JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

החדרה משותפת לננו-דיסקים שנוצרו מראש מאפשרת לחקור חלבוני ממברנה מסונתזים ללא תאים בסביבות שומנים מוגדרות ללא מגע עם חומרי ניקוי. פרוטוקול זה מתאר את הכנת רכיבי המערכת החיוניים ואת הפרמטרים הקריטיים לשיפור יעילות הביטוי ואיכות הדגימה.

Abstract

מערכות ביטוי ללא תאים מאפשרות תכנון מותאם אישית של סביבות תגובה כדי לתמוך בקיפול פונקציונלי של אפילו חלבונים מורכבים כגון חלבוני ממברנה. ההליכים הניסיוניים להחדרה וקיפול של חלבוני ממברנה לתוך ממברנות מוכנות ומוגדרות המסופקות כננו-דיסקים מודגמים. הפרוטוקול נטול דטרגנטים לחלוטין ויכול לייצר מיליגרם של דגימות מטוהרות תוך יום אחד. דגימות חלבון/ננו-דיסקים של הממברנה המתקבלות יכולות לשמש למגוון מחקרים פונקציונליים ויישומים מבניים כגון התגבשות, תהודה מגנטית גרעינית או מיקרוסקופיית אלקטרונים. מתוארת הכנה של רכיבי מפתח בסיסיים כגון ליזטים ללא תאים, ננודיסקים עם ממברנות מעוצבות, פתרונות מלאי קריטיים וכן הרכבה של תגובות ביטוי דו-תאיות ללא תאים. מאחר שדרישות הקיפול של חלבוני ממברנה יכולות להיות מגוונות ביותר, המוקד העיקרי של פרוטוקול זה הוא אפנון של פרמטרים ושלבי תגובה החשובים לאיכות הדגימה כגון תרכובות תגובה בסיסיות קריטיות, הרכב ממברנה של ננו-דיסקים, חמצון-חיזור וסביבת מלווה, או עיצוב תבניות DNA. התהליך כולו מודגם עם סינתזה של פרוטאורהודופסין וקולטן מצומד לחלבון G.

Introduction

חלבוני ממברנה (MPs) הם מטרות מאתגרות במחקרי ייצור חלבונים בשל חוסר המסיסות שלהם בסביבות מימיות. פלטפורמות ייצור MP קונבנציונליות מורכבות ממערכות מבוססות תאים כגון E. coli, שמרים או תאים אאוקריוטים. חברי הפרלמנט הרקומביננטיים המסונתזים מופקים מקרום התא או מקופלים מחדש מגופי הכללה1. לאחר סילוק חומרי ניקוי, חברי פרלמנט יכולים להיות מועברים לסביבות ממברנה מתאימות על ידי פרוטוקולים שנקבעו במבחנה מחדש. מלבד שלפוחיות וליפוזומים, שחזור MP לממברנות מישוריות בצורה של חלקיקי ננו-דיסקים2 או סליפרו3 הפכו לטכניקות שגרתיות בתקופה האחרונה. עם זאת, כל האסטרטגיות הללו מרמזות על מגע דטרגנט עם חברי פרלמנט שיכול לגרום לערעור יציבות, דיסוציאציה של אוליגומרים, ואפילו אובדן מבנה החלבוןופעילותו 4. לפיכך, בדיקה לאיתור תנאי סילוק ושיקום אופטימליים של חומרי ניקוי יכולה להיות מייגעת ולגזול זמןרב 5.

האופי הפתוח של מערכות נטולות תאים (CF) מאפשר לתגובת הביטוי להיות מסופקת ישירות עם ממברנות מוכנות מראש עם הרכב שומנים מוגדר. במצב ביטוי מבוסס שומנים זה (L-CF), לחברי הפרלמנט המסונתזים יש הזדמנות להכניס במשותף לתוךה-bilayers 6,7 שסופקו (איור 1). ננו-דיסקים המורכבים מחלבון פיגום ממברנה (MSP) סביב דיסק דו-שכבתי של שומנים מישוריים8 נראים מתאימים במיוחד לאסטרטגיה זו 9,10. ננו-דיסקים יכולים להיות מורכבים באופן שגרתי במבחנה עם מגוון של שומנים שונים, הם יציבים מאוד, ומלאי יכול להיות מרוכז עד 1 mM. עם זאת, ביטוי MSP ב E. coli וטיהור שלה הוא הכרחי. כאסטרטגיה חלופית, MSP יכול לבוא לידי ביטוי יחד עם MP היעד בתגובות CF המסופקות עם ליפוזומים11,12,13. תבניות דנ"א הן עבור MSP והן עבור MP מתווספות לתגובה, ו-MP/nanodiscs יכולים להיווצר עם הביטוי. בעוד שייצור MSP נמנע, אסטרטגיית הביטוי המשותף דורשת כוונון קפדני של ריכוזי תבנית הדנ"א הסופיים וניתן לצפות לשינויים גבוהים יותר ביעילות ייצור הדגימה.

ההחדרה המשותפת של חברי פרלמנט לממברנות של ננו-דיסקים מוכנים מראש היא מנגנון לא פיזיולוגי ועדיין לא ידוע במידה רבה, שאינו תלוי במכונות טרנסלוקון וברצפי אותות13,14,15,16. הגורמים העיקריים המשפיעים על יעילות ההחדרה הם סוג חלבון הממברנה וכן הרכב השומנים של הממברנה המסופקת, עם העדפה תכופה לשומנים טעונים שלילית15,17. מכיוון שהממברנות הננו-דיסקיות מוגבלות יחסית בגודלן, כמות משמעותית של שומנים משתחררת עם הכנסת MP18. וריאציה של גודל ננו-דיסקים מאפשרת החדרה וכוונון של קומפלקסי MP אוליגומריים גבוהיםיותר 15,18. בין היתר, הוצגה הרכבה נכונה של קומפלקסים הומוליגומריים עבור תעלת היונים KcsA, עבור משאבת היונים פרוטאורהודופסין (PR) ועבור הטרנספורטר הרב-דרגי EmrE15,18. חברי פרלמנט צפויים להיכנס לממברנה הננו-דיסקית הסימטרית משני הצדדים בתדר שווה יחסית. לפיכך יש לקחת בחשבון כי מונומרים או אוליגומרים שונים המוחדרים לננו-דיסקית אחת עשויים להיות בעלי כיוונים מנוגדים. עם זאת, הטיה בכיוון יכולה להיגרם על ידי מנגנוני החדרה שיתופיים כפי שדווחו להיווצרות של הקסמרים יחסי ציבור וטטרמרים KcsA18. הטיה נוספת בכיוון MP עשויה לנבוע ממתגי התמצאות של חברי פרלמנט שהוכנסו, ככל הנראה בשפת הממברנות הננו-דיסקיות.

ייצור ליזטים של CF מזני E. coli הוא טכניקה שגרתית אמינה וניתן לבצע אותה כמעט בכל מעבדה ביוכימית19,20. יש לקחת בחשבון כי מלבד היווצרות גשר דיסולפידים, רוב השינויים האחרים שלאחר התרגום נעדרים אם MP מסונתז באמצעות E. coli lysates. בעוד שזה עשוי ליצור דגימות הומוגניות יותר למחקרים מבניים, ייתכן שיהיה צורך לשלול השפעות פוטנציאליות על תפקודן של מטרות MP בודדות. עם זאת, הייצור היעיל של דגימות באיכות גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCR)14,21,22, טרנספורטרים אאוקריוטים 23 או מכלולים הטרומריים גדולים 24 בליזאטים של E. coli CF מצביע על התאמתם אפילו למטרות מורכבות. ניתן לקבל כמויות בקנה מידה מכין (≈ 1 מ"ג/מ"ל) של דגימה עם תצורת שני תאים ללא תאים רציפים (CECF), המורכבת מתערובת תגובה (RM) ותא תערובת הזנה (FM). נפח ה-FM עולה על נפח RM פי 15 עד פי 20 ומספק מאגר של תרכובות אנרגיה בעלות משקל מולקולרי נמוך ומבשרי19. תגובת הביטוי מוארכת אפוא למספר שעות והתפוקה הסופית של יעד ה- MP גדלה. תאי ה-RM וה-FM מופרדים על ידי קרום דיאליזה עם ניתוק של 10-14 kDa. שני התאים דורשים עיצוב מיוחד של מיכל התגובה CECF (איור 1). קלטות דיאליזה מסחריות כמיכלי RM בשילוב עם מיכלי פרספקס מותאמים המחזיקים את ה- FM הם דוגמאות מתאימות. ניתן לתמרן עוד יותר את תשואות MP על ידי שינוי יחסי RM:FM או על ידי החלפת ה- FM לאחר תקופה מסוימת של דגירה.

תפוקה ואיכות של MP דורשות לעתים קרובות אופטימיזציה אינטנסיבית של פרמטרי התגובה. יתרון חשוב של ביטוי CF הוא האפשרות לשנות ולדייק כמעט כל תרכובת בהתאם לדרישות האישיות של חבר פרלמנט. אסטרטגיה פשוטה היא להתמקד תחילה בשיפור התפוקה של MP על ידי יצירת פרוטוקול ייצור בסיסי ולאחר מכן לייעל את איכות MP על ידי כוונון עדין של התגובה ותנאי הקיפול. היעדר תהליכים פיזיולוגיים בליזאטים של CF ומורכבותם המופחתת גורמים לשיעורי הצלחה גבוהים לייצור יעיל של חברי פרלמנט25. שיקולים שגרתיים לתכנון תבנית דנ"א ואופטימיזציה של ריכוז היונים Mg 2+ מספיקים ברוב המקרים כדי להשיג תשואות משביעות רצון26. בהתאם למצב הביטוי, אופטימיזציה של איכות MP יכולה לגזול זמן רב, מכיוון שיש לסנן מגוון גדול יותר של פרמטרים14,17,22.

כדי לבסס את פלטפורמת ביטוי ה-CF המתוארת, פרוטוקולים נחוצים לייצור E . coli CF lysate (i), T7 RNA פולימראז (ii), ננודיסקים (iii) ותרכובות התגובה הבסיסיות של CECF (iv) (איור 1). נגזרות זן E . coli K12 A1927 או BL21 משמשות לעתים קרובות להכנת ליזטים יעילים מסוג S30 (צנטריפוגה ב-30,000 x גרם). מלבד ליזטים מסוג S30, ניתן להשתמש בליזאטים מקבילים הצנטריפוגים בכוחות g אחרים (למשל S12). הליזאטים נבדלים זה מזה ביעילות הביטוי ובמורכבות הפרוטאום. הפרוטאום של ליזאט S30 שהוכן על ידי הפרוטוקול המתואר נחקר בפירוט28. הפרוטאום S30 עדיין מכיל כמה חלבוני ממברנה חיצונית שיורית שיכולים לתת בעיות רקע בעת ביטוי וניתוח של תעלות יונים. עבור מטרות כאלה, מומלץ להשתמש ב- S80-S100 lysates. שינוי רב ערך במהלך הכנת ליזאט הוא אינדוקציה של תגובת SOS על ידי הלם חום משולב ואספקת אתנול בשלב הגדילה באמצע לוג של התאים. הליזטים HS30 המתקבלים מועשרים במלווים וניתן להשתמש בהם בתערובות עם ליזטים S30 לקיפול MPמשופר 22. ביטוי CF בליזאטים של E. coli מופעל כתהליך שעתוק/תרגום מצומד עם תבניות דנ"א המכילות מקדמים הנשלטים על ידי T7 RNA פולימראז (T7RNAP). האנזים יכול להיות מיוצר ביעילות בתאי כוכב BL21(DE3) הנושאים את פלסמיד pAR121929.

שני עותקים של MSP1E3D1 מורכבים לננו-דיסק אחד בקוטר של 10-12 ננומטר, אך הפרוטוקול המתואר להלן עשוי לעבוד גם עבור נגזרות MSP אחרות. עם זאת, ננו-דיסקים גדולים יותר מאלה שנוצרו עם MSP1E3D1 נוטים להיות פחות יציבים, בעוד שננו-דיסקים קטנים יותר שנוצרו עם נגזרות MSP כגון MSP1 עשויים שלא להכיל קומפלקסים גדולים יותר של חברי פרלמנט או MP. ניתן להרכיב ננו-דיסקים של MSP1E3D1 במבחנה עם מגוון גדול של שומנים שונים או תערובות שומנים. ננודיסקים מוכנים מראש הם בדרך כלל יציבים במשך > שנה אחת ב -80 מעלות צלזיוס, בעוד היציבות עשויה להשתנות עבור רכיבי שומנים שונים. לצורך סינון השפעות השומנים על קיפול ויציבות של MP, יש צורך להכין מערך מקיף של ננודיסקים המורכבים ממגוון מייצג של תערובות ליפידים/שומנים. השומנים הבאים עשויים לתת בחירה התחלתית טובה: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-פלמיטויל-2-אולאויל-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG) ו-1-פלמיטואיל-2-אולאויל-גליצרו-3-פוספוקולין (POPC).

מתואר פרוטוקול להכנת תגובת CECF של 3 מ"ל. שינוי קנה מידה נוסף למעלה או למטה ביחס של 1:1 אפשרי. עבור תצורת CECF הדו-תארית, יש להכין RM המכיל את כל התרכובות ו- FM המכיל רק את התרכובות בעלות המשקל המולקולרי הנמוך. מכשירי דיאליזה מסחריים של 3 מ"ל עם 10-14 kDa MWCO יכולים לשמש כמכולות RM, אשר ממוקמות לאחר מכן במיכלי פרספקס בהתאמה אישית המחזיקים את ה- FM (איור 1D)30. היחס של RM:FM הוא 1:20, ולכן 60 מ"ל של FM צריכים להיות מוכנים ל-3 מ"ל RM. איכות, ריכוז או סוג של מספר רכיבים יכולים להיות קריטיים לתפוקה הסופית ו/או לאיכות של ה-MP המסונתז (טבלה 1). תבניות DNA צריכות להיות מוכנות על פי ההנחיות שפורסמו ואופטימיזציה קודונית של מסגרת הקריאה של היעד יכולה לשפר עוד יותר באופן משמעותי את תפוקת המוצר26. עבור תגובת CECF בקנה מידה הכנה, מתואר פרוטוקול מבוסס לייצור יחסי ציבור. כדי לקבוע פרוטוקולי ביטוי עבור חברי פרלמנט חדשים, בדרך כלל יש צורך לבצע מסכי אופטימיזציה של תרכובות מסוימות (טבלה 1) כדי לשפר את התפוקה והאיכות. עבור יוני Mg2+ , קיים ריכוז אופטימלי ממוקד היטב שלעתים קרובות מראה שונות משמעותית עבור תבניות דנ"א שונות. תרכובות אחרות של תגובת CF, כגון אצוות חדשות של T7RNAP או ליזטים מסוג S30, עשויות לשנות עוד יותר את הריכוז האופטימלי של Mg2+ . לדוגמה, מסך Mg 2+ טיפוסי בטווח של ריכוז14-24 mM ובשלבים של 2 mM מתואר. כל ריכוז מוקרן בכפילויות ובתגובות CECF בקנה מידה אנליטי. כמיכל תגובה של CECF, מיכלי פרספקס Mini-CECF בהתאמה אישית30 המחזיקים את ה-RM משמשים בשילוב עם מיקרו-לוחות סטנדרטיים של 24 בארות המחזיקים את ה-FM (איור 1B). לחלופין, ניתן להשתמש במחסניות דיאליזה מסחריות בשילוב עם מיקרו-לוחות באר בעומק 96 או התקני דיאליזר מסחריים אחרים בתצורות מתאימות (איור 1C).

Protocol

1. הכנת ליזאט S30

  1. יום 1: הוציאו תאים ממלאי גליצרול על צלחת אגר LB ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  2. יום 2: לחסן 200 מ"ל של מדיום LB עם התאים מצלחת אגר לדגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12-14 שעות.
  3. יום 3: חיסון 10 ליטר של מדיום YPTG סטרילי (10 גרם/ל' תמצית שמרים, 16 גר'/ל' טריפטון, 5 גרם/ל' NaCl, 19.8 גר'/ל' גלוקוז, 4.4 מ'מ' קמ"ש 2 PO 4, 8 מ'מ' K2HPO4) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בכור מיכל מעורבב בנפח 15 ליטר עם 100 מ"ל של קדם-תרבית (1:100). מטפחים ב-37 מעלות צלזיוס, 500 סל"ד ואוורור גבוה (~ 3 נפחי אוויר לדקה). כדי למנוע הקצפה מוגזמת, יש להוסיף חומר נוגד קצף סטרילי.
  4. מדוד צפיפות אופטית (OD) ב- 600 ננומטר במרווחי זמן קבועים. לאחר כשעתיים התרבות תיכנס לשלב הלוג.
  5. שינוי עבור HS30 ליזאט: כאשר התאים נמצאים באמצע שלב היומן (OD600 ≈ 3.6-4.2) מוסיפים 300 מ"ל של אתנול למדיום התרבית וממשיכים בטיפוח בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס, 500 סל"ד ואוורור גבוה (כ-3 נפחי אוויר לדקה) למשך 45 דקות נוספות. לאחר מכן המשך עם קירור וקציר של תרבית התאים כמתואר בשלב 1.6. לייצור ליזאט S30 סטנדרטי, דלג על שלב זה והמשך לשלב 1.6.
  6. כאשר התאים נמצאים באמצע שלב היומן (OD600 ≈ 3.6-4.2), מתסיס קריר מתחת ל-20 מעלות צלזיוס תוך <-30 דקות. OD600 הסופי צריך להיות סביב 4.5-5.5. קוצרים תאים ב-4,500 x גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ומשליכים את הסופר-נטנט. שמור על תאים ב- 4 ° C לאורך השלבים הבאים.
    הערה: במהלך הקירור, עלולה להופיע הקצפה מוגזמת. במקרה זה, יש להוסיף אנטי-פום או להפחית את מהירות הערבוב ו/או להקטין את זרם האוויר בביוריאקטור.
  7. השהה תאים לחלוטין ב-300 מ"ל של חיץ S30-A (10 mM Tris-HCl, pH 8.2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KCl, 6 mM 2-mercaptoethanol) באמצעות מרית ואחריה ניתז את התרחיף למעלה ולמטה עד הומוגניות. צנטריפוגה ב 8,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה פעמיים.
    אזהרה: 2-מרקפטואתנול הוא רעיל. יש להימנע ממגע עם העור או דרכי הנשימה. אם אפשר, לעבוד מתחת למכסה המנוע. שקלו את הצנטריפוגה הריקה לפני שלב הכביסה האחרון. לאחר הצנטריפוגה, שקלו את כדור התא הרטוב והמשיכו לשלב 1.8 או אחסנו את הכדור עד לשימוש נוסף.
    הערה: משקלו של כדור התא הרטוב הוא 5-7 גרם לכל תרבית ביוריאקטור של ליטר אחד. בשלב זה ניתן להשהות את הפרוטוקול וניתן להקפיא את הכדור בחנקן נוזלי ולאחסן אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך 4-8 שבועות.
  8. השהה תאים ביסודיות ב-1.1 נפחים (1 גרם = 1 מ"ל) של מאגר S30-B (10 mM Tris-HCl, pH 8.2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KOAc, 1 mM DTT, טבליה אחת של מעכב פרוטאז cOmplete). ממלאים את המתלים בתא לחץ צרפתי מקורר מראש ומשבשים תאים ב-1,000 psig. מעבירים תאים דרך העיתונות הצרפתית פעם אחת.
  9. צנטריפוגה ליזאט ב 30,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את הסופר-נטנט לצינור טרי וחוזרים על שלב הצנטריפוגה.
    הערה: שכבה רופפת ורזה עשויה להימצא על גבי הכדור לאחר הצנטריפוגה הראשונה, אשר לא צריך להיות מועבר עם supernatant.
  10. יש למרוח מדרג גבוה של מלח וחום כדי להסיר רכיבי ליזאט לא יציבים ולשחרר mRNA מריבוזומים. יש להתאים את הליזאט ל-0.4 M NaCl ולדגירה בטמפרטורה של 42°C למשך 45 דקות באמבט מים.
    הערה: שלב זה יגרום להיווצרות משקעים משמעותיים. הפוך או הפוך את הצינור במהלך הדגירה מעת לעת.
  11. מעבירים את המתלים העכורים (בדרך כלל 50-80 מ"ל) לצינורות דיאליזה עם ניתוק של 10-14 kDa ודיאליזה כנגד חיץ 5 L S30-C (10 mM Tris-HCl, pH 8.2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KOAc, 0.5 mM DTT). החלף את מאגר הדיאליזה S30-C לאחר 2-3 שעות ודיאליזה למשך 12-14 שעות נוספות.
  12. יום 4: מעבירים את המתלים החד-פעמיים לצינורות צנטריפוגה וצנטריפוגה ב-30,000 x גרם למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. העבירו סופר-נטנט (ליזאט S30) לצינורות טריים של 50 מ"ל וערבבו בעדינות. ריכוז החלבון של ליזאט צריך להיות כ 30-40 מ"ג / מ"ל. הקפאת זעזוע (למשל 0.5 מ"ל, 1 מ"ל) בחנקן נוזלי ואחסון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. האליקוטים יציבים במשך > שנה.

2. ביטוי וטיהור של T7 RNA פולימראז

  1. יום 1: לחסן 200 מ"ל LB בינוני המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין עם BL21(DE3) כוכב x pAR1219 מצופה טרי תאים ודגירה ב 37 °C ו 180 סל"ד במשך 12-16 שעות.
  2. יום 2: לחסן 1 ליטר מרק נהדר (12 גרם / ליטר טריפטון, 24 גרם / L תמצית שמרים, 4 מ"ל / L גליצרול) בבקבוק מבולבל 2 ליטר עם 10 מ"ל של טרום תרבית דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 180 סל"ד תסיסה. OD600 ההתחלתי צריך להיות סביב 0.1.
  3. כאשר ה-OD600 מגיע ל-0.6-0.9, הוסיפו IPTG לריכוז סופי של 1 mM כדי לגרום לביטוי T7RNAP והמשיכו בטיפוח במשך 5 שעות נוספות.
  4. קצירת תאים על ידי צנטריפוגה ב 4,500 x גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. להקפיא תאים בחנקן נוזלי ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
    הערה: הפרוטוקול עשוי להיות מושהה כאן.
  5. יום 3: הוסיפו 30 מ"ל של חיץ תרחיף קר כקרח (30 mM Tris-HCl, pH 8.0 עם טבליה אחת של מעכב פרוטאז cOmplete) לכדור התא הקפוא והפשירו את הכדור באמבט מים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להשעות את הכדור על ידי pipetting למעלה ולמטה עד הומוגניות.
  6. בצע שיבוש תאים באמצעות מכונת דפוס צרפתית כמתואר בסעיף הקודם או השתמש בהתקן סוניקציה בהתאם להמלצות היצרן. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 20,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהעביר supernatant לתוך צינור טרי.
  7. כדי לזרז את הדנ"א הגנומי, יש להוסיף סטרפטומיצין סולפט באיטיות ותחת תסיסה עדינה לסופרנטנט עד להגעה לריכוז סופי של 3% (w/v). יש לדגור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות תחת תסיסה עדינה. צנטריפוגה ב 20,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  8. סנן את הסופרנטנט עם מסנן 0.45 מיקרומטר וטען אותו על עמודת Q-Sepharose עם נפח עמודה (CV) של 40 מ"ל שיווי משקל עם 2 מאגר שיווי משקל CV (30 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5% גליצרול ו-10 mM 2-mercaptoethanol) באמצעות משאבה פריסטלטית בקצב זרימה של 4 מ"ל/דקה. לאחר מכן, חבר את העמודה לגלאי UV והמשך בחיץ שיווי משקל עד שאות ה- UV ב- 280 ננומטר מגיע לקו בסיס יציב.
  9. Elute T7RNAP עם שיפוע מ-50 mM ל-500 mM NaCl לכל CV בקצב זרימה של 3 מ"ל/דקה. אסוף שברים של 1 מ"ל והכן דגימות לניתוח SDS-PAGE על-ידי ערבוב של 10 μL מכל שבר עם 2 x מאגר דגימות SDS. הפעל SDS-PAGE והכתים את הג'ל עם Coomassie Blue R. T7RNAP אמור להופיע כלהקה בולטת בערך 90 kDa יחד עם רצועות רבות נוספות של זיהומים.
  10. שברי בריכה המכילים T7RNAP ודיאליזה באמצעות ממברנות עם MWCO של 12-14 kDa למשך 12-16 שעות במאגר דיאליזה (10 mM K 2 HPO 4/KH2PO4, pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT, 5% (w/v) גליצרול).
  11. יום 4: אסוף תמיסת T7RNAP ורכז באמצעות יחידות סינון עם 12-14 MWCO לריכוז סופי של 3-10 מ"ג/מ"ל. T7RNAP עשוי להתחיל לזרז במהלך הריכוז. יש להפסיק את הריכוז באופן מיידי ברגע שמתרחשת עכירות בדגימה. מוסיפים גליצרול לריכוז סופי של 50% (w/v) ומערבבים בעדינות. הקפאת זעזועים 0.5-1 מ"ל aliquots ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. עבודה T7RNAP aliquots ניתן לאחסן ב -20 °C (70 °F).
    הערה: יש לקבל כ-20-40 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל T7RNAP מטוהר חלקית עם 20,000-40,000 יחידות מתסיסת 1 ליטר. כדי לבדוק את הכמות האופטימלית של כל אצווה T7RNAP, יש לבצע תגובות ביטוי CF של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המכיל 0.02 מ"ג/מ"ל-0.1 מ"ג/מ"ל של דגימת T7RNAP המוכנה.

3. ביטוי וטיהור של MSP1E3D1

  1. יום 1: התמרה של תאי כוכב E. coli BL21 (DE3) באמצעות וקטור pET28(a)-MSP1E3D131 באמצעות טרנספורמציה סטנדרטית של הלם חום או פרוטוקולי אלקטרופורציה. פסים החוצה או צלחת מותמרים תאים על אגר LB המכיל 30 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin ודגירה ב 37 °C במשך 12-16 שעות.
  2. יום 2: חיסון 200 מ"ל של LB בינוני בתוספת 0.5% גלוקוז (w/v) ו-30 מיקרוגרם/מ"ל קנאמיצין עם מושבה אחת שנקטפה מצלחת האגר ודגירה ב-37°C ב-180 סל"ד למשך 12-16 שעות.
  3. יום 3: יש לחסן 10 ליטר LB בינוני בתוספת 0.5% גלוקוז (w/v) ו-30 מיקרוגרם/מ"ל קנאמיצין עם 100 מ"ל של קדם-תרבית בביוריאקטור מעורבב. לבצע תסיסה ב 37 מעלות צלזיוס, 500 סל"ד ואוורור של כ 3 נפחי bioreactor לדקה. במקרה של קצף מוגזם, להוסיף antifoam.
    הערה: ניתן להשתמש בצלוחיות רועדות מבולבלות במקום בתסיסה.
  4. ב- OD600 של 6.5-7.5, הוסף IPTG לריכוז סופי של 1 mM והמשך הדגירה ב- 37 °C למשך שעה אחת. קצירת תאים על ידי צנטריפוגה ב 4,500 x גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף כדוריות תא עם 200 מ"ל של 0.9% (w / v) NaCl וצנטריפוגה שוב ב 8,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. יש להשליך את הסופר-נאטנט ולהעביר תאים לצינורות של 50 מ"ל באמצעות מרית. משקל הכדור הרטוב הצפוי הוא 8-12 גרם לליטר של תרבית ביוריאקטור. יש להקפיא כדוריות תאים בחנקן נוזלי ולאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
  5. יום 4: לטיהור, הפשירו כדורי תאים באמבט מים ב- RT. השעו את התאים בחיץ MSP-A (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 1% (w/v) Triton X-100, טבליה אחת של קוקטייל מעכב פרוטאז c0mplete לכל תרחיף תאים של 50 מ"ל) כדי להניב השעיית תאים של 30-40% (w/v).
  6. לשבש תאים על ידי סוניקציה או באמצעות מכבש צרפתי צנטריפוגה ב 30,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את הסופרנטנט לצינור טרי ומסננים דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר. החל את התסנין על עמודת חומצה ניטרילוטריאצטית טעונהNi 2+ (CV > 15 מ"ל) בשיווי משקל עם 5 CV של מאגר MSP-B (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 1% (w/v) Triton X-100) באמצעות משאבה פריסטלטית.
    הערה: כדי להקל על הסינון, ניתן לגנוז את הסופר-נטנט למשך דקה נוספת כדי לפרק מקטעי דנ"א גדולים.
  7. לאחר טעינת הדגימה, יש לשטוף את העמודה עם 5 CV MSP-B, 5 CV MSP-C (40 mM Tris-HCl, pH 8.9, 300 mM NaCl, 50 mM חומצה כולית), 5 CV MSP-D (40 mM Tris-HCl, pH 8.9, 300 mM NaCl), 5 CV MSP-E (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl) ו-5 CV MSP-F (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole).
    הערה: חומצה כולית במאגר MSP-C חשובה להסרת שומנים המחוברים ל-MSP. חומצה כולית אינה מסיסה לחלוטין בערכי pH נמוכים. לפיכך, יש להתאים את ערך ה- pH ל- 8.9 ב- MSP-C וב- MSP-D. חשוב לשטוף את העמודה עם חיץ MSP-D, שכן pH נמוך יותר עלול לגרום לחומצה כולית שיורית לזרז ולחסום או לפגוע בעמודה.
  8. אלוט MSP עם MSP-G (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 300 mM imidazole). אסוף שברים של 1 מ"ל ועקוב אחר ספיגת UV במהירות של 280 ננומטר. לאסוף ולאגד את השברים של פסגת האלוציה.
  9. מעבירים שברי MSP מאוגדים לתוך שפופרות ממברנת דיאליזה של 12-14 kDa MWCO ועושים דיאליזה כנגד 5 ליטר של MSP-H (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 10% (w/v) גליצרול) למשך 2-3 שעות ב-4 מעלות צלזיוס. החלף למאגר 5 ליטר MSP-H טרי ועשה דיאליזה למשך 12-16 שעות נוספות ב-4 מעלות צלזיוס.
  10. יום 5: העבר תמיסת MSP לצינורות צנטריפוגה וצנטריפוגה ב 18,000 x g במשך 30 דקות ב 4 °C כדי להסיר משקעים. העבר סופרנטנט לצינור טרי והתרכז ל-200-800 μM באמצעות התקני אולטרה-סינון עם 12-14 kDa MWCO ב-4 °C. מדידת ריכוז באמצעות מכשיר מדידת UV/VIS. השתמש במקדם הכחדה של 27.31 M-1 cm-1 ובמסה המולקולרית של 31.96 kDa לחישוב הריכוז.
    הערה: ביטוי בביו-ריאקטור מניב בדרך כלל 15-30 מ"ג של MSP1E3D1 לכל תרבית L.
  11. הקפאת זעזועים של תמיסת MSP מרוכזת בחנקן נוזלי ואחסון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

4. הרכבה של ננו-דיסקים MSP1E3D1

  1. יום 1: הכינו 1-2 מ"ל של מלאי שומנים של 50 מ"מ (DMPG, DOPG, POPG DMPC, DOPC או POPC) בכולאט נתרן של 100 מ"מ. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C אם לא נעשה בה שימוש באותו היום.
    הערה: תמיסת השומנים חייבת להיות ברורה. אם התמיסה אינה ברורה, ריכוז נתרן כולאט עשוי להיות מוגברת ל 150 mM.
  2. ערבבו את תמיסת MSP1E3D1 עם תמיסת השומנים. הוסף דודציל פוספוכולין (DPC) בריכוז סופי של 0.1% (w/v). ניתן להתאים את תגובות ההרכבה לנפחים סופיים של 3 מ"ל (טבלה 2) או 12 מ"ל המתאימים לנפחים טיפוסיים של קלטות דיאליזה (10 kDa MWCO). תגובות הרכבה דגירה במשך שעה אחת ב-21 מעלות צלזיוס תחת תסיסה עדינה.
    הערה: עבור כל שומנים, יש להשתמש ביחס MSP1E3D1:lipid ספציפי כדי להבטיח הכנה הומוגנית של ננו-דיסקים (טבלה 2). עבור שומנים חדשים או תערובות שומנים, יש לקבוע את היחס האופטימלי באמצעות ניסוי פיילוט וניתוח כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל14.
  3. הרטבת מראש את הממברנה של קלטת דיאליזה עם חיץ היווצרות דיסק (DF) (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl). מעבירים את תערובת ההרכבה לתוך קלטת הדיאליזה עם מזרק. בועות אוויר פוטנציאליות ניתן להסיר על ידי שאיפה באמצעות מזרק.
  4. ימים 1-4: יש לחייג כנגד 3 x 5 L DF buffer למשך 10-20 שעות ב-RT תחת תסיסה באמצעות מוט ערבוב. לאחר מכן העבר את תערובת ההרכבה מקלטת הדיאליזה ליחידות מסנן צנטריפוגליות עם 10 kDa MWCO בשיווי משקל עם חיץ DF. התרכזו ב-4,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: תערובת דיאליזה עכורה עלולה להצביע על יחס סטויכיומטרי שגוי של MSP:lipid. יש להסיר משקעים ב 18,000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס לפני ריכוז הדגימה. כדי למנוע משקעים במהלך ריכוז הדגימה, השתמש ביחידות אולטרה סינון עם deadstop גדול.
  5. רכז את הננודיסקים המורכבים לריכוז של לפחות 300 μM. מדוד את הריכוז באמצעות קורא UV/VIS. קחו בחשבון שננו-דיסק אחד נוצר על ידי שתי מולקולות MSP1E3D1 ולכן, הריכוז של MSP חייב להיות מחולק ב-2 כדי לקבוע את הכמות הנכונה של ננו-דיסקים.
    הערה: ההתקנה המתוארת (טבלה 2) תניב 0.6-1 מ"ל של פתרון ננו-דיסק של 300 מיקרומטר.
  6. צנטריפוגה להכנת ננו-דיסקית מרוכזת ב-18,000 x גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להסיר את המשקעים. לאחר מכן, שאפו את ה-supernatant והקפיא/הקפאה של 50 μL בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    הערה: מומלץ להעריך את ההצלחה של היווצרות ננו-דיסקים באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. המדגם צריך להיות monodisperse צריך להכיל רק כמות נמוכה של אגרגטים. אגרגטים מצביעים על כך שכמות השומנים בהתקנה גבוהה מדי. כהפניה, ניתן להשתמש ב-MSP1E3D1 מטוהר. אם תכשיר הננו-דיסקים מראה שיא בגובה השיא של MSP1E3D1 הייחוס, יחס השומנים שנבחר ל-MSP1E3D1 היה נמוך מדי.

5. סולם הכנה 3 מ"ל הגדרת תגובת CECF

  1. יום 1: הכן את כל פתרונות המלאי הדרושים כמפורט (טבלה 3). המניות מאוחסנות ב -20 מעלות צלזיוס ומופשרות בטמפרטורת החדר. הקפידו לערבב היטב את כל המניות לאחר ההפשרה ולפני הפיפטות. חשב את הנפחים הנדרשים עבור כל המניות ובצע ערכת פיפטינג (טבלה 4). תרכובות בעלות משקל מולקולרי גבוה יתווספו רק ל-RM. עבור תרכובות בעלות משקל מולקולרי נמוך, ניתן להכין שילוב של 3 x mastermix עבור RM ו- FM.
    הערה: הנפחים הסופיים של תערובות מורכבות עשויים להיות קטנים מהחישוב עקב אובדן נפח במהלך הערבוב. ניתן להימנע מכך על ידי הוספת נפח עודף של 2-5% כדי לפצות על אובדן נפח.
  2. שיווי משקל הממברנה של קסטת דיאליזה 3 מ"ל ב-100 mM Tris-acetate, pH 8.0. הקפידו להסיר את המאגר העודף.
  3. באמצעות מזרק כדי להעביר את RM לתוך קלטת דיאליזה. הסר אוויר עודף בתא RM על ידי שאיפה עם המזרק. הכניסו את קלטת הדיאליזה לתא הדיאליזה.
  4. מלאו את תא הדיאליזה ב-60 מ"ל FM. הניחו את המכסה על התא והדקו את הברגים כדי לתקן אותו. לדגור את התא במשך 12-16 שעות ב 30 מעלות צלזיוס ב 200 סל"ד.
    הערה: ודא שהתא נשאר במצב זקוף במהלך התסיסה, אחרת חילופי תרכובות מולקולריות נמוכות ייפגעו.
  5. יום 2: באמצעות מזרק, לשאוף את RM מתא הדיאליזה. העבירו את ה-RM לצינורות טריים ולצנטריפוגה בטמפרטורה של 16,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להסיר את המשקעים. מעבירים את הסופרנטנט לצינורות טריים. כעת ניתן לנתח עוד יותר את החלבון שבסופרנטנט.
    הערה: במקרים מסוימים, גלולה תהיה נוכחת לאחר צנטריפוגה. זה יכול לספק מידע חשוב על ההתאמה של ננודיסקים מנותחים או תרכובות התגובה כדי לשמור על MP מסונתז מסיס. לכן מומלץ לנתח את כמות המטרה הפוטנציאלית הקיימת במשקע באמצעות SDS-PAGE, כתם מערבי, או על ידי הערכה חזותית של גודל הכדור.

6. סולם אנליטי 60 μL מערך תגובת CECF לסינון יונים Mg2+

  1. יום 1: ערבבו את כל הרכיבים של תערובת 3x Master המתאימה והפיצו 60 μL ל-RM ו-825 μL ל-FM. מלאו את FM ב-H2O וערבבו FM על ידי מערבולת. העבר FM ל-3 בארות של 24 מיקרו-פלטות (טבלה 5).
    הערה: מאחר שייתכן שהמכל המותאם אישית של Mini-CECF אינו נגיש, הנפחים בטבלה 5 מחושבים עבור תגובה המתבצעת במחסניות דיאליזה (10-14 kDa MWCO, RM: 100 μL) עם נפח FM של 1.7 מ"ל ב-96 לוחות קידוח עמוקים (2 מ"ל) (איור 1).
  2. חותכים צינורות דיאליזה של תאית מתחדשת עם MWCO של 10-14 kDa לחתיכות בגודל של כ-25 x 20 מ"מ ומאחסנים ב-H2O עם 0.05% (w/v) נתרן אזיד.
    אזהרה: נתרן אזיד רעיל מאוד. יש להימנע מכל מגע עם העור או עם הקרום הרירי. אין להשתמש במיכלי מתכת, שכן נתרן אזיד יכול להגיב עם מתכות ליצירת אזידים מתכתיים נפיצים.
  3. לפני הרכבת מיכל Mini-CECF, הסר עודף H2O מקרומי הדיאליזה עם רקמה. מניחים חתיכת קרום אחת על כל מיכל ולתקן את הממברנות עם טבעת polytetrafluorethylen.
  4. העבר את מיכל Mini-CECF לתוך בארות של צלחת 24 בארות עם 825 μL של FM. הימנע מבועות אוויר מתחת לקרום הדיאליזה של מיכל Mini-CECF.
  5. הוסף רכיבים מולקולריים גבוהים ל-RM כמתואר (טבלה 5) וערבב על-ידי פיפטינג למעלה ולמטה. הוסף 60 μL למיכל התגובה. הימנע בועות אוויר במהלך העברת הפתרון צמיג.
  6. חותכים 2 יריעות בגודל 8X10 ס"מ של סרט תרמופלסטי אוטם ועוטפים אותן סביב צלחת 24 הבאר עם מיכלי התגובה בפנים. זה יפחית את האידוי מתערובת התגובה. עכשיו מניחים את המכסה של צלחת תרבית התא על הצלחת לתקן אותו עם קלטת. לדגום את הצלחת ב 30 מעלות צלזיוס ו 200 סל"ד תסיסה במשך 12-16 שעות.
  7. יום 2: קצור את תערובת התגובה על ידי פירסינג דרך קרום הדיאליזה עם קצה הפיפטה במיכל Mini-CECF ושאף את ה- RM. העבר RM לצינורות טריים וצנטריפוגה ב 16,000 x g ב 4 °C למשך 10 דקות כדי להסיר משקעים. מעבירים את הסופרנטנט לצינורות טריים. כעת ניתן לנתח עוד יותר את החלבון שבסופרנטנט.
    הערה: במקרים מסוימים, לאחר צנטריפוגה יהיה גלולה. זה יכול לספק מידע חשוב על ההתאמה של ננודיסקים מנותחים או תרכובות תגובה אחרות כדי לשמור על MP מסונתז מסיס. לכן מומלץ לנתח את כמות המטרה הפוטנציאלית הקיימת במשקע על ידי SDS-PAGE, כתם מערבי, או הערכה חזותית של גודל הכדור.

תוצאות

ההשפעה של תרכובות תגובה של כוונון עדין על התפוקה הסופית או האיכות של חברי פרלמנט מסונתזים מודגמת. גישה שגרתית נפוצה היא להתאים את הריכוז האופטימלי של Mg2+ בתגובות CF על ידי ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כניטור נוח של יעילות המערכת. לדוגמה, GFP סונתז מווקטור pET-21a(+) בריכוזי Mg 2+ בין 14...

Discussion

מתוארות ההגדרות והאסטרטגיות למיטוב ביטוי ה- CF והכנסת התרגום המשותף של חברי פרלמנט פונקציונליים לננו-דיסקים. הציוד הנדרש כולל ביוריאקטור, מכשיר עיתונות צרפתי או דומה, קורא UV/VIS ופלואורסצנציה, כלי תגובה CF המתאימים למערך תצורה דו-תאי, ואינקובטור מבוקר טמפרטורה. ציוד סטנדרטי נוסף הוא צנטריפוג...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

ברצוננו להודות למענק דויטשה פורשונגסגמיינשאפט (DFG) BE1911/8-1, לפרויקט LOEWE GLUE, ולמרכז המחקר המשותף תחבורה ותקשורת על פני ממברנות (SFB807) על התמיכה הכספית.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG)Avanti Polar Lipids (USA)840445P
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)Avanti Polar Lipids (USA)850345C
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC)Avanti Polar Lipids (USA)850375C
1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG)Avanti Polar Lipids (USA)840475C
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)Avanti Polar Lipids (USA)850457C
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG)Avanti Polar Lipids (USA)840034C
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris)Carl Roth (Germany)4855
2-MercaptoethanolCarl Roth (Germany)4227
2-PropanolCarl Roth (Germany)9781
[3H]-dihydroalprenolol HydrochlorideAmerican Radiolabeled Chemicals (USA)ART0134
Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP)Merck (Germany)1409
Adenosine 5’-triphosphate (ATP)Sigma Aldrich (Germany)A9251
Alprenolol hydrochlorideMerck (Germany)A0360000
Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose®Sigma-Aldrich (Germany)Q1126
Autoclave Type GE 446EC-1Gettinge (Germany)
Bioreactor Type 884 124/1B.Braun (Germany)
CentrifugeSorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)
Cholic acidCarl Roth (Germany)8137
Coomassie Brilliant Blue R250Carl Roth (Germany)3862
Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasksSchott Duran (Germany)
Cytidine 5'-triphosphate disodium saltSigma-Aldrich (Germany)C1506
D-glucose monohydrateCarl Roth (Germany)6780
Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrateCarl Roth (Germany)6878
Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubingFisher Scientific (Germany)8700152
DithiothreitCarl Roth (Germany)6908
EthanolCarl Roth (Germany)K928
Folinic acid calcium salt hydrateSigma-Aldrich (Germany)47612
French pressure cell disruptorSLM; Amico Instruments (USA)
GlycerolCarl Roth (Germany)3783
Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP)Sigma-Aldrich (Germany)G8877
Hydrochloric AcidCarl Roth (Germany)K025
IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mLGE Life Sciences (Germany)GE17-5248
ImidazoleCarl Roth (Germany)3899
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)Carl Roth (Germany)2316
KanamycinCarl Roth (Germany)T832
L-AlanineCarl Roth (Germany)3076.1
L-ArginineCarl Roth (Germany)6908
L-AsparagineCarl Roth (Germany)HN23
L-Aspartic AcidCarl Roth (Germany)T202
L-CysteineCarl Roth (Germany)T203
L-Glutamic AcidCarl Roth (Germany)3774
L-GlutamineCarl Roth (Germany)3772
L-GlycineCarl Roth (Germany)3187
L-HistidineCarl Roth (Germany)3852
L-IsoleucineCarl Roth (Germany)3922
L-LeucineCarl Roth (Germany)1699
L-LysineCarl Roth (Germany)4207
L-MethionineCarl Roth (Germany)9359
L-ProlineCarl Roth (Germany)1713
L-PhenylalanineCarl Roth (Germany)1709
L-SerineCarl Roth (Germany)4682
L-ThreonineCarl Roth (Germany)1738
L-TryptophaneCarl Roth (Germany)7700
L-TyrosineCarl Roth (Germany)T207
MD100 dialysis unitsScienova (Germany)40077
N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES)Carl Roth (Germany)6763
n-dodecylphosphocholineAntrace (USA)F308S
PAGE chamber: Mini-Protean Tetra CellBiorad (Germany)
PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systemsBiorad (Germany)
PAGE gel power supply: Power Pac 3000Biorad (Germany)
Tryptone/peptone from caseineCarl Roth (Germany)6681
Peristaltic pump: ip-12Ismatec (Germany)
Phosphoenol pyruvate monopotassium saltSigma Aldrich (Germany)860077
Potassium dihydrogen phosphateCarl Roth (Germany)P018
Potassium acetateCarl Roth (Germany)4986
Potassium chlorideCarl Roth (Germany)6781
Pyruvate KinaseRoche (Germany)10109045001
Scintillation counter: Hidex 300 SLHidex (Finland)
SDS pelletsCarl Roth (Germany)8029
Sodium azideSigma-Aldrich (Germany)K305
Sodium chlorideCarl Roth (Germany)P029
Spectrophotometer NanodropPeqlab (Germany)
Spectrophotometer/fluorescence reader Spark®Tecan (Switzerland)
tRNA (E. coli)Roche (Germany)10109550001
Ultra sonificatorLabsonic U, B. Braun (Germany)
Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP)Sigma-Aldrich (Germany)U6625
Y-30 antifoamSigma-Aldrich (Germany)A6457
Yeast extractCarl Roth (Germany)2904

References

  1. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  2. Ritchie, T. K., et al. Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs. Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).
  3. Frauenfeld, J., et al. A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  4. Yang, Z., et al. Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains. Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).
  5. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  6. Junge, F., et al. Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins. New Biotechnology. 28 (3), (2011).
  7. Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).
  8. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  9. Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Membrane protein expression: no cells required. Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).
  10. Roos, C., et al. Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).
  11. Cappuccio, J. A., et al. Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles. Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).
  12. Patriarchi, T., et al. Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  13. Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).
  14. Rues, R. B., Dötsch, V., Bernhard, F. Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).
  15. Henrich, E., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 1-19 (2017).
  16. Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  17. Henrich, E., et al. Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway. Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).
  18. Peetz, O., et al. Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).
  19. Kigawa, T., et al. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).
  20. Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).
  21. Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs. BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).
  22. Rues, R. B., Dong, F., Dötsch, V., Bernhard, F. Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding. Methods. 147 (1), 73-83 (2018).
  23. Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., Dötsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer. Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).
  24. Matthies, D., et al. Cell-free expression and assembly of ATP synthase. Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).
  25. Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., Dötsch, V., Bernhard, F. Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins. Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).
  26. Haberstock, S., et al. A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems. Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).
  27. Falkinham, J. O., Clark, A. J. Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12. Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).
  28. Foshag, D., et al. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).
  29. Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).
  30. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  31. Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation. Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).
  32. Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein. European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).
  33. Henrich, E., et al. From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs. Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).
  34. Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

165L CFG

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved