JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتيح الإدخال الانتقالي المشترك في الأقراص النانوية المشكلة مسبقا دراسة بروتينات الغشاء المركبة الخالية من الخلايا في بيئات دهنية محددة دون ملامسة المنظفات. يصف هذا البروتوكول إعداد مكونات النظام الأساسية والمعلمات الحرجة لتحسين كفاءة التعبير وجودة العينة.

Abstract

تسمح أنظمة التعبير الخالية من الخلايا بالتصميم المصمم خصيصا لبيئات التفاعل لدعم الطي الوظيفي حتى للبروتينات المعقدة مثل بروتينات الغشاء. يتم توضيح الإجراءات التجريبية للإدخال والطي الانتقالي المشترك لبروتينات الغشاء في أغشية سابقة التشكيل ومحددة يتم توفيرها كأقراص نانوية. البروتوكول خال تماما من المنظفات ويمكنه توليد ملليغرام من العينات النقية في غضون يوم واحد. يمكن استخدام عينات بروتين الغشاء / القرص النانوي الناتجة لمجموعة متنوعة من الدراسات الوظيفية والتطبيقات الهيكلية مثل التبلور أو الرنين المغناطيسي النووي أو المجهر الإلكتروني. يتم وصف إعداد المكونات الرئيسية الأساسية مثل lysates الخالية من الخلايا ، والأقراص النانوية ذات الأغشية المصممة ، وحلول المخزون الحرجة ، بالإضافة إلى تجميع تفاعلات التعبير الخالية من الخلايا المكونة من جزأتين. نظرا لأن متطلبات الطي لبروتينات الغشاء يمكن أن تكون متنوعة للغاية ، فإن التركيز الرئيسي لهذا البروتوكول هو تعديل المعلمات وخطوات التفاعل المهمة لجودة العينة مثل مركبات التفاعل الأساسية الحرجة ، أو تكوين غشاء الأقراص النانوية ، أو بيئة الأكسدة والاختزال والمرافقة ، أو تصميم قالب الحمض النووي. يتم إثبات العملية برمتها من خلال تخليق البروتيورهودوبسين ومستقبلات G-protein المقترنة.

Introduction

تعتبر بروتينات الغشاء (MPs) أهدافا صعبة في دراسات إنتاج البروتين بسبب عدم قابليتها للذوبان في البيئات المائية. تشتمل منصات إنتاج MP التقليدية على أنظمة قائمة على الخلايا مثل E. coli أو الخميرة أو الخلايا حقيقية النواة. يتم استخراج أعضاء البرلمان المؤتلف المركب إما من أغشية الخلايا أو إعادة طيها من أجسام التضمين1. بعد ذوبان المنظفات ، يمكن نقل النواب إلى بيئات غشائية مناسبة من خلال بروتوكولات إعادة التشكيل في المختبر. إلى جانب الحويصلات والجسيمات الشحمية ، أصبحت إعادة تشكيل MP في أغشية مستوية في شكل أقراص نانوية2 أو جسيمات ساليبرو3 تقنيات روتينية في الآونة الأخيرة. ومع ذلك ، فإن كل هذه الاستراتيجيات تنطوي على اتصال المنظفات مع النواب التي يمكن أن تؤدي إلى زعزعة الاستقرار ، وتفكك oligomers ، وحتى فقدان بنية البروتين والنشاط4. وبالتالي ، يمكن أن يكون فحص ظروف الذوبان وإعادة التشكيل المثلى للمنظفات مملا ويستغرق وقتا طويلا5.

تسمح الطبيعة المفتوحة للأنظمة الخالية من الخلايا (CF) بتزويد تفاعل التعبير مباشرة بأغشية مسبقة التشكيل ذات تركيبة دهنية محددة. في وضع التعبير القائم على الدهون هذا (L-CF) ، تتاح للنواب المركبين الفرصة للإدراج بشكل مشترك في الطبقات الثنائية المقدمة 6,7 (الشكل 1). يبدو أن الأقراص النانوية التي تتكون من بروتين سقالة غشائية (MSP) يحيط بقرص ثنائي الطبقة من الدهون المستوية8 مناسبة بشكل خاص لهذه الاستراتيجية 9,10. يمكن تجميع الأقراص النانوية بشكل روتيني في المختبر مع مجموعة متنوعة من الدهون المختلفة ، فهي مستقرة للغاية ، ويمكن تركيز المخزونات حتى 1 ملليمتر. ومع ذلك ، فإن تعبير MSP في E. coli وتنقيته ضروري. كاستراتيجية بديلة ، يمكن التعبير عن MSP بشكل مشترك مع النائب المستهدف في تفاعلات CF المزودة بالجسيمات الشحمية 11،12،13. تتم إضافة قوالب الحمض النووي لكل من MSP و MP إلى التفاعل ويمكن أن تتشكل أقراص MP / nanodiscs عند التعبير. في حين يتم تجنب إنتاج MSP ، تتطلب استراتيجية التعبير المشترك ضبطا دقيقا دقيقا لتركيزات قالب الحمض النووي النهائي ويمكن توقع اختلافات أعلى في كفاءة إنتاج العينات.

إن الإدخال الانتقالي المشترك للنواب في أغشية الأقراص النانوية سابقة التشكيل هو آلية غير فسيولوجية ولا تزال غير معروفة إلى حد كبير مستقلة عن آلات translocon وتسلسلات الإشارات13،14،15،16. المحددات الرئيسية لكفاءة الإدخال هي نوع بروتين الغشاء وكذلك تكوين الدهون في الغشاء المقدم ، مع تفضيل متكرر للدهون سالبة الشحنة15,17. نظرا لأن أغشية الأقراص النانوية محصورة نسبيا في الحجم ، يتم إطلاق كمية كبيرة من الدهون عند إدخال MP18. يتيح اختلاف حجم القرص النانوي إدخال وضبط مجمعات MP قليلة القلة الأعلى15,18. من بين أمور أخرى ، تم عرض التجميع الصحيح للمجمعات المتجانسة للقناة الأيونية KcsA ، وللمضخة الأيونية proteorhodopsin (PR) ولنقل الأدوية المتعددة EmrE15,18. من المرجح أن يدخل النواب غشاء القرص النانوي المتماثل من كلا الجانبين بتردد متساو نسبيا. لذلك ينبغي اعتبار أن المونومرات المختلفة أو الأوليغومرات التي يتم إدخالها في قرص نانوي واحد قد يكون لها اتجاهات متعاكسة. ومع ذلك ، يمكن أن يحدث التحيز في التوجه بسبب آليات الإدراج التعاونية كما هو مذكور لتشكيل hexamers PR و KcsA tetramers18. قد ينتج تحيز آخر في اتجاه MP عن مفاتيح توجيه النواب المدخلين ربما على حافة أغشية القرص النانوي.

يعد إنتاج محللات التليف الكيسي من سلالات الإشريكية القولونية تقنية روتينية موثوقة ويمكن إجراؤها في أي مختبر كيميائي حيوي تقريبا19,20. يجب مراعاة أنه إلى جانب تكوين جسر ثاني كبريتيد ، فإن معظم التعديلات الأخرى بعد الترجمة غائبة إذا تم تصنيع MP باستخدام E. coli lysates. في حين أن هذا قد يولد عينات أكثر تجانسا للدراسات الهيكلية ، فقد يكون من الضروري استبعاد الآثار المحتملة على وظيفة أهداف MP. ومع ذلك ، فإن الإنتاج الفعال لعينات عالية الجودة من مستقبلات البروتين G المقترنة (GPCR) 14،21،22 ، أو ناقلات حقيقية النواة 23 أو تجمعات كبيرة غير متجانسة 24 في محللات E. coli CF تشير إلى ملاءمتها حتى للأهداف المعقدة. يمكن الحصول على كميات المقياس التحضيري (≈ 1 ملغم/مل) من العينة باستخدام تكوين خلية التبادل المستمر الخالي من الخلايا (CECF) المكون من مقصورتين، والذي يتكون من خليط تفاعل (RM) وحجرة خليط تغذية (FM). يتجاوز حجم FM حجم RM من 15 إلى 20 ضعفا ويوفر خزانا من مركبات الطاقة منخفضة الوزن الجزيئي والسلائف19. وبالتالي يتم تمديد تفاعل التعبير لعدة ساعات ويتم زيادة العائد النهائي لهدف MP. يتم فصل مقصورات RM و FM بواسطة غشاء غسيل الكلى مع قطع 10-14 kDa. تتطلب المقصورتان تصميما خاصا لحاوية تفاعل CECF (الشكل 1). أشرطة غسيل الكلى التجارية كحاويات RM في تركيبة مع حاويات زجاجية شبكية مصممة خصيصا تحمل FM هي أمثلة مناسبة. يمكن التلاعب بعوائد MP بشكل أكبر عن طريق تعديل نسب RM: FM أو عن طريق تبادل FM بعد فترة معينة من الحضانة.

غالبا ما يتطلب العائد وجودة MP تحسينا مكثفا لمعلمات التفاعل. ميزة مهمة لتعبير CF هي إمكانية تعديل وضبط أي مركب تقريبا وفقا للمتطلبات الفردية ل MP. تتمثل الاستراتيجية المباشرة في التركيز أولا على تحسين إنتاجية MP من خلال إنشاء بروتوكول إنتاج أساسي ثم تحسين جودة MP من خلال ضبط التفاعل وظروف الطي. يؤدي غياب العمليات الفسيولوجية في محللات CF وانخفاض تعقيدها إلى ارتفاع معدلات النجاح للإنتاج الفعال ل MPs25. الاعتبارات الروتينية لتصميم قالب الحمض النووي وتحسين تركيز أيون Mg 2+ كافية في معظم الحالات للحصول على عوائد مرضية26. اعتمادا على وضع التعبير ، يمكن أن يصبح تحسين جودة MP مستهلكا للوقت ، حيث يجب فحص مجموعة أكبر من المعلمات14،17،22.

لإنشاء منصة التعبير CF الموصوفة ، تعد البروتوكولات ضرورية لإنتاج محللات E. coli CF (i) ، وبوليميراز الحمض النووي الريبي T7 (ii) ، والأقراص النانوية (iii) ، ومركبات تفاعل CECF الأساسية (iv) (الشكل 1). وكثيرا ما تستخدم مشتقات سلالة E. coli K12 A1927 أو BL21 لإعداد S30 الفعال (الطرد المركزي عند 30000 × g) lysates. إلى جانب الليزات S30 ، يمكن استخدام الليزات المقابلة التي يتم طردها مركزيا في قوى g أخرى (مثل S12). تختلف الليزات في كفاءة التعبير وفي تعقيد البروتين. تمت دراسة بروتيوم S30 lysate الذي أعده البروتوكول الموصوف بالتفصيل28. لا يزال بروتين S30 يحتوي على بعض بروتينات الغشاء الخارجي المتبقية التي يمكن أن تسبب مشاكل خلفية عند التعبير عن القنوات الأيونية وتحليلها. بالنسبة لهذه الأهداف ، يوصى باستخدام محللات S80-S100. تعديل قيم أثناء إعداد lysate هو تحريض استجابة SOS عن طريق الجمع بين الصدمة الحرارية وإمدادات الإيثانول في مرحلة نمو منتصف السجل للخلايا. يتم إثراء محللات HS30 الناتجة في المرافقين ويمكن استخدامها في المزج مع S30 lysates لتحسين MP قابل للطي22. يتم تشغيل تعبير CF في محللات E. coli كعملية نسخ / ترجمة مقترنة مع قوالب الحمض النووي التي تحتوي على المروجين الذين يتم التحكم فيهم بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 (T7RNAP). يمكن إنتاج الإنزيم بكفاءة في خلايا النجوم BL21 (DE3) التي تحمل البلازميد pAR121929.

يتم تجميع نسختين من MSP1E3D1 في قرص نانوي واحد يبلغ قطره 10-12 نانومتر، ولكن البروتوكول الموضح أدناه قد يعمل أيضا مع مشتقات MSP الأخرى. ومع ذلك ، فإن الأقراص النانوية الأكبر من تلك التي تم تشكيلها باستخدام MSP1E3D1 تميل إلى أن تكون أقل استقرارا في حين أن الأقراص النانوية الأصغر التي تم تشكيلها باستخدام مشتقات MSP مثل MSP1 قد لا تستوعب MPs أو مجمعات MP. يمكن تجميع الأقراص النانوية MSP1E3D1 في المختبر مع مجموعة كبيرة ومتنوعة من الدهون المختلفة أو مخاليط الدهون. عادة ما تكون الأقراص النانوية سابقة التشكيل مستقرة لمدة > 1 سنة عند -80 درجة مئوية ، في حين أن الاستقرار قد يختلف لمكونات الدهون المختلفة. لفحص تأثيرات الدهون على طي واستقرار MP، فمن الضروري إعداد مجموعة شاملة من الأقراص النانوية التي تم تجميعها مع مجموعة متنوعة تمثيلية من الدهون / مخاليط الدهون. الدهون التالية قد تعطي اختيار بداية جيدة: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG) ، 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) ، 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (DOPG) ، 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) ، 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG) و 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC).

يتم وصف بروتوكول لإعداد تفاعل CECF 3 مل. من الممكن إجراء المزيد من التحجيم لأعلى أو لأسفل بنسبة 1: 1. بالنسبة لتكوين CECF المكون من جزأين ، يجب إعداد RM يحتوي على جميع المركبات و FM يحتوي فقط على المركبات منخفضة الوزن الجزيئي. يمكن استخدام أجهزة غسيل الكلى التجارية سعة 3 مل مع 10-14 كيلو دالتون MWCO كحاويات RM ، والتي يتم وضعها بعد ذلك في حاويات زجاجية شبكية مخصصة تحمل FM (الشكل 1D)30. نسبة RM:FM هي 1:20 ، لذلك يجب إعداد 60 مل من FM ل 3 مل RM. يمكن أن تكون جودة أو تركيز أو نوع العديد من المكونات حاسمة بالنسبة للعائد النهائي و / أو جودة MP المركب (الجدول 1). يجب إعداد قوالب الحمض النووي وفقا للمبادئ التوجيهية المنشورة ويمكن أن يؤدي تحسين الكودون لإطار القراءة للهدف إلى زيادة تحسين إنتاجية المنتج بشكل كبير26. بالنسبة لتفاعل CECF على نطاق تحضيري ، يتم وصف بروتوكول ثابت لإنتاج العلاقات العامة. لإنشاء بروتوكولات تعبير للنواب الجدد ، من الضروري عادة إجراء شاشات تحسين لبعض المركبات (الجدول 1) لتحسين الإنتاجية والجودة. بالنسبة لأيونات Mg2+ ، يوجد تركيز مثالي جيد التركيز يظهر في كثير من الأحيان تباينا كبيرا لقوالب الحمض النووي المختلفة. مركبات تفاعل CF الأخرى مثل دفعات جديدة من T7RNAP أو S30 lysates قد تزيد من تحويل تركيز Mg2+ الأمثل. على سبيل المثال ، يتم وصف شاشة Mg 2+ نموذجية ضمن نطاق تركيز14-24 mM وفي خطوات من 2 mM. يتم فحص كل تركيز في تكرارات وفي تفاعلات CECF على نطاق تحليلي. كحاوية تفاعل CECF ، يتم استخدام حاويات زجاجية Mini-CECF Plexiglas30 المصممة خصيصا والتي تحمل RM مع لوحات صغيرة قياسية ذات 24 بئرا تحمل FM (الشكل 1B). وبدلا من ذلك، يمكن استخدام خراطيش غسيل الكلى التجارية مع الصفائح الدقيقة للآبار ذات العمق 96 أو غيرها من أجهزة الدياليزر التجارية في الإعدادات المناسبة (الشكل 1C).

Protocol

1. إعداد S30 lysate

  1. اليوم 1: اخرج الخلايا من مخزون الجلسرين على صفيحة أجار LB واحتضنها عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  2. اليوم 2: قم بتلقيح 200 مل من وسط LB مع الخلايا من صفيحة الأجار واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 12-14 ساعة.
  3. اليوم 3: قم بتلقيح 10 لتر من وسط YPTG المعقم (10 جم / لتر من مستخلص الخميرة ، 16 جم / لتر من التريبتون ، 5 جم / لتر من كلوريد الصوديوم ، 19.8 جم / لتر من الجلوكوز ، 4.4 مللي مترKH 2 PO4 ، 8 mM K2HPO4) مخفف إلى 37 درجة مئوية في مفاعل خزان مقلي سعة 15 لتر مع 100 مل من ما قبل الزرع (1:100). تزرع عند 37 درجة مئوية ، 500 دورة في الدقيقة وتهوية عالية (~ 3 أحجام هواء في الدقيقة). لمنع الرغوة المفرطة ، أضف رغوة معقمة.
  4. قياس الكثافة البصرية (OD) عند 600 نانومتر في فترات زمنية منتظمة. بعد حوالي 2 ساعة ، ستدخل الثقافة مرحلة السجل.
  5. تعديل لمحلل HS30: عندما تكون الخلايا في منتصف مرحلة السجل (OD600 ≈ 3.6-4.2) أضف 300 مل من الإيثانول إلى وسط الاستزراع واستمر في الزراعة عند 42 درجة مئوية ، 500 دورة في الدقيقة ، وتهوية عالية (حوالي 3 أحجام هواء في الدقيقة) لمدة 45 دقيقة أخرى. ثم تابع تبريد وحصاد مزرعة الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.6. لإنتاج محلل S30 القياسي ، تخطى هذه الخطوة وتابع الخطوة 1.6.
  6. عندما تكون الخلايا في منتصف مرحلة السجل (OD600 ≈ 3.6-4.2) ، يقوم جهاز التخمير البارد بالتبريد بدرجة حرارة أقل من 20 درجة مئوية في غضون < 30 دقيقة. يجب أن يكون OD600 النهائي حوالي 4.5-5.5. احصد الخلايا عند 4500 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية وتخلص من السوبرناتانت. حافظ على الخلايا عند 4 درجات مئوية خلال الخطوات التالية.
    ملاحظة: أثناء التبريد ، يمكن أن تحدث رغوة مفرطة. في هذه الحالة ، إما إضافة مضاد للرغوة أو تقليل سرعة التحريك و / أو تقليل تدفق الهواء في المفاعل الحيوي.
  7. قم بتعليق الخلايا تماما في 300 مل من المخزن المؤقت S30-A (10 mM Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.2 ، 14 mM Mg (OAc) 2 ، 60 mM KCl ، 6 mM 2-mercaptoethanol) باستخدام ملعقة متبوعة بسحب التعليق لأعلى ولأسفل حتى التجانس. جهاز طرد مركزي عند 8000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة مرتين.
    تحذير: 2-ميركابتوإيثانول سام. تجنب ملامسة الجلد أو الجهاز التنفسي. إذا كان ذلك ممكنا ، اعمل تحت غطاء محرك السيارة. وزن كوب جهاز الطرد المركزي الفارغ قبل خطوة الغسيل الأخيرة. بعد الطرد المركزي ، قم بوزن حبيبة الخلية الرطبة وإما المضي قدما في الخطوة 1.8 أو تخزين الكريات حتى مزيد من الاستخدام.
    ملاحظة: وزن حبيبة الخلية الرطبة هو 5-7 جم لكل 1 لتر من ثقافة المفاعل الحيوي. في هذه المرحلة ، قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتا ويمكن تجميد الكريات في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية لمدة 4-8 أسابيع.
  8. الخلايا جيدا في 1.1 وحدة تخزين (1 جم = 1 مل) من المخزن المؤقت S30-B (10 mM Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.2 ، 14 mM Mg (OAc) 2 ، 60 mM KOAc ، 1 mM DTT ، قرص واحد من مثبط الأنزيم البروتيني cOmplete). املأ التعليق في خلية ضغط ضغط فرنسية مبردة مسبقا وقم بتعطيل الخلايا عند 1000 رطل لكل بوصة مربعة. تمرير الخلايا من خلال الصحافة الفرنسية مرة واحدة.
  9. قم بطرد مركزي للليزات عند 30000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الفائقة إلى أنبوب جديد وكرر خطوة الطرد المركزي.
    ملاحظة: قد تكون هناك طبقة فضفاضة وغروي موجودة أعلى الكرية بعد الطرد المركزي الأول ، والتي لا ينبغي نقلها مع supernatant.
  10. ضع خطوة عالية الملح والحرارة لإزالة مكونات التحلل غير المستقرة وإطلاق mRNA من الريبوسومات. اضبط الليزات على 0.4 مليون كلوريد الصوديوم واحتضنها عند 42 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة في حمام مائي.
    ملاحظة: ستؤدي هذه الخطوة إلى تكوين راسب كبير. اقلب الأنبوب أو قلبه أثناء الحضانة من وقت لآخر.
  11. انقل التعليق العكر (عادة 50-80 مل) إلى أنابيب غسيل الكلى مع قطع 10-14 kDa وديالي ضد 5 لتر S30-C المخزن المؤقت (10 mM Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.2 ، 14 mM Mg (OAc) 2 ، 60 mM KOAc ، 0.5 mM DTT). استبدل المخزن المؤقت لغسيل الكلى S30-C بعد 2-3 ساعات ودياليز لمدة 12-14 ساعة أخرى.
  12. اليوم 4: انقل التعليق المائل إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي عند 30000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. انقل supernatant (S30 lysate) إلى أنابيب 50 مل طازجة واخلطها برفق. يجب أن يكون تركيز البروتين في الليزات حوالي 30-40 ملغ / مل. قم بتجميد الأليكوتات بالصدمات (على سبيل المثال 0.5 مل ، 1 مل) في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية. الأليكوتس مستقرة لمدة > 1 سنة.

2. التعبير وتنقية بوليميراز الحمض النووي الريبي T7

  1. اليوم 1: قم بتلقيح وسط 200 مل LB يحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين مع خلايا BL21 (DE3) Star x pAR1219 المطلية حديثا واحتضان عند 37 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة لمدة 12-16 ساعة.
  2. اليوم 2: قم بتلقيح مرق رائع سعة 1 لتر (12 جم / لتر من التريبتون ، 24 جم / لتر من مستخلص الخميرة ، 4 مل / لتر جلسرين) في قارورة محيرة سعة 2 لتر مع 10 مل من مرحلة ما قبل الزرع واحتضنها عند 37 درجة مئوية وإثارة 180 دورة في الدقيقة. يجب أن يكون OD600 المبدئي حوالي 0.1.
  3. عندما يصل OD600 إلى 0.6-0.9 ، أضف IPTG إلى تركيز نهائي قدره 1 mM للحث على التعبير T7RNAP ومواصلة الزراعة لمدة 5 ساعات أخرى.
  4. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 4500 × غرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تجميد الخلايا في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
  5. اليوم 3: أضف 30 مل من المخزن المؤقت للتعليق البارد (30 ملليمتر Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.0 مع قرص واحد من مثبط الأنزيم البروتيني cOmplete) إلى حبيبة الخلايا المجمدة وقم بإذابة الكريات في حمام مائي في درجة حرارة الغرفة. ثم ، الكريات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل حتى التجانس.
  6. قم بإجراء تعطيل الخلايا باستخدام مكبس فرنسي كما هو موضح في القسم السابق أو استخدم جهاز صوتنة وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، جهاز طرد مركزي عند 20000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ونقل supernatant إلى أنبوب جديد.
  7. لتعجيل الحمض النووي الجينومي ، أضف كبريتات الستربتومايسين ببطء وتحت إثارة لطيفة إلى supernatant حتى يتم الوصول إلى تركيز نهائي قدره 3٪ (w / v). تحضن في 4 درجات مئوية لمدة 5-10 دقائق تحت إثارة لطيفة. جهاز طرد مركزي عند 20000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  8. قم بتصفية السوبرناتانت بمرشح 0.45 ميكرومتر وقم بتحميله على عمود Q-Sepharose بحجم عمود (CV) يبلغ 40 مل متوازن مع مخزن مؤقت لتوازن CV 2 (30 mM Tris-HCl و pH 8.0 و 10 mM EDTA و 50 mM NaCl و 5٪ glycerol و 10 mM 2-mercaptoethanol) باستخدام مضخة تمعجية بمعدل تدفق 4 مل / دقيقة. بعد ذلك ، قم بتوصيل العمود بكاشف الأشعة فوق البنفسجية واستمر في الاستخلاص باستخدام مخزن مؤقت للتوازن حتى تصل إشارة الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر إلى خط أساس مستقر.
  9. Elute T7RNAP مع تدرج من 50 mM إلى 500 mM NaCl لكل CV بمعدل تدفق 3 مل / دقيقة. جمع كسور 1 مل وإعداد عينات لتحليل SDS-PAGE عن طريق خلط 10 ميكرولتر من كل كسر مع 2 × SDS عينة المخزن المؤقت. قم بتشغيل SDS-PAGE وقم بتلطيخ الجل باستخدام Coomassie Blue R. T7RNAP يجب أن يظهر كشريط بارز عند حوالي 90 كيلو دالتون إلى جانب العديد من النطاقات الإضافية من الشوائب.
  10. كسور المسبح التي تحتوي على T7RNAP والدياليز باستخدام أغشية مع 12-14 kDa MWCO لمدة 12-16 ساعة في المخزن المؤقت لغسيل الكلى (10 mM K 2 HPO 4 /KH2PO4 ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 10 mM NaCl ، 0.5 mM EDTA ، 1 mM DTT ، 5٪ (w / v) الجلسرين).
  11. اليوم 4: جمع محلول T7RNAP والتركيز باستخدام وحدات مرشح مع 12-14 MWCO إلى تركيز نهائي من 3-10 ملغ / مل. قد يبدأ T7RNAP في الترسيب أثناء التركيز. توقف عن التركيز على الفور بمجرد حدوث التعكر في العينة. أضف الجلسرين إلى تركيز نهائي قدره 50٪ (ث / v) واخلطه بلطف. قم بتجميد الصدمات 0.5-1 مل من الأليكوتات وتخزينها عند -80 درجة مئوية. يمكن تخزين أليكوتات T7RNAP العاملة عند -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب الحصول على ما يقرب من 20-40 مل من 5 ملغم / مل T7RNAP المنقى جزئيا مع 20000-40000 وحدة من تخمير 1 لتر. لاختبار الكمية المثلى لكل دفعة T7RNAP ، يجب إجراء تفاعلات التعبير CF للبروتين الفلوري الأخضر (GFP) الذي يحتوي على 0.02 mg / mL-0.1 mg / mL من عينة T7RNAP المحضرة.

3. التعبير وتنقية MSP1E3D1

  1. اليوم 1: قم بتحويل خلايا النجوم E. coli BL21 (DE3) باستخدام متجه pET28(a)-MSP1E3D131 باستخدام تحويل الصدمة الحرارية القياسي أو بروتوكولات المعالجة الكهربائية. قم بإخراج أو لوحة الخلايا المحولة على LB agar التي تحتوي على 30 ميكروغرام / مل kanamycin وتحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
  2. اليوم 2: قم بتلقيح 200 مل من وسط LB مع استكمال 0.5٪ (ث / v) من الجلوكوز و 30 ميكروغرام / مل من الكاناميسين مع مستعمرة واحدة تم التقاطها من صفيحة أجار واحتضانها عند 37 درجة مئوية عند 180 دورة في الدقيقة لمدة 12-16 ساعة.
  3. اليوم 3: قم بتلقيح 10 لتر LB متوسط مكمل بنسبة 0.5٪ (ث / v) من الجلوكوز و 30 ميكروغرام / مل من kanamycin مع 100 مل من ما قبل الزرع في مفاعل حيوي مقلوب. إجراء التخمير عند 37 درجة مئوية ، 500 دورة في الدقيقة وتهوية ما يقرب من 3 أحجام المفاعل الحيوي في الدقيقة. في حالة الرغوة المفرطة ، أضف مضاد الرغوة.
    ملاحظة: يمكن استخدام قوارير الاهتزاز المحيرة بدلا من جهاز التخمير.
  4. عند OD600 من 6.5-7.5 ، أضف IPTG إلى تركيز نهائي قدره 1 mM واستمر في الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 4500 × غرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اغسل كريات الخلايا ب 200 مل من كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ (ث / v) وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 8000 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت وانقل الخلايا إلى أنابيب سعة 50 مل باستخدام ملعقة. وزن الكريات الرطبة المتوقع هو 8-12 جم لكل لتر من ثقافة المفاعل الحيوي. قم بتجميد كريات الخلايا بالصدمات في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
  5. اليوم 4: للتنقية ، قم بإذابة كريات الخلايا في حمام مائي في RT. قم بتعليق الخلايا في المخزن المؤقت MSP-A (40 mM Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 300 mM NaCl ، 1٪ (w / v) Triton X-100 ، قرص واحد من كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني c0mplete لكل تعليق خلوي 50 مل) لإنتاج تعليق خلوي بنسبة 30-40٪ (w / v).
  6. قم بتعطيل الخلايا عن طريق الصوتنة أو باستخدام مكبس فرنسي وأجهزة طرد مركزي عند 30000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. انقل السوبرناتانت إلى أنبوب جديد وقم بالتصفية من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر. ضع الترشيح على عمود حمض النتريلوتريكاسيتيك المحمل ب Ni2+ (CV > 15 mL) المتوازن مع 5 CV من المخزن المؤقت MSP-B (40 mM Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 300 mM NaCl ، 1٪ (w / v) Triton X-100) باستخدام مضخة تمعجية.
    ملاحظة: لتسهيل الترشيح ، يمكن صوتنة supernatant لمدة دقيقة أخرى لتحطيم شظايا الحمض النووي الكبيرة.
  7. بعد تحميل العينة، اغسل العمود ب 5 CV MSP-B، و 5 CV MSP-C (40 mM Tris-HCl، و pH 8.9، و 300 mM NaCl، و 50 mM حمض الكوليك)، و 5 CV MSP-D (40 mM Tris-HCl، و pH 8.9، و 300 mM NaCl)، و 5 CV MSP-E (40 mM Tris-HCl، و pH 8.0، و 300 mM NaCl) و 5 CV MSP-F (40 mM Tris-HCl، والرقم الهيدروجيني 8.0، 300 ملليمتر كلوريد الصوديوم، 50 ملليمتر إيميدازول).
    ملاحظة: حمض الكوليك في المخزن المؤقت MSP-C مهم لإزالة الدهون المرتبطة ب MSP. حمض الكوليك غير قابل للذوبان تماما عند قيم الأس الهيدروجيني المنخفضة. لذلك يجب تعديل قيمة الرقم الهيدروجيني إلى 8.9 في MSP-C و MSP-D. من المهم غسل العمود باستخدام المخزن المؤقت MSP-D ، لأن انخفاض درجة الحموضة قد يتسبب في ترسب حمض الكوليك المتبقي وسد العمود أو إتلافه.
  8. Elute MSP مع MSP-G (40 mM Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 300 mM NaCl ، 300 mM imidazole). جمع كسور من 1 مل ومراقبة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر. جمع وتجميع كسور ذروة الاستخراج.
  9. نقل كسور MSP المجمعة إلى أنابيب غشاء غسيل الكلى MWCO 12-14 kDa ودياليز مقابل 5 لتر من MSP-H (40 mM Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 300 mM NaCl ، 10٪ (w / v) الجلسرين) لمدة 2-3 ساعات عند 4 درجات مئوية. قم بالتغيير إلى مخزن مؤقت MSP-H طازج سعة 5 لترات وقم بدياليز لمدة 12-16 ساعة أخرى عند 4 درجات مئوية.
  10. اليوم 5: انقل محلول MSP إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي عند 18000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة الراسب. انقل supernatant إلى أنبوب جديد وركز إلى 200-800 ميكرومتر باستخدام أجهزة الترشيح الفائق مع 12-14 kDa MWCO عند 4 درجات مئوية. قياس التركيز باستخدام جهاز قياس الأشعة فوق البنفسجية/VIS. استخدم معامل الانقراض 27.31 M-1 cm-1 والكتلة الجزيئية 31.96 kDa لحساب التركيز.
    ملاحظة: عادة ما ينتج عن التعبير في المفاعل الحيوي 15-30 ملغ من MSP1E3D1 لكل مزرعة لتر.
  11. الاقتباسات المجمدة بالصدمات من محلول MSP المركز في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية.

4. تجميع الأقراص النانوية MSP1E3D1

  1. اليوم1: تحضير 1-2 مل من مخزون الدهون 50 مللي متر (DMPG ، DOPG ، POPG DMPC ، DOPC أو POPC) في كولات الصوديوم 100 mM. يخزن على درجة حرارة -20 درجة مئوية إذا لم يستخدم في نفس اليوم.
    ملاحظة: يجب أن يكون محلول الدهون واضحا. إذا لم يكن المحلول واضحا ، فقد يتم زيادة تركيز كولات الصوديوم إلى 150 ملليمتر.
  2. امزج محلول MSP1E3D1 مع محلول الدهون. أضف دوديسيل فوسفوكولين (DPC) بتركيز نهائي قدره 0.1٪ (w/v). يمكن تعديل تفاعلات التجميع إلى أحجام نهائية تبلغ 3 مل (الجدول 2) أو 12 مل المقابلة للأحجام النموذجية لأشرطة غسيل الكلى (10 كيلوداد MWCO). احتضان تفاعلات التجميع لمدة 1 ساعة عند 21 درجة مئوية تحت إثارة لطيفة.
    ملاحظة: لكل دهون، يجب استخدام نسبة محددة من الدهون MSP1E3D1:لضمان تحضير قرص نانوي متجانس (الجدول 2). بالنسبة للدهون الجديدة أو مخاليط الدهون ، يجب تحديد النسبة المثلى من خلال تجربة تجريبية وتحليل كروماتوغرافيا استبعاد الحجم14.
  3. قبل البلل غشاء كاسيت غسيل الكلى مع المخزن المؤقت لتشكيل القرص (DF) (10 mM Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 100 mM NaCl). انقل خليط التجميع إلى كاسيت غسيل الكلى باستخدام حقنة. يمكن إزالة فقاعات الهواء المحتملة عن طريق الشفط باستخدام المحقنة.
  4. الأيام 1-4: انزع القطر مقابل 3 × 5 لتر من المخزن المؤقت لتحديد الاتجاه لمدة 10-20 ساعة في RT تحت التحريك باستخدام قضيب تحريك. ثم انقل خليط التجميع من كاسيت غسيل الكلى إلى وحدات تصفية الطرد المركزي مع 10 kDa MWCO متوازنة مع المخزن المؤقت DF. ركز على 4000 × جم عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن أن يشير مزيج غسيل الكلى العكر إلى وجود نسبة ستويشيومتري خاطئة من MSP:lipid. يجب إزالة الراسب عند 18000 × g لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية قبل تركيز العينة. لتجنب هطول الأمطار أثناء تركيز العينة، استخدم وحدات الترشيح الفائق ذات المحطة الميتة الكبيرة.
  5. ركز الأقراص النانوية المجمعة على تركيز لا يقل عن 300 ميكرومتر. ضع في اعتبارك أن قرصا نانويا واحدا يتكون من جزيئين MSP1E3D1 ، وبالتالي ، يجب تقسيم تركيز MSP على 2 لتحديد الكمية الصحيحة من الأقراص النانوية.
    ملاحظة: سينتج عن الإعداد الموضح (الجدول 2) 0.6-1 مل من محلول قرص نانوي 300 ميكرومتر.
  6. جهاز الطرد المركزي لإعداد القرص النانوي المركز عند 18000 × g لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة الراسب. ثم ، استنشق supernatant وتجميد الصدمات 50 ميكرولتر aliquots في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: من المستحسن تقييم نجاح تكوين القرص النانوي باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. يجب أن تكون العينة أحادية التشتت ويجب أن تحتوي فقط على كمية منخفضة من الركام. تشير المجاميع إلى أن كمية الدهون في الإعداد مرتفعة للغاية. كمرجع ، يمكن استخدام MSP1E3D1 المنقى . إذا أظهر إعداد القرص النانوي ذروة في ذروة المرجع MSP1E3D1 ، فإن نسبة الدهون المختارة إلى MSP1E3D1 كانت منخفضة للغاية.

5. إعداد تفاعل المقياس التحضيري 3 مل CECF

  1. اليوم 1: إعداد جميع حلول المخزون اللازمة كما هو مدرج (الجدول 3). يتم تخزين المخزونات عند -20 درجة مئوية وتذوب في درجة حرارة الغرفة. تأكد من خلط جميع الأسهم جيدا بعد الذوبان وقبل السحب. حساب الأحجام المطلوبة لجميع المخزونات ووضع مخطط السحب (الجدول 4). سيتم إضافة المركبات عالية الوزن الجزيئي فقط إلى RM. بالنسبة للمركبات منخفضة الوزن الجزيئي ، يمكن إعداد مزيج رئيسي 3 × مدمج ل RM و FM.
    ملاحظة: قد تكون الكميات النهائية من المخاليط المركبة أقل من المحسوبة بسبب فقدان الحجم أثناء الخلط. يمكن تجنب ذلك عن طريق إضافة حجم زائد من 2-5٪ للتعويض عن فقدان الحجم.
  2. قم بموازنة غشاء كاسيت غسيل الكلى 3 مل في 100 mM Tris-acetate ، الرقم الهيدروجيني 8.0. تأكد من إزالة المخزن المؤقت الزائد.
  3. استخدام حقنة لنقل RM إلى كاسيت غسيل الكلى. قم بإزالة الهواء الزائد في حجرة RM عن طريق الشفط باستخدام المحقنة. ضع كاسيت غسيل الكلى في غرفة غسيل الكلى.
  4. املأ غرفة غسيل الكلى ب 60 مل من FM. ضع الغطاء على الغرفة وشد البراغي لإصلاحه. احتضان الغرفة لمدة 12-16 ساعة عند 30 درجة مئوية عند 200 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: تأكد من بقاء الغرفة في وضع مستقيم أثناء الإثارة ، وإلا سيتم إعاقة تبادل المركبات الجزيئية المنخفضة.
  5. اليوم 2: باستخدام حقنة ، استنشق RM من غرفة غسيل الكلى. انقل RM إلى أنابيب جديدة وأجهزة طرد مركزي عند 16000 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق لإزالة الراسب. انقل السوبرناتانت إلى أنابيب جديدة. يمكن الآن تحليل البروتين الموجود في supernatant بشكل أكبر.
    ملاحظة: في بعض الحالات، ستكون الكريات موجودة بعد الطرد المركزي. يمكن أن يوفر ذلك معلومات مهمة حول مدى ملاءمة الأقراص النانوية التي تم تحليلها أو مركبات التفاعل للحفاظ على قابلية MP المركبة للذوبان. لذلك ينصح بتحليل كمية الهدف المحتمل وجودها في الراسب باستخدام SDS-PAGE أو Western Blot أو عن طريق التقييم البصري لحجم الكريات.

6. مقياس تحليلي 60 ميكرولتر إعداد تفاعل CECF لفحص أيون Mg2+

  1. اليوم 1: امزج جميع مكونات المزيج الرئيسي 3x المعني ووزع 60 ميكرولتر على RM و825ميكرولتر على FM. املأ FM ب H 2 O وامزج FM عن طريق الدوامة. نقل FM إلى 3 آبار من 24 بئرا (الجدول 5).
    ملاحظة: نظرا لعدم إمكانية الوصول إلى حاوية Mini-CECF المخصصة، يتم حساب الأحجام الواردة في الجدول 5 لتفاعل يتم إجراؤه في خراطيش غسيل الكلى (10-14 kDa MWCO، RM: 100 μL) بحجم FM يبلغ 1.7 مل في 96 لوحة بئر عميقة (2 مل) (الشكل 1).
  2. قطع أنابيب غسيل الكلى السليلوز المجددة مع 10-14 كيلو دالتون MWCO إلى ما يقرب من 25 × 20 مم قطع الحجم وتخزينها في H2O مع 0.05٪ (ث / v) أزيد الصوديوم.
    تحذير: أزيد الصوديوم سام جدا. تجنب أي ملامسة للجلد أو الغشاء المخاطي. لا تستخدم حاويات معدنية لأن أزيد الصوديوم يمكن أن يتفاعل مع المعادن لتشكيل أزيدات معدنية متفجرة.
  3. قبل تجميع حاوية Mini-CECF ، قم بإزالة H2O الزائد من أغشية غسيل الكلى باستخدام أنسجة. ضع قطعة غشاء واحدة على كل حاوية وقم بإصلاح الأغشية بحلقة بولي تترافلور إيثيلين.
  4. انقل حاوية Mini-CECF إلى آبار صفيحة 24 بئرا مع 825 ميكرولتر من FM. تجنب فقاعات الهواء أسفل غشاء غسيل الكلى في حاوية Mini-CECF.
  5. أضف مكونات جزيئية عالية إلى RM كما هو موضح (الجدول 5) واخلطها عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. أضف 60 ميكرولتر إلى حاوية التفاعل. تجنب فقاعات الهواء أثناء نقل المحلول اللزج.
  6. قطع 2 8 × 10 سم من فيلم اللدائن الحرارية الختم ولفها حول لوحة 24 بئر مع حاويات التفاعل في الداخل. هذا سوف يقلل من التبخر من خليط التفاعل. الآن ضع غطاء لوحة زراعة الخلايا على اللوحة وقم بإصلاحها بشريط. احتضن اللوحة عند 30 درجة مئوية وإثارة 200 دورة في الدقيقة لمدة 12-16 ساعة.
  7. اليوم 2: حصاد مزيج التفاعل عن طريق ثقب غشاء غسيل الكلى مع طرف ماصة في حاوية Mini-CECF وشفط RM. نقل RM إلى أنابيب جديدة وأجهزة طرد مركزي عند 16000 × g عند 4 °C لمدة 10 دقائق لإزالة الرواسب. انقل السوبرناتانت إلى أنابيب جديدة. يمكن الآن تحليل البروتين الموجود في supernatant بشكل أكبر.
    ملاحظة: في بعض الحالات ، بعد الطرد المركزي ، ستكون الكريات موجودة. هذا يمكن أن يوفر معلومات مهمة عن مدى ملاءمة الأقراص النانوية التي تم تحليلها أو مركبات التفاعل الأخرى للحفاظ على MP المركب قابلا للذوبان. لذلك ينصح بتحليل مقدار الهدف المحتمل وجوده في الراسب بواسطة SDS-PAGE أو Western Blot أو التقييم البصري لحجم الكريات.

النتائج

ويتجلى تأثير ضبط مركبات التفاعل على العائد النهائي أو جودة النواب المركبين. يتمثل النهج الروتيني المتكرر في ضبط تركيز Mg2+ الأمثل في تفاعلات CF عن طريق التعبير عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) كشاشة مريحة لكفاءة النظام. على سبيل المثال ، تم تصنيع GFP من متجه pET-21a (+) بتركيزات Mg 2+ بين 14 و24

Discussion

يتم وصف الإعداد والاستراتيجيات لتحسين تعبير CF والإدراج الانتقالي المشترك للنواب الوظيفيين في الأقراص النانوية. وتشمل المعدات المطلوبة مفاعلا حيويا، وجهازا فرنسيا للضغط أو ما شابه ذلك، وقارئا للأشعة فوق البنفسجية/VIS ومضنا، وأوعية تفاعل CF مناسبة لإعداد تكوين مقصورتين، وحاضنة يتم التحكم ?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نود أن نشكر منحة دويتشه فورشونغسجيمينشافت (DFG) BE1911/8-1 ، ومشروع LOEWE GLUE ، ومركز الأبحاث التعاوني النقل والاتصالات عبر الأغشية (SFB807) على الدعم المالي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG)Avanti Polar Lipids (USA)840445P
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)Avanti Polar Lipids (USA)850345C
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC)Avanti Polar Lipids (USA)850375C
1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG)Avanti Polar Lipids (USA)840475C
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)Avanti Polar Lipids (USA)850457C
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG)Avanti Polar Lipids (USA)840034C
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris)Carl Roth (Germany)4855
2-MercaptoethanolCarl Roth (Germany)4227
2-PropanolCarl Roth (Germany)9781
[3H]-dihydroalprenolol HydrochlorideAmerican Radiolabeled Chemicals (USA)ART0134
Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP)Merck (Germany)1409
Adenosine 5’-triphosphate (ATP)Sigma Aldrich (Germany)A9251
Alprenolol hydrochlorideMerck (Germany)A0360000
Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose®Sigma-Aldrich (Germany)Q1126
Autoclave Type GE 446EC-1Gettinge (Germany)
Bioreactor Type 884 124/1B.Braun (Germany)
CentrifugeSorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)
Cholic acidCarl Roth (Germany)8137
Coomassie Brilliant Blue R250Carl Roth (Germany)3862
Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasksSchott Duran (Germany)
Cytidine 5'-triphosphate disodium saltSigma-Aldrich (Germany)C1506
D-glucose monohydrateCarl Roth (Germany)6780
Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrateCarl Roth (Germany)6878
Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubingFisher Scientific (Germany)8700152
DithiothreitCarl Roth (Germany)6908
EthanolCarl Roth (Germany)K928
Folinic acid calcium salt hydrateSigma-Aldrich (Germany)47612
French pressure cell disruptorSLM; Amico Instruments (USA)
GlycerolCarl Roth (Germany)3783
Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP)Sigma-Aldrich (Germany)G8877
Hydrochloric AcidCarl Roth (Germany)K025
IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mLGE Life Sciences (Germany)GE17-5248
ImidazoleCarl Roth (Germany)3899
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)Carl Roth (Germany)2316
KanamycinCarl Roth (Germany)T832
L-AlanineCarl Roth (Germany)3076.1
L-ArginineCarl Roth (Germany)6908
L-AsparagineCarl Roth (Germany)HN23
L-Aspartic AcidCarl Roth (Germany)T202
L-CysteineCarl Roth (Germany)T203
L-Glutamic AcidCarl Roth (Germany)3774
L-GlutamineCarl Roth (Germany)3772
L-GlycineCarl Roth (Germany)3187
L-HistidineCarl Roth (Germany)3852
L-IsoleucineCarl Roth (Germany)3922
L-LeucineCarl Roth (Germany)1699
L-LysineCarl Roth (Germany)4207
L-MethionineCarl Roth (Germany)9359
L-ProlineCarl Roth (Germany)1713
L-PhenylalanineCarl Roth (Germany)1709
L-SerineCarl Roth (Germany)4682
L-ThreonineCarl Roth (Germany)1738
L-TryptophaneCarl Roth (Germany)7700
L-TyrosineCarl Roth (Germany)T207
MD100 dialysis unitsScienova (Germany)40077
N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES)Carl Roth (Germany)6763
n-dodecylphosphocholineAntrace (USA)F308S
PAGE chamber: Mini-Protean Tetra CellBiorad (Germany)
PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systemsBiorad (Germany)
PAGE gel power supply: Power Pac 3000Biorad (Germany)
Tryptone/peptone from caseineCarl Roth (Germany)6681
Peristaltic pump: ip-12Ismatec (Germany)
Phosphoenol pyruvate monopotassium saltSigma Aldrich (Germany)860077
Potassium dihydrogen phosphateCarl Roth (Germany)P018
Potassium acetateCarl Roth (Germany)4986
Potassium chlorideCarl Roth (Germany)6781
Pyruvate KinaseRoche (Germany)10109045001
Scintillation counter: Hidex 300 SLHidex (Finland)
SDS pelletsCarl Roth (Germany)8029
Sodium azideSigma-Aldrich (Germany)K305
Sodium chlorideCarl Roth (Germany)P029
Spectrophotometer NanodropPeqlab (Germany)
Spectrophotometer/fluorescence reader Spark®Tecan (Switzerland)
tRNA (E. coli)Roche (Germany)10109550001
Ultra sonificatorLabsonic U, B. Braun (Germany)
Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP)Sigma-Aldrich (Germany)U6625
Y-30 antifoamSigma-Aldrich (Germany)A6457
Yeast extractCarl Roth (Germany)2904

References

  1. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  2. Ritchie, T. K., et al. Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs. Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).
  3. Frauenfeld, J., et al. A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  4. Yang, Z., et al. Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains. Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).
  5. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  6. Junge, F., et al. Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins. New Biotechnology. 28 (3), (2011).
  7. Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).
  8. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  9. Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Membrane protein expression: no cells required. Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).
  10. Roos, C., et al. Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).
  11. Cappuccio, J. A., et al. Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles. Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).
  12. Patriarchi, T., et al. Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  13. Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).
  14. Rues, R. B., Dötsch, V., Bernhard, F. Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).
  15. Henrich, E., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 1-19 (2017).
  16. Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  17. Henrich, E., et al. Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway. Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).
  18. Peetz, O., et al. Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).
  19. Kigawa, T., et al. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).
  20. Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).
  21. Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs. BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).
  22. Rues, R. B., Dong, F., Dötsch, V., Bernhard, F. Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding. Methods. 147 (1), 73-83 (2018).
  23. Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., Dötsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer. Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).
  24. Matthies, D., et al. Cell-free expression and assembly of ATP synthase. Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).
  25. Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., Dötsch, V., Bernhard, F. Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins. Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).
  26. Haberstock, S., et al. A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems. Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).
  27. Falkinham, J. O., Clark, A. J. Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12. Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).
  28. Foshag, D., et al. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).
  29. Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).
  30. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  31. Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation. Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).
  32. Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein. European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).
  33. Henrich, E., et al. From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs. Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).
  34. Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

165 L CF G

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved