PBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody	Invitrogen	MA5-32347	FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody	Abcam	ab203254
Rabbit Anti-Laminin Antibody	Sigma	L9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody	Abcam	ab3526
Rabbit Anti-Sca-1 Antibody	Millipore Sigma	AB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody	Abcam	ab260043	Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody	Abcam	ab203491
Recombinant Human FGF-basic	Gibco	PHG0266
Sodium Azide	Sigma	S2002
Triton-X-100	Fisher Scientific	BP151
Troglitazone	Millipore Sigma	T2573
Tween-20	Bioshop	TWN510