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膜蛋白共翻译插入预成型纳米盘
摘要
共翻译插入到预先形成的纳米盘中，使得在定义的脂质环境中研究无细胞合成的膜蛋白成为可能，而无需与去垢剂接触。该协议描述了基本系统组分的制备以及提高表达效率和样品质量的关键参数。
摘要
无细胞表达系统允许对反应环境进行定制设计，以支持即使是复杂蛋白质（如膜蛋白）的功能折叠。演示了将膜蛋白共翻译插入和折叠到作为纳米盘提供的预成型和定义的膜中的实验程序。该方案完全不含洗涤剂，可在一天内产生毫克纯化样品。所得的膜蛋白/纳米盘样品可用于各种功能研究和结构应用，如结晶、核磁共振或电子显微镜。描述了基本关键组分的制备，例如无细胞裂解物、具有设计膜的纳米盘、关键储备溶液以及双室无细胞表达反应的组装。由于膜蛋白的折叠要求可能高度多样化，因此该协议的主要重点是调节对样品质量很重要的参数和反应步骤，例如关键碱性反应化合物，纳米盘的膜组成，氧化还原和伴侣环境或DNA模板设计。整个过程通过蛋白视紫红质和G蛋白偶联受体的合成得到证明。
引言
膜蛋白（MPs）由于其在水环境中的不溶性，是蛋白质生产研究中具有挑战性的靶标。传统的MP生产平台包括基于细胞的系统，如大肠杆菌、酵母或真核细胞。合成的重组MP要么从细胞膜中提取，要么从包涵体1中重新折叠。洗涤剂溶解后，MPs可以通过建立的体外复溶方案转移到合适的膜环境中。除了囊泡和脂质体外，MP以纳米盘2或salipro3颗粒的形式重建为平面膜已成为最近常规技术。然而，所有这些策略都意味着洗涤剂与MP接触可能导致不稳定，低聚物解离，甚至蛋白质结构和活性丧失4。因此，筛选最佳的洗涤剂增溶和复溶条件可能既繁琐又耗时5。
无细胞（CF）系统的开放性允许表达反应直接提供具有确定脂质组成的预制膜。在这种基于脂质的表达模式（L-CF）中，合成的MP有机会共平移插入到提供的双层6，7 中（图1）。由围绕平面脂质双层盘8 的膜支架蛋白（MSP）组成的纳米盘似乎特别适合于此策略9
研究方案
1. S30裂解物的制备
- 第一天： 从LB琼脂平板上的甘油储备液中划出细胞，并在37°C孵育过夜。
- 第二天： 用琼脂平板上的细胞接种200mLLB培养基，并在37°C下孵育12-14小时。
- 第三天：接种10 L无菌YPTG培养基（10 g / L酵母提取物，16 g / L胰蛋白胨，5 g / L NaCl，19.8 g / L葡萄糖，4.4 mM KH 2 PO 4，8 mM K2HPO4）在15 L搅拌釜式反应器中回火至37°C，并加入100 mL预培养物（1：100）。在37°C，500rpm和高曝气（每分钟~3个空气量）下培养。为防止过度起泡，请添加无菌消泡剂。
- 以固定的时间间隔测量 600 nm 处的光密度 （OD）。大约2小时后，培养物将进入对数阶段。
- HS30裂解物的改性： 当细胞处于对数中期（OD 600≈3.6-4.2）时，向培养基中加入300mL乙醇，并在42°C，500rpm和高通气（每分钟约3个空气体积）下再培养45分钟。然后按照步骤1.6中的说明继续冷却和收获细胞培养物。对于标准S30裂解物的生产，请跳过此步骤并继续执行步骤1.6。
- 当细胞处于对数中期（OD 600≈....
结果
举例说明了微调反应化合物对合成MP的最终产率或质量的影响。一种常见的常规方法是通过表达绿色荧光蛋白（GFP）来调整CF反应中的最佳Mg2+浓度，作为系统效率的便捷监测器。例如，GFP是由Mg 2+浓度在14至24mM之间的pET-21a（+）载体合成的（图2）。SDS-PAGE分析确定了20mM处的最佳Mg 2+浓度（图2A），这与CF反应上清液的互补荧光测量（485nm处激发，535nm处发射测量?.......
讨论
描述了优化CF表达和功能性MPs共翻译插入纳米盘的设置和策略。所需设备包括生物反应器、法式压榨装置或类似设备、紫外可见分光光度计和荧光读数器、适用于两室配置设置的 CF 反应容器以及温控培养箱。其他标准设备是用于收获大肠杆菌细胞的离心机以及用于制备S30裂解物的台式离心机，其重量至少为30，000 x g。如果要制备S80-S100裂解物，则需要超速离心机。所列设备定期在生?.......
披露声明
作者没有什么可透露的。
致谢
我们要感谢德国研究协会（DFG）资助BE1911/8-1、LOEWE罗意威项目GLUE和跨膜运输与通信合作研究中心（SFB807）的财政支持。
....材料
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG) | Avanti Polar Lipids (USA) | 840445P | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids (USA) | 850345C | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC) | Avanti Polar Lipids (USA) | 850375C | |
| 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG) | Avanti Polar Lipids (USA) | 840475C | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipids (USA) | 850457C | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG) | Avanti Polar Lipids (USA) | 840034C | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris) | Carl Roth (Germany) | 4855 | |
| 2-Mercaptoethanol | Carl Roth (Germany) | 4227 | |
| 2-Propanol | Carl Roth (Germany) | 9781 | |
| [3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride | American Radiolabeled Chemicals (USA) | ART0134 | |
| Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP) | Merck (Germany) | 1409 | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich (Germany) | A9251 | |
| Alprenolol hydrochloride | Merck (Germany) | A0360000 | |
| Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose® | Sigma-Aldrich (Germany) | Q1126 | |
| Autoclave Type GE 446EC-1 | Gettinge (Germany) | ||
| Bioreactor Type 884 124/1 | B.Braun (Germany) | ||
| Centrifuge | Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany) | ||
| Cholic acid | Carl Roth (Germany) | 8137 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Carl Roth (Germany) | 3862 | |
| Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks | Schott Duran (Germany) | ||
| Cytidine 5'-triphosphate disodium salt | Sigma-Aldrich (Germany) | C1506 | |
| D-glucose monohydrate | Carl Roth (Germany) | 6780 | |
| Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate | Carl Roth (Germany) | 6878 | |
| Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing | Fisher Scientific (Germany) | 8700152 | |
| Dithiothreit | Carl Roth (Germany) | 6908 | |
| Ethanol | Carl Roth (Germany) | K928 | |
| Folinic acid calcium salt hydrate | Sigma-Aldrich (Germany) | 47612 | |
| French pressure cell disruptor | SLM; Amico Instruments (USA) | ||
| Glycerol | Carl Roth (Germany) | 3783 | |
| Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP) | Sigma-Aldrich (Germany) | G8877 | |
| Hydrochloric Acid | Carl Roth (Germany) | K025 | |
| IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL | GE Life Sciences (Germany) | GE17-5248 | |
| Imidazole | Carl Roth (Germany) | 3899 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth (Germany) | 2316 | |
| Kanamycin | Carl Roth (Germany) | T832 | |
| L-Alanine | Carl Roth (Germany) | 3076.1 | |
| L-Arginine | Carl Roth (Germany) | 6908 | |
| L-Asparagine | Carl Roth (Germany) | HN23 | |
| L-Aspartic Acid | Carl Roth (Germany) | T202 | |
| L-Cysteine | Carl Roth (Germany) | T203 | |
| L-Glutamic Acid | Carl Roth (Germany) | 3774 | |
| L-Glutamine | Carl Roth (Germany) | 3772 | |
| L-Glycine | Carl Roth (Germany) | 3187 | |
| L-Histidine | Carl Roth (Germany) | 3852 | |
| L-Isoleucine | Carl Roth (Germany) | 3922 | |
| L-Leucine | Carl Roth (Germany) | 1699 | |
| L-Lysine | Carl Roth (Germany) | 4207 | |
| L-Methionine | Carl Roth (Germany) | 9359 | |
| L-Proline | Carl Roth (Germany) | 1713 | |
| L-Phenylalanine | Carl Roth (Germany) | 1709 | |
| L-Serine | Carl Roth (Germany) | 4682 | |
| L-Threonine | Carl Roth (Germany) | 1738 | |
| L-Tryptophane | Carl Roth (Germany) | 7700 | |
| L-Tyrosine | Carl Roth (Germany) | T207 | |
| MD100 dialysis units | Scienova (Germany) | 40077 | |
| N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES) | Carl Roth (Germany) | 6763 | |
| n-dodecylphosphocholine | Antrace (USA) | F308S | |
| PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell | Biorad (Germany) | ||
| PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems | Biorad (Germany) | ||
| PAGE gel power supply: Power Pac 3000 | Biorad (Germany) | ||
| Tryptone/peptone from caseine | Carl Roth (Germany) | 6681 | |
| Peristaltic pump: ip-12 | Ismatec (Germany) | ||
| Phosphoenol pyruvate monopotassium salt | Sigma Aldrich (Germany) | 860077 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth (Germany) | P018 | |
| Potassium acetate | Carl Roth (Germany) | 4986 | |
| Potassium chloride | Carl Roth (Germany) | 6781 | |
| Pyruvate Kinase | Roche (Germany) | 10109045001 | |
| Scintillation counter: Hidex 300 SL | Hidex (Finland) | ||
| SDS pellets | Carl Roth (Germany) | 8029 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich (Germany) | K305 | |
| Sodium chloride | Carl Roth (Germany) | P029 | |
| Spectrophotometer Nanodrop | Peqlab (Germany) | ||
| Spectrophotometer/fluorescence reader Spark® | Tecan (Switzerland) | ||
| tRNA (E. coli) | Roche (Germany) | 10109550001 | |
| Ultra sonificator | Labsonic U, B. Braun (Germany) | ||
| Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP) | Sigma-Aldrich (Germany) | U6625 | |
| Y-30 antifoam | Sigma-Aldrich (Germany) | A6457 | |
| Yeast extract | Carl Roth (Germany) | 2904 |
参考文献
- Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
- Ritchie, T. K., et al.
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