Inserção Co-Translacional de Proteínas de Membrana em Nanodiscos Pré-Formados

Resumo

A inserção co-translacional em nanodiscos pré-formados torna possível estudar proteínas de membrana sintetizadas livres de células em ambientes lipídicos definidos sem contato com detergentes. Este protocolo descreve a preparação de componentes essenciais do sistema e os parâmetros críticos para melhorar a eficiência da expressão e a qualidade da amostra.

Resumo

Os sistemas de expressão livre de células permitem o design personalizado de ambientes de reação para suportar o dobramento funcional de proteínas complexas até mesmo, como proteínas de membrana. Os procedimentos experimentais para a inserção co-translacional e dobramento de proteínas de membrana em membranas pré-formadas e definidas fornecidas como nanodiscos são demonstrados. O protocolo é completamente livre de detergente e pode gerar miligramas de amostras purificadas dentro de um dia. As amostras de proteína/nanodisco de membrana resultantes podem ser usadas para uma variedade de estudos funcionais e aplicações estruturais, como cristalização, ressonância magnética nuclear ou microscopia eletrônica. A preparação de componentes-chave básicos, como lisatos livres de células, nanodiscos com membranas projetadas, soluções de estoque críticas, bem como a montagem de reações de expressão livre de células de dois compartimentos é descrita. Como os requisitos de dobramento das proteínas de membrana podem ser altamente diversos, um dos principais focos deste protocolo é a modulação de parâmetros e etapas de reação importantes para a qualidade da amostra, como compostos críticos básicos de reação, composição de membrana de nanodiscos, ambiente redox e chaperona ou design de modelo de DNA. Todo o processo é demonstrado com a síntese de proteorhodopsina e um receptor acoplado à proteína G.

Introdução

As proteínas de membrana (MPs) são alvos desafiadores em estudos de produção de proteínas devido à sua insolubilidade em ambientes aquosos. As plataformas convencionais de produção de MP compreendem sistemas baseados em células, como E. coli, levedura ou células eucarióticas. As MPs recombinantes sintetizadas são extraídas das membranas celulares ou redobradas dos corpos de inclusão¹. Após a solubilização do detergente, os MPs podem ser transferidos para ambientes de membrana adequados por protocolos de reconstituição in vitro estabelecidos. Além de vesículas e lipossomas, a reconstituição de MP em membranas planares na forma de nanodiscos² ou partículas de salipro³ tornaram-se técnicas rotineiras nos últimos tempos. No entanto, todas essas estratégias implicam o contato detergente com MPs que pode resultar em desestabilização, dissociação de oligômeros e até mesmo perda de estrutura e atividade proteica⁴. A triagem para condições ideais de solubilização e reconstituição de detergentes pode, portanto, ser tediosa e demorada⁵.

A natureza aberta dos sistemas livres de células (FC) permite que a reação de expressão seja diretamente fornecida com membranas pré-formadas com uma composição lipídica definida. Nesse modo de expressão à base de lipídios (L-CF), os MPs sintetizados têm a oportunidade de inserir co-translacionalmente nas bicamadas fornecidas ^6,7 (Figura 1). Nanodiscos constituídos por uma proteína de andaime de membrana (MSP) em torno de um disco planar de bicamada lipídica⁸ parecem ser particularmente adequados para essa estratégia ^9,10. Os nanodiscos podem ser rotineiramente montados in vitro com uma variedade de lipídios diferentes, são muito estáveis e os estoques podem ser concentrados até 1 mM. No entanto, a expressão de MSP em E. coli e sua purificação são necessárias. Como estratégia alternativa, a MSP pode ser coexpressa em conjunto com a MP alvo em reações de FC fornecidas com lipossomas^11,12,13. Modelos de DNA para MSP e MP são adicionados à reação e MP / nanodiscos podem se formar após a expressão. Embora a produção de MSP seja evitada, a estratégia de co-expressão requer um ajuste fino cuidadoso das concentrações finais do molde de DNA e maiores variações na eficiência da produção de amostras podem ser esperadas.

A inserção co-translacional de MPs em membranas de nanodiscos pré-formados é um mecanismo não fisiológico e ainda amplamente desconhecido, independente de máquinas de translocon e sequências de sinais^13,14,15,16. Os principais determinantes da eficiência de inserção são o tipo de proteína de membrana, bem como a composição lipídica da membrana fornecida, com preferência frequente por lipídios carregados negativamente^15,17. Como as membranas dos nanodiscos são relativamente confinadas em tamanho, uma quantidade substancial de lipídios é liberada após a inserção do MP¹⁸. A variação do tamanho do nanodisco permite a inserção e o ajuste de complexos de MP oligoméricos superiores^15,18. Entre outros, a montagem correta de complexos homooligoméricos foi mostrada para o canal iônico KcsA, para a bomba iônica proteorhodopsina (PR) e para o transportador multifármaco EmrE^15,18. É provável que os MPs entrem na membrana simétrica do nanodisco de ambos os lados em frequência relativamente igual. Por conseguinte, deve considerar-se que diferentes monómeros ou oligômeros inseridos em um nanodisco podem ter orientações opostas. No entanto, um viés na orientação pode ser causado por mecanismos de inserção cooperativa, conforme relatado para a formação de hexâmeros PR e tetrâmeros KcsA¹⁸. Um viés adicional na orientação do MP pode resultar de interruptores de orientação de MPs inseridos provavelmente na borda das membranas de nanodisco.

A produção de lisados de FC a partir de cepas de E. coli é uma técnica de rotina confiável e pode ser realizada em praticamente qualquer laboratório bioquímico^19,20. Deve-se considerar que, além da formação de pontes dissulfeto, a maioria das outras modificações pós-translacionais está ausente se um MP for sintetizado usando lisatos de E. coli. Embora isso possa gerar amostras mais homogêneas para estudos estruturais, pode ser necessário excluir efeitos potenciais sobre a função de alvos individuais de MP. No entanto, a produção eficiente de amostras de alta qualidade de receptores acoplados à proteína G (GPCR)14,21,22^, transportadores eucarióticos 23 ou grandes conjuntos heteroméricos ²⁴ em lisados de E. coli CF indica sua adequação até mesmo para alvos complexos. As quantidades de escala preparativa (≈ 1 mg/mL) de uma amostra podem ser obtidas com a configuração livre de células de troca contínua de dois compartimentos (CECF), composta por uma mistura de reação (RM) e um compartimento de mistura alimentar (FM). O volume de FM excede o volume RM de 15 a 20 vezes e fornece um reservatório de compostos e precursores de energia de baixo peso molecular¹⁹. A reação de expressão é, portanto, estendida por várias horas e o rendimento final do alvo MP é aumentado. Os compartimentos RM e FM são separados por uma membrana de diálise com um ponto de corte de 10-14 kDa. Os dois compartimentos requerem um projeto especial do recipiente de reação do CECF (Figura 1). de diálise comerciais como recipientes RM em combinação com recipientes de plexiglass sob medida que seguram o FM são exemplos adequados. Os rendimentos de MP podem ainda ser manipulados modificando as relações RM:FM ou trocando o FM após um certo período de incubação.

O rendimento e a qualidade de um MP frequentemente exigem intensa otimização dos parâmetros de reação. Uma vantagem importante da expressão da FC é a possibilidade de modificar e ajustar quase qualquer composto de acordo com os requisitos individuais de um MP. Uma estratégia simples é concentrar-se primeiro em melhorar o rendimento de um MP, estabelecendo um protocolo básico de produção e, em seguida, otimizar a qualidade do MP ajustando as condições de reação e dobramento. A ausência de processos fisiológicos nos lisados da FC e sua reduzida complexidade resultam em altas taxas de sucesso para a produção eficiente de MPs²⁵. Considerações de rotina para o desenho do molde de DNA e otimização da concentração de íons Mg 2⁺ são, na maioria dos casos, suficientes para a obtenção de rendimentos satisfatórios²⁶. Dependendo do modo de expressão, a otimização da qualidade do MP pode se tornar demorada, pois uma maior variedade de parâmetros precisa ser rastreada^14,17,22.

Para estabelecer a plataforma de expressão de FC descrita, são necessários protocolos para a produção de lisado de E. coli CF (i), RNA polimerase T7 (ii), nanodiscos (iii) e os compostos básicos de reação do CECF (iv) (Figura 1). Os derivados A19^{27 ou BL21} da cepa de E. coli K12 são frequentemente utilizados para a preparação de lisatos eficientes de S30 (centrifugação a 30.000 x g). Além dos lisatos S30, os lisados correspondentes centrifugados em outras forças-g (por exemplo, S12) podem ser usados. Os lisados diferem na eficiência da expressão e na complexidade do proteoma. O proteoma do lisado S30 preparado pelo protocolo descrito tem sido estudado em detalhes²⁸. O proteoma S30 ainda contém algumas proteínas residuais da membrana externa que podem causar problemas de fundo na expressão e análise dos canais iônicos. Para tais alvos, recomenda-se o uso de lisados S80-S100. Uma modificação valiosa durante a preparação do lisado é a indução da resposta SOS por choque térmico combinado e fornecimento de etanol na fase de crescimento do tronco médio das células. Os lisados HS30 resultantes são enriquecidos em chaperonas e podem ser usados em misturas com lisados S30 para melhorar a dobragem MP²². A expressão de FC em lisados de E. coli é operada como um processo de transcrição/tradução acoplado com moldes de DNA contendo promotores controlados pela RNA polimerase T7 (T7RNAP). A enzima pode ser eficientemente produzida em células estelares BL21(DE3) que transportam o plasmídeo pAR1219²⁹.

Duas cópias do MSP1E3D1 se reúnem em um nanodisco com um diâmetro de 10-12 nm, mas o protocolo descrito abaixo também pode funcionar para outros derivados do MSP. No entanto, nanodiscos maiores do que aqueles formados com MSP1E3D1 tendem a ser menos estáveis, enquanto nanodiscos menores formados com derivados de MSP, como MSP1, podem não acomodar MPs maiores ou complexos de MP. Os nanodiscos MSP1E3D1 podem ser montados in vitro com uma grande variedade de diferentes lipídios ou misturas lipídicas. Os nanodiscos pré-formados são geralmente estáveis por > 1 ano a -80 °C, enquanto a estabilidade pode variar para diferentes componentes lipídicos. Para a triagem dos efeitos lipídicos no dobramento e estabilidade de um MP, é necessário preparar um conjunto abrangente de nanodiscos montados com uma variedade representativa de lipídios/misturas lipídicas. Os seguintes lipídios podem dar uma boa seleção inicial: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG) e 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC).

Um protocolo para a preparação de uma reação de 3 mL de CECF é descrito. É possível aumentar ou diminuir ainda mais a escala em uma proporção de 1:1. Para a configuração do CECF de dois compartimentos, deve ser preparado um RM contendo todos os compostos e um FM contendo apenas os compostos de baixo peso molecular. Dispositivos comerciais de diálise de 3 mL com MWCO de 10-14 kDa podem ser usados como recipientes RM, que são então colocados em recipientes de plexiglass feitos sob medida que seguram o FM (Figura 1D)³⁰. A proporção de RM:FM é de 1:20, de modo que 60 mL de FM devem ser preparados para 3 mL RM. Qualidade, concentração ou tipo de vários componentes podem ser críticos para o rendimento final e/ou qualidade do MP sintetizado (Tabela 1). Os modelos de DNA devem ser preparados de acordo com as diretrizes publicadas e a otimização do códon do quadro de leitura do alvo pode melhorar significativamente o rendimento do produto²⁶. Para a reação do CECF em escala preparativa, descreve-se um protocolo estabelecido para a produção de RP. Para estabelecer protocolos de expressão para novos MPs, geralmente é necessário realizar telas de otimização de determinados compostos (Tabela 1) para melhorar o rendimento e a qualidade. Para íons Mg²⁺ , existe uma concentração ótima bem focada que frequentemente mostra variação significativa para diferentes modelos de DNA. Outros compostos de reação da FC, como novos lotes de lisados T7RNAP ou S30, podem alterar ainda mais a concentração ideal^{de Mg 2} +. Como exemplo, uma tela típica de Mg 2+ dentro da faixa de concentração de^14-24 mM e em etapas de 2 mM é descrita. Cada concentração é rastreada em duplicatas e em reacções do CECF à escala analítica. Como recipiente de reação CECF, os recipientes de plexiglas Mini-CECF³⁰ feitos sob medida que contêm o RM são usados em combinação com microplacas padrão de 24 poços que seguram o FM (Figura 1B). Alternativamente, cartuchos de diálise comerciais em combinação com microplacas de poço de 96 profundidades ou outros dispositivos dialisadores comerciais em configurações apropriadas podem ser usados (Figura 1C).

Protocolo

1. Preparação do lisado S30

1. Dia 1: Retire as células das reservas de glicerol numa placa de ágar LB e incube a 37 °C durante a noite.
2. Dia 2: Inocular 200 mL de meio LB com as células da placa de ágar e incubar a 37 °C por 12-14 h.
3. Dia 3: Inocular 10 L de meio YPTG estéril (extrato de levedura de 10 g/L, 16 g/L de triptona, NaCl de 5 g/L, glicose de 19,8 g/L, 4,4 mM KH 2 PO 4, 8 mM K₂HPO₄) temperado a 37 °C em reator tanque agitado de 15 L com 100 mL de pré-cultura (1:100). Cultivar a 37 °C, 500 rpm e alta aeração (~ 3 volumes de ar por minuto). Para evitar espuma excessiva, adicione antiespumante estéril.
4. Meça a densidade óptica (OD) a 600 nm em intervalos de tempo regulares. Após aproximadamente 2 h a cultura entrará na fase logarítmica.
5. Modificação para lisado HS30: Quando as células estiverem em fase logarítmica média (OD600 ≈ 3,6-4,2), adicione 300 mL de etanol ao meio de cultura e prossiga o cultivo a 42 °C, 500 rpm e alta aeração (aproximadamente 3 volumes de ar por minuto) por mais 45 min. Em seguida, proceder ao arrefecimento e à colheita da cultura celular, tal como descrito no passo 1.6. Para a produção de lisado S30 padrão, pule esta etapa e prossiga com a etapa 1.6.
6. Quando as células estiverem na fase de log intermediário (OD600 ≈ 3,6-4,2), esfrie o fermentador abaixo de 20 °C dentro de < 30 minutos. O OD600 final deve ser em torno de 4,5-5,5. Colher as células a 4.500 x g durante 20 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante. Mantenha as células a 4 °C durante os passos seguintes.
   NOTA: Durante o resfriamento, pode ocorrer formação excessiva de espuma. Neste caso, adicione antiespumante ou reduza a velocidade de agitação e/ou diminua o fluxo de ar no biorreator.
7. Suspender as células completamente em 300 mL de tampão S30-A (Tris-HCl 10 mM, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KCl, 6 mM 2-mercaptoetanol) usando uma espátula seguida de pipetagem da suspensão para cima e para baixo até a homogeneidade. Centrífuga a 8.000 x g durante 10 min a 4 °C. Repita esta etapa duas vezes.
   CUIDADO: O 2-mercaptoetanol é tóxico. Evite o contato com a pele ou o trato respiratório. Se possível, trabalhe sob um capô. Pesar o copo da centrífuga vazio antes da última etapa de lavagem. Após a centrifugação, pesar o pellet de célula húmida e prosseguir com o passo 1.8 ou conservar o pellet até nova utilização.
   NOTA: O peso do pellet de célula úmida é de 5-7 g por cultura de biorreator de 1 L. Neste ponto, o protocolo pode ser pausado e o pellet pode ser congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80 °C por 4-8 semanas.
8. Suspender completamente as células em 1,1 volumes (1 g = 1 mL) de tampão S30-B (Tris-HCl de 10 mM, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)₂, 60 mM KOAc, 1 mM DTT, 1 comprimido de inibidor da protease cOmplete). Encha a suspensão em uma célula de pressão de prensa francesa pré-resfriada e interrompa as células a 1.000 psig. Passe as células pela imprensa francesa uma vez.
9. Centrifugar o lisado a 30.000 x g durante 30 min a 4 °C. Transfira o sobrenadante para um tubo fresco e repita a etapa de centrifugação.
   NOTA: Uma camada solta e viscosa pode estar presente no topo do pellet após a primeira centrifugação, que não deve ser transferida com o sobrenadante.
10. Aplique uma etapa de alto teor de sal e calor para remover componentes instáveis do lisado e liberar mRNA dos ribossomos. Ajustar o lisado a 0,4 M de NaCl e incubar a 42 °C durante 45 minutos em banho-maria.
    NOTA: Esta etapa causará formação significativa de precipitados. Vire ou inverta o tubo durante a incubação de tempos em tempos.
11. Transfira a suspensão turva (geralmente 50-80 mL) para tubos de diálise com um ponto de corte de 10-14 kDa e dialize contra o tampão 5 L S30-C (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)₂, 60 mM KOAc, 0,5 mM TDT). Troque o tampão de diálise S30-C após 2-3 h e dialize por mais 12-14 h.
12. Dia 4: Transferir a suspensão dialisada para os tubos de centrifugação e centrífuga a 30.000 x g durante 30 min a 4 °C. Transfira o sobrenadante (lisado S30) para tubos frescos de 50 mL e misture suavemente. A concentração proteica do lisado deve ser de aproximadamente 30-40 mg/mL. Alíquotas de congelamento de choque (por exemplo, 0,5 mL, 1 mL) em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C. As alíquotas são estáveis por > 1 ano.

2. Expressão e purificação da RNA polimerase T7

1. Dia 1: Inocular 200 mL de meio LB contendo 100 μg/mL de ampicilina com células BL21(DE3) Star x pAR1219 recém-banhadas e incubar a 37 °C e 180 rpm por 12-16 h.
2. Dia 2: Inocular 1 L de caldo fantástico (12 g/L de triptona, 24 g/L de extrato de levedura, 4 mL/L de glicerol) em um frasco desconcertado de 2 L com 10 mL da pré-cultura e incubar a 37 °C e agitação de 180 rpm. O OD600 inicial deve estar em torno de 0,1.
3. Quando o OD600 atingir 0,6-0,9, adicione o IPTG a uma concentração final de 1 mM para induzir a expressão de T7RNAP e continuar o cultivo por mais 5 h.
4. Colheita de células por centrifugação a 4.500 x g durante 20 min a 4 °C. Congelar as células em azoto líquido e conservar a -80 °C.
   Observação : O protocolo pode ser pausado aqui.
5. Dia 3: Adicionar 30 ml de tampão de suspensão gelado (30 mM Tris-HCl, pH 8,0 com um comprimido de inibidor da protease cOmplete) ao pellet de células congeladas e descongelar o pellet em banho-maria à temperatura ambiente. Em seguida, suspenda o pellet pipetando para cima e para baixo até a homogeneidade.
6. Execute a interrupção da célula usando uma prensa francesa, conforme descrito na seção anterior ou use um dispositivo de sonicação de acordo com as recomendações do fabricante. Subsequentemente, centrifugar a 20 000 x g durante 30 minutos a 4 °C e transferir o sobrenadante para um tubo fresco.
7. Para precipitar o DNA genômico, adicione sulfato de estreptomicina lentamente e sob agitação suave ao sobrenadante até que uma concentração final de 3% (p/v) seja atingida. Incubar a 4 °C durante 5-10 min sob agitação suave. Centrífuga a 20.000 x g durante 30 min a 4 °C.
8. Filtrar o sobrenadante com um filtro de 0,45 μm e carregá-lo numa coluna Q-Sepharose com um volume de coluna (CV) de 40 ml equilibrado com tampão de equilíbrio de 2 CV (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5% de glicerol e 10 mM 2-mercaptoetanol) utilizando uma bomba peristáltica a um caudal de 4 ml/min. Em seguida, conecte a coluna a um detector UV e continue a eluição com buffer de equilíbrio até que o sinal UV a 280 nm atinja uma linha de base estável.
9. Elute T7RNAP com um gradiente de 50 mM a 500 mM de NaCl por CV a uma taxa de fluxo de 3 mL/min. Coletar frações de 1 mL e preparar amostras para análise SDS-PAGE misturando 10 μL de cada fração com 2 x buffer de amostra SDS. Execute SDS-PAGE e manche o gel com Coomassie Blue R. T7RNAP deve aparecer como uma banda proeminente em aproximadamente 90 kDa, juntamente com numerosas bandas adicionais de impurezas.
10. Frações de pool contendo T7RNAP e dialyze usando membranas com MWCO de 12-14 kDa por 12-16 h em tampão de diálise (10 mM K 2 HPO 4/KH₂PO₄, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1 mM TDT, 5% (p/v) de glicerol).
11. Dia 4: Coletar a solução de T7RNAP e concentrar usando unidades filtrantes com 12-14 MWCO até uma concentração final de 3-10 mg/mL. T7RNAP pode começar a precipitar-se durante a concentração. Pare a concentração instantaneamente assim que ocorrer turbidez na amostra. Adicionar glicerol a uma concentração final de 50% (p/v) e misturar suavemente. Congelar o choque 0,5-1 ml alíquotas e conservar a -80 °C. As alíquotas T7RNAP de trabalho podem ser armazenadas a -20 °C.
    NOTA: Aproximadamente 20-40 mL de 5 mg/mL de T7RNAP parcialmente purificado com 20.000-40.000 unidades devem ser obtidos a partir de uma fermentação de 1 L. Para testar a quantidade ideal de cada lote de T7RNAP, devem ser realizadas reações de expressão de FC de proteína fluorescente verde (GFP) contendo 0,02 mg/mL-0,1 mg/mL da amostra T7RNAP preparada.

3. Expressão e purificação de MSP1E3D1

1. Dia 1: Transforme as células estelares de E. coli BL21 (DE3) com o vetor³¹ pET28(a)-MSP1E3D1 usando protocolos padrão de transformação de choque térmico ou eletroporação. Estriar ou transformar células em placa em ágar LB contendo 30 μg/mL de canamicina e incubar a 37 °C por 12-16 h.
2. Dia 2: Inocular 200 mL de meio LB suplementado com glicose a 0,5% (p/v) e 30 μg/mL de canamicina com uma única colônia colhida da placa de ágar e incubar a 37 °C a 180 rpm por 12-16 h.
3. Dia 3: Inocular meio 10 L LB suplementado com 0,5% (p/v) de glicose e 30 μg/mL de canamicina com 100 mL de pré-cultura em um biorreator de tanque agitado. Conduzir a fermentação a 37 °C, 500 rpm e aeração de aproximadamente 3 volumes de biorreator por minuto. No caso de formação excessiva de espuma, adicione antiespumante.
   NOTA: Podem ser utilizados frascos de agitação desconcertados em vez de um fermentador.
4. Em OD600 de 6,5-7,5, adicionar IPTG a uma concentração final de 1 mM e continuar a incubação a 37 °C por 1 h. Colheita de células por centrifugação a 4.500 x g durante 20 min a 4 °C. Lavar pellets de células com 200 mL de NaCl a 0,9% (p/v) e centrifugar novamente a 8.000 x g por 10 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e transfira as células para tubos de 50 mL usando uma espátula. O peso esperado do pellet úmido é de 8-12 g por L de cultura de biorreator. Congelar os pellets de células por choque em azoto líquido e conservar a -80 °C até nova utilização.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
5. Dia 4: Para purificação, descongele os pellets de células em banho-maria em RT. Suspenda as células em tampão MSP-A (Tris-HCl de 40 mM, pH 8,0, NaCl de 300 mM, Triton X-100 a 1% (p/v), 1 comprimido de coquetel inibidor de protease de c0mplete por suspensão celular de 50 mL) para produzir uma suspensão celular de 30-40% (p/v).
6. Interromper as células por sonicação ou usando uma prensa francesa e centrífuga a 30.000 x g por 30 min a 4 °C. Transfira o sobrenadante para um tubo fresco e filtre através de um filtro de 0,45 μm. Aplicar o filtrado numa coluna de ácido nitrilotriacético carregada com Ni²⁺ (CV > 15 ml) equilibrada com 5 CV de tampão MSP-B (Tris-HCl de 40 mM, pH 8,0, NaCl de 300 mM, Triton X-100 a 1% (p/v) utilizando uma bomba peristáltica.
   NOTA: Para facilitar a filtração, o sobrenadante pode ser sonicated por mais um minuto para quebrar grandes fragmentos de DNA.
7. Após o carregamento da amostra, lavar a coluna com 5 CV MSP-B, 5 CV MSP-C (40 mM Tris-HCl, pH 8,9, 300 mM NaCl, 50 mM de ácido cólico), 5 CV MSP-D (40 mM Tris-HCl, pH 8,9, 300 mM NaCl), 5 CV MSP-E (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl) e 5 CV MSP-F (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 50 mM imidazol).
   NOTA: O ácido cólico no tampão MSP-C é importante para remover os lipídios ligados ao MSP. O ácido cólico não é completamente solúvel em baixos valores de pH. O valor de pH deve, portanto, ser ajustado para 8,9 em MSP-C e MSP-D. É importante lavar a coluna com tampão MSP-D, pois um pH mais baixo pode fazer com que o ácido cólico residual se precipite e bloqueie ou danifique a coluna.
8. Elute MSP com MSP-G (Tris-HCl de 40 mM, pH 8,0, NaCl de 300 mM, imidazol de 300 mM). Coletar frações de 1 mL e monitorar a absorção de UV a 280 nm. Colete e agrupe as frações do pico de eluição.
9. Transfira frações de MSP agrupadas em tubos de membrana de diálise MWCO de 12-14 kDa e dialize contra 5 L de MSP-H (Tris-HCl de 40 mM, pH 8,0, NaCl de 300 mM, glicerol a 10% (p/v)) por 2-3 h a 4 °C. Mude para um tampão MSP-H fresco de 5 L e dialise por mais 12-16 h a 4 °C.
10. Dia 5: Transferir a solução de MSP para os tubos de centrifugação e centrífuga a 18.000 x g durante 30 min a 4 °C para remover o precipitado. Transfira o sobrenadante para um tubo fresco e concentre-se a 200-800 μM usando dispositivos de ultrafiltração com MWCO de 12-14 kDa a 4 °C. Meça a concentração usando um dispositivo de medição UV/VIS. Utilizar coeficiente de extinção de 27,31 M-1 ^cm-1 e massa molecular de 31,96 kDa para cálculo da concentração.
    NOTA: A expressão em um biorreator geralmente produz 15-30 mg de MSP1E3D1 por L de cultura.
11. Alíquotas de congelamento de choque da solução concentrada de MSP em azoto líquido e conservar a -80 °C.

4. Montagem de nanodiscos MSP1E3D1

1. Dia 1: Prepare 1-2 mL de estoques lipídicos de 50 mM (DMPG, DOPG, POPG DMPC, DOPC ou POPC) em colato de sódio de 100 mM. Conservar a -20 °C se não for utilizado no mesmo dia.
   NOTA: A solução lipídica deve ser límpida. Se a solução não estiver límpida, a concentração de colato de sódio pode ser aumentada para 150 mM.
2. Misture a solução de MSP1E3D1 com a solução lipídica. Adicionar dodecil fosfocolina (DPC) a uma concentração final de 0,1% (p/v). As reações de montagem podem ser ajustadas para volumes finais de 3 mL (Tabela 2) ou 12 mL correspondentes a volumes típicos de de diálise (10 kDa MWCO). Incubar as reações de montagem durante 1 h a 21 °C sob agitação suave.
   NOTA: Para cada lípido, deve ser utilizada uma relação MSP1E3D1:lípido específica para garantir uma preparação homogénea de nanodiscos (Tabela 2). Para novos lipídios ou misturas lipídicas, a razão ótima deve ser determinada com um experimento piloto e análise por cromatografia de exclusão de tamanho¹⁴.
3. Pré-molhada da membrana de um de diálise com tampão de formação de disco (DF) (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl). Transfira a mistura de montagem para o de diálise com uma seringa. As potenciais bolhas de ar podem ser removidas por aspiração utilizando a seringa.
4. Dias 1-4: Dialyze contra 3 x 5 L DF buffer por 10-20 h em RT sob agitação usando uma barra de agitação. Em seguida, transfira a mistura de montagem do de diálise para unidades de filtro centrífugo com MWCO de 10 kDa equilibrado com tampão DF. Concentrado a 4.000 x g a 4 °C.
   NOTA: Uma mistura de diálise turva pode indicar uma relação estequiométrica errada de MSP:lipídio. O precipitado deve ser removido a 18 000 x g durante 20 minutos a 4 °C antes da concentração da amostra. Para evitar a precipitação durante a concentração da amostra, use unidades de ultrafiltração com um grande ponto sem saída.
5. Concentrar os nanodiscos montados numa concentração de, pelo menos, 300 μM. Medir a concentração utilizando um leitor UV/VIS. Considere que um nanodisco é formado por duas moléculas de MSP1E3D1 e, portanto, a concentração de MSP deve ser dividida por 2 para determinar a quantidade correta de nanodiscos.
   NOTA: A configuração descrita (Tabela 2) produzirá 0,6-1 mL de uma solução de nanodisco de 300 μM.
6. Centrifugar a preparação concentrada de nanodiscos a 18.000 x g durante 20 min a 4 °C para remover o precipitado. Em seguida, aspirar o sobrenadante e congelar o choque de alíquotas de 50 μL em azoto líquido e conservar a -80 °C.
   NOTA: É aconselhável avaliar o sucesso da formação de nanodiscos usando cromatografia de exclusão de tamanho. A amostra deve ser monodispersa e conter apenas uma pequena quantidade de agregados. Os agregados indicam que a quantidade de lipídios na configuração é muito alta. Como referência, MSP1E3D1 purificado pode ser usado. Se a preparação do nanodisco mostrar um pico na altura do pico de referência MSP1E3D1, a relação lipídio/MSP1E3D1 escolhida foi muito baixa.

5. Escala preparativa 3 mL CECF configuração de reação

1. Dia 1: Preparar todas as soluções de estoque necessárias, conforme listado (Tabela 3). As existências são armazenadas a -20 °C e descongeladas à temperatura ambiente. Certifique-se de misturar cuidadosamente todos os estoques após o descongelamento e antes da pipetagem. Calcular os volumes necessários para todas as existências e fazer um esquema de pipetagem (Quadro 4). Compostos de alto peso molecular só serão adicionados ao RM. Para os compostos de baixo peso molecular, um mastermix combinado de 3 x para RM e FM pode ser preparado.
   NOTA: Os volumes finais de misturas compostas podem ser inferiores aos calculados devido à perda de volume durante a mistura. Isso pode ser evitado adicionando um excesso de volume de 2-5% para compensar a perda de volume.
2. Equilibre a membrana de um de diálise de 3 mL em acetato de Tris de 100 mM, pH 8,0. Certifique-se de remover o excesso de buffer.
3. Usando uma seringa para transferir o RM para o de diálise. Remova o ar excessivo no compartimento RM por aspiração com a seringa. Coloque o de diálise na câmara de diálise.
4. Encha a câmara de diálise com 60 mL de FM. Coloque a tampa na câmara e aperte os parafusos para fixá-la. Incubar a câmara durante 12-16 h a 30 °C a 200 rpm.
   NOTA: Certifique-se de que a câmara permaneça na posição vertical durante a agitação, caso contrário, a troca de compostos de baixa molécula será dificultada.
5. Dia 2: Usando uma seringa, aspirar o RM da câmara de diálise. Transferir o RM para tubos frescos e centrifugar a 16.000 x g a 4 °C durante 10 minutos para remover o precipitado. Transfira o sobrenadante para tubos frescos. A proteína no sobrenadante pode agora ser analisada mais aprofundadamente.
   NOTA: Em alguns casos, um pellet estará presente após a centrifugação. Isso pode fornecer informações importantes sobre a adequação dos nanodiscos analisados ou os compostos de reação para manter o MP sintetizado solúvel. Portanto, é aconselhável analisar a quantidade de alvo potencialmente presente no precipitado usando SDS-PAGE, Western Blot ou pela avaliação visual do tamanho do pellet.

6. Configuração da reação CECF da escala analítica de 60 μL para triagem de íons Mg²⁺

1. Dia 1: Misture todos os componentes do respectivo master mix de 3x e distribua 60 μL para o RM e 825 μL para o FM. Encha o FM com H₂O e misture FM por vórtice. Transfira a FM para 3 poços da microplaca de 24 poços (Tabela 5).
   NOTA: Como o recipiente Mini-CECF personalizado pode não estar acessível, os volumes da Tabela 5 são calculados para uma reação realizada em cartuchos de diálise (10-14 kDa MWCO, RM: 100 μL) com um volume FM de 1,7 mL em 96 placas de poço profundo (2 mL) (Figura 1).
2. Corte tubos de diálise de celulose regenerada com MWCO de 10-14 kDa em pedaços de aproximadamente 25 x 20 mm e armazene em H₂O com azida de sódio a 0,05% (p/v).
   CUIDADO: A azida de sódio é muito tóxica. Evite qualquer contato com a pele ou mucosa. Não use recipientes de metal, pois a azida de sódio pode reagir com metais para formar azidas metálicas explosivas.
3. Antes da montagem do recipiente Mini-CECF, remova o excesso de H₂O das membranas de diálise com um tecido. Coloque uma peça de membrana em cada recipiente e fixe as membranas com um anel de politetrafluoretileno.
4. Transfira o recipiente Mini-CECF para os poços de uma placa de 24 poços com 825 μL de FM. Evite bolhas de ar abaixo da membrana de diálise do recipiente Mini-CECF.
5. Adicionar componentes moleculares elevados ao RM conforme descrito (Tabela 5) e misturar pipetando para cima e para baixo. Adicionar 60 μL ao recipiente de reacção. Evite bolhas de ar durante a transferência da solução viscosa.
6. Corte 2 folhas de 8 x 10 cm de um filme termoplástico de vedação e envolva-as em torno da placa de 24 poços com os recipientes de reação dentro. Isso reduzirá a evaporação da mistura de reação. Agora coloque a tampa da placa de cultura celular na placa e fixe-a com fita adesiva. Incubar a placa a 30 °C e agitação de 200 rpm durante 12-16 h.
7. Dia 2: Colha a mistura de reação perfurando a membrana de diálise com a ponta do pipeta no recipiente Mini-CECF e aspirar o RM. Transfira o RM para tubos frescos e centrifuga-se a 16.000 x g a 4 °C por 10 minutos para remover os precipitados. Transfira o sobrenadante para tubos frescos. A proteína no sobrenadante pode agora ser analisada mais aprofundadamente.
   NOTA: Em alguns casos, após a centrifugação, um pellet estará presente. Isso pode fornecer informações importantes sobre a adequação dos nanodiscos analisados ou outros compostos de reação para manter o MP sintetizado solúvel. Portanto, é aconselhável analisar a quantidade de alvo potencialmente presente no precipitado por SDS-PAGE, Western Blot ou avaliação visual do tamanho do pellet.

Resultados

O impacto dos compostos de reação de ajuste fino no rendimento final ou na qualidade dos MPs sintetizados é exemplificado. Uma abordagem de rotina frequente é ajustar a concentração ideal de Mg²⁺ em reações de FC pela expressão de proteína fluorescente verde (GFP) como um monitor conveniente da eficiência do sistema. Como exemplo, a GFP foi sintetizada a partir de um vetor pET-21a(+) em concentrações de Mg 2+ entre 14 e²⁴ mM (Figura 2). A análise SDS-PAGE ...

Discussão

A configuração e as estratégias para otimizar a expressão da FC e a inserção co-translacional de MPs funcionais em nanodiscos são descritas. O equipamento necessário compreende um biorreator, um dispositivo de prensa francês ou similar, um leitor UV/VIS e de fluorescência, vasos de reação CF adequados para uma configuração de dois compartimentos e uma incubadora com temperatura controlada. Outros equipamentos padrão são centrífugas para a colheita de células de E. coli, bem como centrífugas de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG)	Avanti Polar Lipids (USA)	840445P
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids (USA)	850345C
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC)	Avanti Polar Lipids (USA)	850375C
1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG)	Avanti Polar Lipids (USA)	840475C
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids (USA)	850457C
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG)	Avanti Polar Lipids (USA)	840034C
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris)	Carl Roth (Germany)	4855
2-Mercaptoethanol	Carl Roth (Germany)	4227
2-Propanol	Carl Roth (Germany)	9781
[3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride	American Radiolabeled Chemicals (USA)	ART0134
Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP)	Merck (Germany)	1409
Adenosine 5’-triphosphate (ATP)	Sigma Aldrich (Germany)	A9251
Alprenolol hydrochloride	Merck (Germany)	A0360000
Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose®	Sigma-Aldrich (Germany)	Q1126
Autoclave Type GE 446EC-1	Gettinge (Germany)
Bioreactor Type 884 124/1	B.Braun (Germany)
Centrifuge	Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)
Cholic acid	Carl Roth (Germany)	8137
Coomassie Brilliant Blue R250	Carl Roth (Germany)	3862
Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks	Schott Duran (Germany)
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt	Sigma-Aldrich (Germany)	C1506
D-glucose monohydrate	Carl Roth (Germany)	6780
Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate	Carl Roth (Germany)	6878
Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing	Fisher Scientific (Germany)	8700152
Dithiothreit	Carl Roth (Germany)	6908
Ethanol	Carl Roth (Germany)	K928
Folinic acid calcium salt hydrate	Sigma-Aldrich (Germany)	47612
French pressure cell disruptor	SLM; Amico Instruments (USA)
Glycerol	Carl Roth (Germany)	3783
Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP)	Sigma-Aldrich (Germany)	G8877
Hydrochloric Acid	Carl Roth (Germany)	K025
IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL	GE Life Sciences (Germany)	GE17-5248
Imidazole	Carl Roth (Germany)	3899
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)	Carl Roth (Germany)	2316
Kanamycin	Carl Roth (Germany)	T832
L-Alanine	Carl Roth (Germany)	3076.1
L-Arginine	Carl Roth (Germany)	6908
L-Asparagine	Carl Roth (Germany)	HN23
L-Aspartic Acid	Carl Roth (Germany)	T202
L-Cysteine	Carl Roth (Germany)	T203
L-Glutamic Acid	Carl Roth (Germany)	3774
L-Glutamine	Carl Roth (Germany)	3772
L-Glycine	Carl Roth (Germany)	3187
L-Histidine	Carl Roth (Germany)	3852
L-Isoleucine	Carl Roth (Germany)	3922
L-Leucine	Carl Roth (Germany)	1699
L-Lysine	Carl Roth (Germany)	4207
L-Methionine	Carl Roth (Germany)	9359
L-Proline	Carl Roth (Germany)	1713
L-Phenylalanine	Carl Roth (Germany)	1709
L-Serine	Carl Roth (Germany)	4682
L-Threonine	Carl Roth (Germany)	1738
L-Tryptophane	Carl Roth (Germany)	7700
L-Tyrosine	Carl Roth (Germany)	T207
MD100 dialysis units	Scienova (Germany)	40077
N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES)	Carl Roth (Germany)	6763
n-dodecylphosphocholine	Antrace (USA)	F308S
PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell	Biorad (Germany)
PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems	Biorad (Germany)
PAGE gel power supply: Power Pac 3000	Biorad (Germany)
Tryptone/peptone from caseine	Carl Roth (Germany)	6681
Peristaltic pump: ip-12	Ismatec (Germany)
Phosphoenol pyruvate monopotassium salt	Sigma Aldrich (Germany)	860077
Potassium dihydrogen phosphate	Carl Roth (Germany)	P018
Potassium acetate	Carl Roth (Germany)	4986
Potassium chloride	Carl Roth (Germany)	6781
Pyruvate Kinase	Roche (Germany)	10109045001
Scintillation counter: Hidex 300 SL	Hidex (Finland)
SDS pellets	Carl Roth (Germany)	8029
Sodium azide	Sigma-Aldrich (Germany)	K305
Sodium chloride	Carl Roth (Germany)	P029
Spectrophotometer Nanodrop	Peqlab (Germany)
Spectrophotometer/fluorescence reader Spark®	Tecan (Switzerland)
tRNA (E. coli)	Roche (Germany)	10109550001
Ultra sonificator	Labsonic U, B. Braun (Germany)
Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP)	Sigma-Aldrich (Germany)	U6625
Y-30 antifoam	Sigma-Aldrich (Germany)	A6457
Yeast extract	Carl Roth (Germany)	2904