JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Котрансляционная вставка в предварительно сформированные нанодиски позволяет изучать бесклеточные синтезированные мембранные белки в определенных липидных средах без контакта с моющими средствами. Этот протокол описывает подготовку основных компонентов системы и критических параметров для повышения эффективности экспрессии и качества выборки.

Аннотация

Бесклеточные экспрессионные системы позволяют адаптировать реакционные среды для поддержки функционального сворачивания даже сложных белков, таких как мембранные белки. Показаны экспериментальные процедуры котрансляционной вставки и сворачивания мембранных белков в преформированные и определенные мембраны, поставляемые в виде нанодисков. Протокол полностью не содержит моющих средств и может генерировать миллиграммы очищенных образцов в течение одного дня. Полученные образцы мембранного белка / нанодисков могут быть использованы для различных функциональных исследований и структурных применений, таких как кристаллизация, ядерный магнитный резонанс или электронная микроскопия. Описано получение основных ключевых компонентов, таких как бесклеточные лизаты, нанодиски с конструированными мембранами, критические стоковые растворы, а также сборка двухкамерных бесклеточных реакций экспрессии. Поскольку требования к сворачиванию мембранных белков могут быть весьма разнообразными, основным направлением этого протокола является модуляция параметров и стадий реакции, важных для качества образца, таких как критические основные реакционные соединения, мембранный состав нанодисков, окислительно-восстановительная и шаперонная среда или дизайн шаблона ДНК. Весь процесс демонстрируется синтезом протеорходопсина и рецептора, связанного с G-белком.

Введение

Мембранные белки (МП) являются сложными мишенями в исследованиях производства белка из-за их нерастворимости в водных средах. Традиционные платформы производства МП включают клеточные системы, такие как E. coli, дрожжи или эукариотические клетки. Синтезированные рекомбинантные МП либо извлекаются из клеточных мембран, либо переворачиваются из тел включения1. После солюбилизации моющих средств МП могут быть переведены в подходящие мембранные среды с помощью установленных протоколов восстановления in vitro. Помимо везикул и липосом, восстановление MP в плоские мембраны в виде частиц нанодисков2 или salipro3 стало обычным методом в последнее время. Однако все эти стратегии подразумевают контакт детергентов с депутатами, что может привести к дестабилизации, диссоциации олигомеров и даже потере структуры и активности белка4. Поэтому скрининг на оптимальные условия солюбилизации и восстановления моющих средств может быть утомительным и трудоемким5.

Открытая природа бесклеточных (CF) систем позволяет напрямую снабжать реакцию экспрессии предварительно сформированными мембранами с определенным липидным составом. В этом липидном режиме экспрессии (L-CF) синтезированные МП имеют возможность совместного трансляционного введения в предоставленные бислои 6,7 (рисунок 1). Нанодиски, состоящие из мембранного каркасного белка (MSP), окружающего плоский липидный двухслойный диск8, по-видимому, особенно подходят для этой стратегии 9,10. Нанодиски могут быть обычно собраны in vitro с различными липидами, они очень стабильны, а запасы могут быть сконцентрированы до 1 мМ. Однако экспрессия МПП в кишечной палочке и ее очистка необходимы. В качестве альтернативной стратегии MSP может быть совместно экспрессирован вместе с целевым MP в реакциях CF, поставляемых липосомами 11,12,13. Шаблоны ДНК как для MSP, так и для MP добавляются в реакцию, и MP / нанодиски могут формироваться при экспрессии. В то время как производство МПП избегается, стратегия совместной экспрессии требует тщательной тонкой настройки конечных концентраций шаблона ДНК, и можно ожидать более высоких вариаций эффективности производства образцов.

Котрансляционная вставка МП в мембраны преформированных нанодисков является нефизиологическим и до сих пор в значительной степени неизвестным механизмом, независимым от транслоконных механизмов и сигнальных последовательностей 13,14,15,16. Основными детерминантами эффективности введения являются тип мембранного белка, а также липидный состав предоставленной мембраны, с частым предпочтением отрицательно заряженных липидов15,17. Поскольку мембраны нанодисков относительно ограничены по размеру, значительное количество липидов высвобождается при вставкеMP 18. Изменение размера нанодисков позволяет вставлять и настраивать более высокие олигомерные МП комплексы 15,18. Среди прочего показана правильная сборка гомолигомерных комплексов для ионного канала KcsA, для ионного насоса протеорходопсина (PR) и для мультилекарственного транспортера EmrE15,18. Депутаты, скорее всего, войдут в симметричную нанодисковую мембрану с обеих сторон на относительно равной частоте. Поэтому следует учитывать, что различные мономеры или олигомеры, вставленные в один нанодиск, могут иметь противоположные ориентации. Однако смещение в ориентации может быть вызвано механизмами совместной вставки, о которых сообщалось для образования гексамеров PR и тетрамеров KcsA18. Дальнейшее смещение в ориентации MP может быть результатом переключения ориентации вставленных депутатов, вероятно, на краю мембран нанодисков.

Производство лизатов CF из штаммов E. coli является надежным рутинным методом и может быть выполнено практически в любой биохимической лаборатории 19,20. Следует учитывать, что помимо образования дисульфидных мостов, большинство других посттрансляционных модификаций отсутствуют, если МП синтезируется с использованием лизатов E. coli. Хотя это может привести к образованию более однородных образцов для структурных исследований, может потребоваться исключить потенциальное воздействие на функцию отдельных мишеней МП. Однако эффективное производство высококачественных образцов рецепторов, связанных с G-белком (GPCR)14,21,22, эукариотических транспортеров 23 или крупных гетеромерных сборок24 в лизатах E. coli CF, указывает на их пригодность даже для сложных мишеней. Объемы в подготовительной шкале (≈ 1 мг/мл) образца могут быть получены с двухкамерной конфигурацией без ячеек непрерывного обмена (CECF), состоящей из реакционной смеси (RM) и отсека питательной смеси (FM). Объем FM превышает объем RM в 15-20 раз и обеспечивает резервуар низкомолекулярных энергетических соединений и прекурсоров19. Таким образом, реакция экспрессии растягивается на несколько часов, а конечный выход мишени MP увеличивается. Отсеки RM и FM разделены диализной мембраной с отсечкой 10-14 кДа. Эти два отсека требуют специальной конструкции реакционного контейнера CECF (рисунок 1). Коммерческие диализные кассеты в качестве контейнеров RM в сочетании с индивидуальными контейнерами из плексигласа, содержащими FM, являются подходящими примерами. Доходностью MP можно дополнительно манипулировать, изменяя соотношение RM:FM или обменивая FM после определенного периода инкубации.

Выход и качество МП часто требуют интенсивной оптимизации параметров реакции. Важным преимуществом выражения CF является возможность модификации и тонкой настройки практически любого соединения в соответствии с индивидуальными требованиями MP. Простая стратегия заключается в том, чтобы сначала сосредоточиться на повышении производительности MP путем создания базового производственного протокола, а затем оптимизировать качество MP путем тонкой настройки реакции и условий складывания. Отсутствие физиологических процессов в лизатах муковисцидоза и снижение их сложности приводят к высоким показателям успешности эффективного производства MPs25. Рутинные соображения по проектированию шаблона ДНК и оптимизации концентрации ионов Mg2+ в большинстве случаев достаточны для получения удовлетворительных выходов26. В зависимости от режима экспрессии, оптимизация качества MP может занять много времени, так как большее разнообразие параметров необходимо экранировать 14,17,22.

Для создания описанной платформы экспрессии CF необходимы протоколы для производства лизата CF (i), РНК-полимеразы T7 (ii), нанодисков (iii) и основных реакционных соединений CECF (iv) (рисунок 1). Производные штамма E. coli K12 A1927 или BL21 часто используются для получения эффективных лизатов S30 (центрифугирование при 30 000 х г). Помимо лизатов S30, могут использоваться соответствующие лизаты, центрифугированные при других g-силах (например, S12). Лизаты различаются по эффективности экспрессии и сложности протеома. Протеом лизата S30, полученный по описанному протоколу, был детально изучен28. Протеом S30 по-прежнему содержит некоторые остаточные белки наружной мембраны, которые могут создать фоновые проблемы при экспрессии и анализе ионных каналов. Для таких целей рекомендуется использование лизатов S80-S100. Ценной модификацией во время приготовления лизата является индукция реакции SOS комбинированным тепловым шоком и подачей этанола в средней фазе роста клеток. Полученные лизаты HS30 обогащены шаперонами и могут быть использованы в смесях с лизатами S30 для улучшения складывания MP22. Экспрессия CF в лизатах E. coli управляется как связанный процесс транскрипции/трансляции с шаблонами ДНК, содержащими промоторы, контролируемые РНК-полимеразой T7 (T7RNAP). Фермент может быть эффективно продуцирован в звездных клетках BL21(DE3), несущих плазмиду pAR121929.

Две копии MSP1E3D1 собираются в один нанодиск диаметром 10-12 нм, но протокол, описанный ниже, может работать и для других производных MSP. Тем не менее, нанодиски, большие, чем те, которые сформированы с помощью MSP1E3D1, как правило, менее стабильны, в то время как меньшие нанодиски, сформированные с производными MSP, такими как MSP1, могут не вмещать более крупные MPS или MP-комплексы. Нанодиски MSP1E3D1 могут быть собраны in vitro с большим разнообразием различных липидов или липидных смесей. Предварительно сформированные нанодиски обычно стабильны в течение > 1 года при -80 °C, в то время как стабильность может варьироваться для различных липидных компонентов. Для скрининга липидного воздействия на складчатость и стабильность МП необходимо подготовить комплексный набор нанодисков, собранных с репрезентативным разнообразием липидно-липидных смесей. Следующие липиды могут дать хороший стартовый выбор: 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфо-(1'-рак-глицерин) (DMPG), 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DMPC), 1,2 диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо-рак-(1-глицерин) (DOPG), 1,2-диолеоил-sn-глицерон-3-фосфохолин (DOPC), 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфо-(1'-рак-глицерол) (POPG) и 1-пальмитоил-2-олеоил-глицеро-3-фосфохолин (POPC).

Описан протокол приготовления реакции 3 мл CECF. Возможно дальнейшее масштабирование вверх или вниз в соотношении 1:1. Для конфигурации CECF с двумя отсеками необходимо подготовить RM, содержащий все соединения, и FM, содержащий только низкомолекулярные соединения. Коммерческие диализные устройства 3 мл с MWCO 10-14 кДа могут использоваться в качестве контейнеров RM, которые затем помещаются в изготовленные на заказ контейнеры из плексигласа, содержащие FM (рисунок 1D)30. Соотношение RM:FM составляет 1:20, поэтому 60 мл FM должны быть подготовлены для 3 мл RM. Качество, концентрация или тип нескольких компонентов могут иметь решающее значение для конечного выхода и/или качества синтезированного MP (таблица 1). Шаблоны ДНК должны быть подготовлены в соответствии с опубликованными руководящими принципами, и кодонная оптимизация рамки считывания мишени может дополнительно значительно улучшить выход продукта26. Для реакции препаративного масштаба CECF описан установленный протокол получения PR. Для создания протоколов экспрессии для новых депутатов обычно необходимо выполнить оптимизационные экраны определенных соединений (табл. 1) для повышения урожайности и качества. Для ионов Mg2+ существует хорошо сфокусированный оптимум концентрации, который часто показывает значительные различия для различных шаблонов ДНК. Другие реакционные соединения CF, такие как новые партии лизатов T7RNAP или S30, могут дополнительно сместить оптимальную концентрацию Mg2+ . В качестве примера описан типичный экран Mg2+ в диапазоне концентраций 14-24 мМ и с шагом 2 мМ. Каждая концентрация просеивается в дубликатах и в аналитической шкале реакций CECF. В качестве реакционного контейнера CECF используются изготовленные на заказ контейнеры Mini-CECF из оргстекла30 , содержащие RM, в сочетании со стандартными 24-луночными микропластинками, содержащими FM (рисунок 1B). Альтернативно, могут использоваться коммерческие диализные картриджи в сочетании с 96-глубинными микропластинами скважин или другими коммерческими диализаторными устройствами в соответствующих установках (фиг.1С).

протокол

1. Приготовление лизата S30

  1. День 1: Удалите клетки из запасов глицерина на агаровой пластине LB и инкубируйте при 37 °C в течение ночи.
  2. День 2: Инокулируют 200 мл LB-среды клетками из агаровой пластины и инкубируют при 37 °C в течение 12-14 ч.
  3. День 3: Инокулируют 10 л стерильной среды YPTG (10 г/л дрожжевого экстракта, 16 г/л триптона, 5 г/л NaCl, 19,8 г/л глюкозы, 4,4 мМ KH2PO4, 8 мМ K2HPO4), закаленной до 37 °C в реакторе с перемешиванием 15 л с 100 мл прекультуры (1:100). Культивируйте при 37 °C, 500 об/мин и высокой аэрации (~ 3 объема воздуха в минуту). Чтобы предотвратить чрезмерное вспенивание, добавьте стерильный пенопласт.
  4. Измеряйте оптическую плотность (OD) при 600 нм через равные промежутки времени. Примерно через 2 ч культура перейдет в логарифмическую фазу.
  5. Модификация для лизата HS30: Когда клетки находятся в средней фазе (OD600 ≈ 3,6-4,2), добавляют 300 мл этанола в культуральную среду и продолжают культивирование при 42 °C, 500 об/мин и высокой аэрации (приблизительно 3 объема воздуха в минуту) в течение еще 45 мин. Затем приступают к охлаждению и сбору клеточной культуры, как описано на этапе 1.6. Для производства стандартного лизата S30 пропустите этот шаг и перейдите к шагу 1.6.
  6. Когда клетки находятся в средней фазе (OD600 ≈ 3,6-4,2), охладите ферментер ниже 20 °C в течение < 30 мин. Итоговый OD600 должен быть около 4,5-5,5. Соберите ячейки при 4 500 х г в течение 20 мин при 4 °C и выбросьте супернатант. Держите ячейки при температуре 4 °C на протяжении следующих шагов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время охлаждения может произойти чрезмерное вспенивание. В этом случае либо добавляют антипену, либо уменьшают скорость перемешивания и/или уменьшают воздушный поток в биореакторе.
  7. Суспендировать ячейки полностью в 300 мл буфера S30-A (10 мМ Tris-HCl, рН 8,2, 14 мМ Mg(OAc)2, 60 мМ KCl, 6 мМ 2-меркаптоэтанола) с использованием шпателя с последующим пипеткой суспензии вверх и вниз до однородности. Центрифуга при 8 000 х г в течение 10 мин при 4 °C. Повторите этот шаг дважды.
    ВНИМАНИЕ: 2-меркаптоэтанол токсичен. Избегайте контакта с кожей или дыхательными путями. По возможности работайте под капотом. Взвесьте пустой стакан центрифуги перед последним этапом стирки. После центрифугирования взвесьте влажную ячейку гранулы и либо перейдите к этапу 1,8, либо сохраните гранулу до дальнейшего использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Масса влажной клеточной гранулы составляет 5-7 г на 1 л культуры биореактора. На этом этапе протокол может быть приостановлен, и гранулы могут быть заморожены в жидком азоте и храниться при -80 °C в течение 4-8 недель.
  8. Тщательно суспендировать клетки в 1,1 объеме (1 г = 1 мл) буфера S30-B (10 мМ Tris-HCl, рН 8,2, 14 мМ Mg(OAc)2, 60 мМ KOAc, 1 мМ DTT, 1 таблетка ингибитора протеазы cOmplete). Заполните суспензию в предварительно охлажденную ячейку давления френч-пресса и разрушайте ячейки при 1000 фунтов на квадратный дюйм. Пропустите ячейки через французский пресс один раз.
  9. Центрифугировать лизат при 30 000 х г в течение 30 мин при 4 °C. Перенесите супернатант в свежую трубку и повторите этап центрифугирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поверх гранулы после первой центрифугирования может присутствовать рыхлый и слизистый слой, который не следует переносить с супернатантом.
  10. Применяют высокий уровень соли и тепла для удаления нестабильных компонентов лизата и высвобождения мРНК из рибосом. Отрегулируйте лизат до 0,4 М NaCl и инкубируйте при 42 °C в течение 45 минут на водяной бане.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап вызовет значительное образование осадков. Время от времени переворачивайте или переворачивайте трубку во время инкубации.
  11. Переложить мутную суспензию (обычно 50-80 мл) в диализные трубки с отсечкой 10-14 кДа и диализом против буфера S30-C 5 л (10 мМ Tris-HCl, рН 8,2, 14 мМ Mg(OAc)2, 60 мМ KOAc, 0,5 мМ DTT). Замените буфер диализа S30-C через 2-3 ч и диализуйте еще 12-14 ч.
  12. День 4: Переложите диализированную суспензию в центрифужные трубки и центрифугу при 30 000 х г в течение 30 мин при 4 °C. Переложите супернатант (лизат S30) в свежие пробирки по 50 мл и аккуратно перемешайте. Белковая концентрация лизата должна составлять примерно 30-40 мг/мл. Аликвоты при шоке замораживают (например, 0,5 мл, 1 мл) в жидком азоте и хранят при -80 °C. Аликвоты стабильны в течение > 1 года.

2. Экспрессия и очистка Т7 РНК-полимеразы

  1. День 1: Инокулируют 200 мл LB-среды, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, свежепокрытыми клетками BL21(DE3) Star x pAR1219 и инкубируют при 37 °C и 180 об/мин в течение 12-16 ч.
  2. День 2: Привить 1 л потрясающего бульона (12 г/л триптона, 24 г/л дрожжевого экстракта, 4 мл/л глицерина) в 2 л перегородчатой колбы с 10 мл предварительной культуры и инкубировать при 37 °C и перемешивании 180 об/мин. Начальный OD600 должен быть около 0,1.
  3. Когда OD600 достигнет 0,6-0,9, добавьте IPTG к конечной концентрации 1 мМ, чтобы индуцировать экспрессию T7RNAP и продолжайте культивирование еще в течение 5 ч.
  4. Заготавливайте ячейки центрифугированием при 4 500 х г в течение 20 мин при 4 °C. Заморозить клетки в жидком азоте и хранить при -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол может быть приостановлен.
  5. День 3: Добавьте 30 мл буфера ледяной суспензии (30 мМ Tris-HCl, рН 8,0 с одной таблеткой ингибитора протеазы cOmplete) к замороженной клеточной грануле и разморозьте гранулу на водяной бане при комнатной температуре. Затем приостановите гранулу путем пипетки вверх и вниз до однородности.
  6. Выполняйте разрушение клеток с помощью френч-пресса, как описано в предыдущем разделе, или используйте устройство обработки ультразвуком в соответствии с рекомендациями производителя. Впоследствии центрифугируют при 20 000 х г в течение 30 мин при 4 °С и переносят супернатант в свежую пробирку.
  7. Чтобы вывести в осадок геномную ДНК, добавляйте сульфат стрептомицина медленно и при мягком перемешивании к надосадочному веществу до достижения конечной концентрации 3% (мас./об.). Инкубировать при 4 °С в течение 5-10 мин при тщательном перемешивании. Центрифуга при 20 000 х г в течение 30 мин при 4 °C.
  8. Отфильтруйте супернатант фильтром 0,45 мкм и загрузите его на колонну Q-Sepharose с объемом колонки (CV) 40 мл, уравновешенную 2 буфером равновесия CV (30 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl, 5% глицерина и 10 мМ 2-меркаптоэтанола) с помощью перистальтического насоса со скоростью потока 4 мл / мин. Затем подключите колонну к УФ-детектору и продолжайте элюирование с буфером равновесия до тех пор, пока УФ-сигнал при 280 нм не достигнет стабильного базового уровня.
  9. Elute T7RNAP с градиентом от 50 мМ до 500 мМ NaCl на CV при скорости потока 3 мл/мин. Соберите фракции 1 мл и подготовьте образцы для анализа SDS-PAGE, смешивая 10 мкл каждой фракции с буфером образцов 2 x SDS. Запустите SDS-PAGE и окрасьте гель Coomassie Blue R. T7RNAP должен выглядеть как заметная полоса примерно на 90 кДа вместе с многочисленными дополнительными полосами примесей.
  10. Пул фракций, содержащих T7RNAP и диализ с использованием мембран с 12-14 кДа MWCO в течение 12-16 ч в диализном буфере (10 мМ K2HPO4/KH2PO4, рН 8,0, 10 мМ NaCl, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT, 5% (мас./об.) глицерин).
  11. День 4: Собирают раствор T7RNAP и концентрируют с помощью фильтровальных установок с 12-14 MWCO до конечной концентрации 3-10 мг/мл. T7RNAP может начать выпадать в осадок во время концентрации. Немедленно прекращайте концентрацию, как только возникает помутнение в образце. Добавьте глицерин до конечной концентрации 50% (мас./об.) и осторожно перемешайте. Шок-заморозка 0,5-1 мл аликвот и хранение при -80 °C. Рабочие аликвоты T7RNAP могут храниться при -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно 20-40 мл 5 мг/мл частично очищенного T7RNAP с 20 000-40 000 единиц должны быть получены из ферментации 1 л. Для проверки оптимального количества каждой партии T7RNAP следует проводить реакции экспрессии CF зеленого флуоресцентного белка (GFP), содержащего 0,02 мг/мл-0,1 мг/мл подготовленного образца T7RNAP.

3. Экспрессия и очистка MSP1E3D1

  1. День 1: Преобразование звездных ячеек E. coli BL21 (DE3) с вектором pET28(a)-MSP1E3D131 с использованием стандартных протоколов преобразования теплового шока или электропорации. Выводит наружу или пластинчато трансформированные клетки на Агаре LB, содержащие 30 мкг/мл канамицина, и инкубируют при 37 °C в течение 12-16 ч.
  2. День 2: Инокулируют 200 мл среды LB, дополненной 0,5% (мас./об.) глюкозы и 30 мкг/мл канамицина одной колонией, собранной из агаровой пластины, и инкубируют при 37°C при 180 об/мин в течение 12-16 ч.
  3. День 3: Инокулируют 10 л LB-среды, дополненной 0,5% (мас./об.) глюкозы и 30 мкг/мл канамицина 100 мл прекультуры в биореакторе с перемешиваемым резервуаром. Проводят ферментацию при 37 °C, 500 об/мин и аэрацию приблизительно 3 объема биореактора в минуту. В случае чрезмерного вспенивания добавьте пену.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо ферментера можно использовать сбитые с толку колбы.
  4. При OD600, составляющем 6,5-7,5, добавляют IPTG к конечной концентрации 1 мМ и продолжают инкубацию при 37°C в течение 1 ч. Заготавливайте ячейки центрифугированием при 4 500 х г в течение 20 мин при 4 °C. Вымойте гранулы с 200 мл 0,9% (мас./об.) NaCl и центрифугу снова при 8 000 х г в течение 10 мин при 4 °C. Выбрасывайте супернатант и переносите ячейки в пробирки объемом 50 мл с помощью шпателя. Ожидаемая масса влажных гранул составляет 8-12 г на л культуры биореактора. Гранулы с ударно-замороженными ячейками в жидком азоте и хранят при -80 °C до дальнейшего использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить.
  5. День 4: Для очистки оттаивайте клеточные гранулы на водяной бане в RT. Суспендируйте клетки в буфере MSP-A (40 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 300 мМ NaCl, 1% (мас./об.) Triton X-100, 1 таблетка коктейля ингибитора протеазы c0mplete на 50 мл клеточной суспензии), чтобы получить 30-40% (мас./об.) клеточную суспензию.
  6. Разрушают клетки ультразвуком или с помощью френч-пресса и центрифуги при 30 000 х г в течение 30 мин при 4 °C. Переложите супернатант в свежую трубку и процедите через фильтр 0,45 мкм. Нанесите фильтрат на колонку нитрилотриаценовой кислоты, нагруженную Ni2+ (CV > 15 мл), уравновешенную 5 CV буфера MSP-B (40 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 300 мМ NaCl, 1% (мас./об.) Triton X-100) с помощью перистальтического насоса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы облегчить фильтрацию, супернатант может быть обработан ультразвуком в течение еще одной минуты, чтобы разрушить большие фрагменты ДНК.
  7. После загрузки образца промыть колонну 5 CV MSP-B, 5 CV MSP-C (40 мМ Tris-HCl, pH 8,9, 300 мМ NaCl, 50 мМ холевой кислоты), 5 CV MSP-D (40 мМ Tris-HCl, pH 8,9, 300 мМ NaCl), 5 CV MSP-E (40 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 300 мМ NaCl) и 5 CV MSP-F (40 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 300 мМ NaCl, 50 мМ имидазола).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Холевая кислота в буфере MSP-C важна для удаления липидов, прикрепленных к MSP. Холевая кислота не полностью растворима при низких значениях рН. Поэтому значение pH должно быть скорректировано до 8,9 в MSP-C и MSP-D. Важно промыть колонну буфером MSP-D, так как более низкий рН может привести к осаждению остаточной холевой кислоты и блокированию или повреждению колонны.
  8. Elute MSP с MSP-G (40 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 300 мМ NaCl, 300 мМ имидазола). Собирайте фракции по 1 мл и контролируйте поглощение УФ-излучения при 280 нм. Соберите и объедините фракции пика элюирования.
  9. Переведите объединенные фракции MSP в мембранные трубки диализа MWCO 12-14 кДа и диализуйте против 5 л MSP-H (40 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 300 мМ NaCl, 10% (мас./об.) глицерина) в течение 2-3 ч при 4 °C. Переводят на свежий буфер 5 л MSP-H и диализ еще 12-16 ч при 4 °C.
  10. День 5: Переложите раствор МСП в центрифужные трубки и центрифугу при 18 000 х г в течение 30 мин при 4 °C для удаления осадка. Переложите супернатант в свежую трубку и концентрат до 200-800 мкМ с помощью ультрафильтрационных устройств с 12-14 кДа MWCO при 4 °C. Измерьте концентрацию с помощью измерительного прибора UV/VIS. Для расчета концентрации используют коэффициент вымирания 27,31 М-1 см-1 и молекулярную массу 31,96 кДа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экспрессия в биореакторе обычно дает 15-30 мг MSP1E3D1 на культуру L.
  11. Шок-замораживание аликвот концентрированного раствора МСП в жидком азоте и хранение при -80 °С.

4. Сборка нанодисков MSP1E3D1

  1. День1: Приготовьте 1-2 мл 50 мМ липидных запасов (DMPG, DOPG, POPG DMPC, DOPC или POPC) в 100 мМ холата натрия. Хранить при температуре -20 °C, если не используется в тот же день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор липидов должен быть прозрачным. Если раствор не прозрачный, концентрация холата натрия может быть увеличена до 150 мМ.
  2. Смешайте раствор MSP1E3D1 с раствором липидов. Добавляют додецилфосфохолин (DPC) в конечной концентрации 0,1% (мас./об.). Реакции сборки могут быть скорректированы до конечных объемов 3 мл (таблица 2) или 12 мл, соответствующих типичным объемам диализных кассет (10 кДа MWCO). Инкубировать реакции сборки в течение 1 ч при 21 °C при мягком перемешивании.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого липида необходимо использовать конкретное соотношение MSP1E3D1:липидов для обеспечения однородной нанодисковой подготовки (таблица 2). Для новых липидов или липидных смесей оптимальное соотношение следует определить с помощью экспериментального эксперимента и анализа14 эксклюзионной хроматографии.
  3. Предварительно смочите мембрану диализной кассеты с буфером дискообразования (DF) (10 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 100 мМ NaCl). Переложите сборочную смесь в диализную кассету со шприцем. Потенциальные пузырьки воздуха могут быть удалены путем аспирации с помощью шприца.
  4. Дни 1-4: Диализ против буфера 3 х 5 л DF в течение 10-20 ч при РТ при перемешивании с использованием перемешивающего стержня. Затем перенесите сборочную смесь из диализной кассеты в центробежные фильтрующие блоки с 10 кДа MWCO, уравновешенными буфером DF. Концентрат при 4 000 х г при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мутная диализная смесь может указывать на неправильное стехиометрическое соотношение MSP:липид. Осадок должен быть удален при 18 000 х г в течение 20 мин при 4 °C до концентрации образца. Чтобы избежать выпадения осадков во время концентрации пробы, используйте ультрафильтрационные блоки с большим мертвым упором.
  5. Сконцентрируйте собранные нанодиски до концентрации не менее 300 мкМ. Измерьте концентрацию с помощью УФ/ВИС-считывателя. Учтите, что один нанодиск образован двумя молекулами MSP1E3D1 и, таким образом, концентрация MSP должна быть разделена на 2, чтобы определить правильное количество нанодисков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная установка (таблица 2) даст 0,6-1 мл раствора нанодисков 300 мкМ.
  6. Центрифугируют концентрированный препарат нанодисков при 18 000 х г в течение 20 мин при 4 °C для удаления осадка. Затем аспирируют супернатант и шок-замораживают 50 мкл аликвот в жидком азоте и хранят при -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целесообразно оценить успешность формирования нанодисков с помощью размерно-эксклюзионной хроматографии. Образец должен быть монодисперсным и содержать только небольшое количество агрегатов. Агрегаты указывают на то, что количество липидов в установке слишком велико. В качестве ориентира можно использовать очищенный MSP1E3D1. Если подготовка нанодиска показывает пик на высоте эталонного пика MSP1E3D1, выбранное отношение липидов к MSP1E3D1 было слишком низким.

5. Подготовительная шкала 3 мл CECF реакционная установка

  1. День 1: Подготовьте все необходимые складские растворы, как указано в таблице 3). Запасы хранят при -20 °C и размораживают при комнатной температуре. Обязательно тщательно перемешайте все запасы после размораживания и перед пипеткой. Рассчитайте необходимые объемы для всех запасов и составьте схему пипетки (табл. 4). Высокомолекулярные соединения будут добавляться только в РМ. Для низкомолекулярных соединений может быть приготовлен комбинированный 3 х мастермикс для RM и FM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечные объемы составных смесей могут быть меньше расчетных из-за потерь объема во время перемешивания. Этого можно избежать, добавив избыточный объем в 2-5%, чтобы компенсировать потерю объема.
  2. Уравновешивают мембрану диализной кассеты объемом 3 мл в трисацетате 100 мМ, рН 8,0. Обязательно удалите лишний буфер.
  3. Использование шприца для переноса РМ в диализную кассету. Удалите лишний воздух в отсеке RM путем аспирации с помощью шприца. Поместите диализную кассету в диализную камеру.
  4. Заполните диализную камеру 60 мл FM. Поместите крышку на камеру и затяните винты, чтобы зафиксировать ее. Инкубировать камеру в течение 12-16 ч при 30 °C при 200 об/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что камера остается в вертикальном положении во время перемешивания, иначе обмен низкомолекулярными соединениями будет затруднен.
  5. День 2: Используя шприц, аспирируйте РМ из диализной камеры. Переложите РМ в свежие пробирки и центрифугу при 16 000 х г при 4 °C в течение 10 мин для удаления осадка. Перенесите супернатант в свежие пробирки. Белок в супернатанте теперь может быть дополнительно проанализирован.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых случаях гранула будет присутствовать после центрифугирования. Это может предоставить важную информацию о пригодности анализируемых нанодисков или реакционных соединений для поддержания синтезированного РАСТВОРИМОГО МП. Поэтому целесообразно проанализировать количество мишени, потенциально присутствующей в осадке, с помощью SDS-PAGE, Western Blot или путем визуальной оценки размера гранул.

6. Аналитическая шкала 60 мкл CECF реакционная установка для скрининга ионов Mg2+

  1. День 1: Смешайте все компоненты соответствующего 3-кратного мастер-микса и распределите 60 мкл на RM и 825 мкл на FM. Заполните FM H2O и смешайте FM путем вихря. Перенос FM в 3 скважины из 24 скважин микропластин (табл. 5).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку индивидуальный контейнер Mini-CECF может быть недоступен, объемы в таблице 5 рассчитаны для реакции, проводимой в диализных картриджах (10-14 кДа MWCO, RM: 100 мкл) с FM-объемом 1,7 мл в 96 пластинах глубокой скважины (2 мл) (рисунок 1).
  2. Регенерированные целлюлозные диализные трубки с MWCO 10-14 кДа на куски размером примерно 25 x 20 мм и хранить в H2Oс 0,05% (мас./об.) азида натрия.
    ВНИМАНИЕ: Азид натрия очень токсичен. Избегайте любого контакта с кожей или слизистой оболочкой. Не используйте металлические контейнеры, так как азид натрия может вступать в реакцию с металлами с образованием взрывоопасных азидов металлов.
  3. Перед сборкой контейнера Mini-CECF удалите избыточныйH2Oиз мембран диализа с помощью ткани. Поместите по одному фрагменту мембраны на каждый контейнер и закрепите мембраны политетрафторэтиленовым кольцом.
  4. Перенесите контейнер Mini-CECF в колодцы 24-луночной плиты с 825 мкл FM. Избегайте пузырьков воздуха ниже диализной мембраны контейнера Mini-CECF.
  5. Добавьте высокомолекулярные компоненты в RM, как описано (таблица 5), и перемешайте путем пипетки вверх и вниз. Добавьте 60 мкл в реакционный контейнер. Избегайте пузырьков воздуха во время переноса вязкого раствора.
  6. Вырежьте 2 листа уплотнительной термопластичной пленки размером 8 х 10 см и оберните их вокруг 24-луночной пластины с реакционными контейнерами внутри. Это уменьшит испарение из реакционной смеси. Теперь поместите крышку пластины для культивирования клеток на пластину и закрепите ее скотчем. Инкубируют пластину при 30 °C и перемешивании 200 об/мин в течение 12-16 ч.
  7. День 2: Собирают реакционную смесь путем прокалывания через мембрану диализа с наконечником пипетки в контейнере Mini-CECF и аспирируют RM. Переложите RM в свежие трубки и центрифугу при 16 000 x g при 4 °C в течение 10 мин для удаления осадков. Перенесите супернатант в свежие пробирки. Белок в супернатанте теперь может быть дополнительно проанализирован.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых случаях после центрифугирования будет присутствовать гранула. Это может предоставить важную информацию о пригодности анализируемых нанодисков или других реакционных соединений для поддержания синтезированного МП растворимым. Поэтому целесообразно анализировать количество мишени, потенциально присутствующей в осадке, с помощью SDS-PAGE, Western Blot или визуальной оценки размера гранул.

Результаты

Иллюстрируется влияние тонко настраиваемых реакционных соединений на конечный выход или качество синтезированных МП. Частым рутинным подходом является корректировка оптимальной концентрации Mg2+ в реакциях CF путем экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве удобн?...

Обсуждение

Описана установка и стратегии оптимизации экспрессии CF и котрансляционной вставки функциональных МП в нанодиски. Требуемое оборудование включает в себя биореактор, френч-прессовое устройство или аналогичное, УФ/ВИС и флуоресцентный считыватель, реакционные сосуды CF, подходящие для д...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить грант Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) BE1911/8-1, проект LOEWE GLUE и совместный исследовательский центр Transport and Communication across Membranes (SFB807) за финансовую поддержку.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG)Avanti Polar Lipids (USA)840445P
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)Avanti Polar Lipids (USA)850345C
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC)Avanti Polar Lipids (USA)850375C
1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG)Avanti Polar Lipids (USA)840475C
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)Avanti Polar Lipids (USA)850457C
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG)Avanti Polar Lipids (USA)840034C
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris)Carl Roth (Germany)4855
2-MercaptoethanolCarl Roth (Germany)4227
2-PropanolCarl Roth (Germany)9781
[3H]-dihydroalprenolol HydrochlorideAmerican Radiolabeled Chemicals (USA)ART0134
Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP)Merck (Germany)1409
Adenosine 5’-triphosphate (ATP)Sigma Aldrich (Germany)A9251
Alprenolol hydrochlorideMerck (Germany)A0360000
Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose®Sigma-Aldrich (Germany)Q1126
Autoclave Type GE 446EC-1Gettinge (Germany)
Bioreactor Type 884 124/1B.Braun (Germany)
CentrifugeSorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)
Cholic acidCarl Roth (Germany)8137
Coomassie Brilliant Blue R250Carl Roth (Germany)3862
Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasksSchott Duran (Germany)
Cytidine 5'-triphosphate disodium saltSigma-Aldrich (Germany)C1506
D-glucose monohydrateCarl Roth (Germany)6780
Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrateCarl Roth (Germany)6878
Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubingFisher Scientific (Germany)8700152
DithiothreitCarl Roth (Germany)6908
EthanolCarl Roth (Germany)K928
Folinic acid calcium salt hydrateSigma-Aldrich (Germany)47612
French pressure cell disruptorSLM; Amico Instruments (USA)
GlycerolCarl Roth (Germany)3783
Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP)Sigma-Aldrich (Germany)G8877
Hydrochloric AcidCarl Roth (Germany)K025
IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mLGE Life Sciences (Germany)GE17-5248
ImidazoleCarl Roth (Germany)3899
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)Carl Roth (Germany)2316
KanamycinCarl Roth (Germany)T832
L-AlanineCarl Roth (Germany)3076.1
L-ArginineCarl Roth (Germany)6908
L-AsparagineCarl Roth (Germany)HN23
L-Aspartic AcidCarl Roth (Germany)T202
L-CysteineCarl Roth (Germany)T203
L-Glutamic AcidCarl Roth (Germany)3774
L-GlutamineCarl Roth (Germany)3772
L-GlycineCarl Roth (Germany)3187
L-HistidineCarl Roth (Germany)3852
L-IsoleucineCarl Roth (Germany)3922
L-LeucineCarl Roth (Germany)1699
L-LysineCarl Roth (Germany)4207
L-MethionineCarl Roth (Germany)9359
L-ProlineCarl Roth (Germany)1713
L-PhenylalanineCarl Roth (Germany)1709
L-SerineCarl Roth (Germany)4682
L-ThreonineCarl Roth (Germany)1738
L-TryptophaneCarl Roth (Germany)7700
L-TyrosineCarl Roth (Germany)T207
MD100 dialysis unitsScienova (Germany)40077
N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES)Carl Roth (Germany)6763
n-dodecylphosphocholineAntrace (USA)F308S
PAGE chamber: Mini-Protean Tetra CellBiorad (Germany)
PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systemsBiorad (Germany)
PAGE gel power supply: Power Pac 3000Biorad (Germany)
Tryptone/peptone from caseineCarl Roth (Germany)6681
Peristaltic pump: ip-12Ismatec (Germany)
Phosphoenol pyruvate monopotassium saltSigma Aldrich (Germany)860077
Potassium dihydrogen phosphateCarl Roth (Germany)P018
Potassium acetateCarl Roth (Germany)4986
Potassium chlorideCarl Roth (Germany)6781
Pyruvate KinaseRoche (Germany)10109045001
Scintillation counter: Hidex 300 SLHidex (Finland)
SDS pelletsCarl Roth (Germany)8029
Sodium azideSigma-Aldrich (Germany)K305
Sodium chlorideCarl Roth (Germany)P029
Spectrophotometer NanodropPeqlab (Germany)
Spectrophotometer/fluorescence reader Spark®Tecan (Switzerland)
tRNA (E. coli)Roche (Germany)10109550001
Ultra sonificatorLabsonic U, B. Braun (Germany)
Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP)Sigma-Aldrich (Germany)U6625
Y-30 antifoamSigma-Aldrich (Germany)A6457
Yeast extractCarl Roth (Germany)2904

Ссылки

  1. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  2. Ritchie, T. K., et al. Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs. Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).
  3. Frauenfeld, J., et al. A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  4. Yang, Z., et al. Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains. Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).
  5. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  6. Junge, F., et al. Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins. New Biotechnology. 28 (3), (2011).
  7. Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).
  8. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  9. Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Membrane protein expression: no cells required. Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).
  10. Roos, C., et al. Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).
  11. Cappuccio, J. A., et al. Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles. Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).
  12. Patriarchi, T., et al. Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  13. Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).
  14. Rues, R. B., Dötsch, V., Bernhard, F. Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).
  15. Henrich, E., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 1-19 (2017).
  16. Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  17. Henrich, E., et al. Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway. Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).
  18. Peetz, O., et al. Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).
  19. Kigawa, T., et al. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).
  20. Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).
  21. Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs. BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).
  22. Rues, R. B., Dong, F., Dötsch, V., Bernhard, F. Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding. Methods. 147 (1), 73-83 (2018).
  23. Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., Dötsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer. Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).
  24. Matthies, D., et al. Cell-free expression and assembly of ATP synthase. Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).
  25. Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., Dötsch, V., Bernhard, F. Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins. Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).
  26. Haberstock, S., et al. A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems. Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).
  27. Falkinham, J. O., Clark, A. J. Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12. Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).
  28. Foshag, D., et al. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).
  29. Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).
  30. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  31. Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation. Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).
  32. Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein. European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).
  33. Henrich, E., et al. From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs. Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).
  34. Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

165in vitroL CFG

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены