막 단백질을 미리 형성된 나노디스크에 공동 번역 삽입

요약

사전 형성된 나노디스크에 공동 번역하여 삽입하면 세제와의 접촉 없이 정의된 지질 환경에서 무세포 합성된 막 단백질을 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜은 필수 시스템 구성 요소의 준비와 발현 효율성 및 샘플 품질을 개선하기 위한 중요한 파라미터를 설명합니다.

초록

무세포 발현 시스템을 사용하면 반응 환경을 맞춤 설계하여 막 단백질과 같은 복잡한 단백질의 기능적 접힘도 지원할 수 있습니다. 막 단백질을 나노 디스크로 공급되는 미리 형성되고 정의된 막으로 공동 번역 삽입 및 접는 실험 절차가 시연됩니다. 이 프로토콜은 세제가 전혀 없으며 하루 이내에 밀리그램의 정제된 샘플을 생성할 수 있습니다. 생성된 멤브레인 단백질/나노디스크 샘플은 결정화, 핵자기 공명 또는 전자 현미경과 같은 다양한 기능 연구 및 구조 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 무세포 용해물, 설계된 멤브레인이 있는 나노디스크, 중요 스톡 용액 및 2구획 무세포 발현 반응의 조립과 같은 기본 핵심 구성 요소의 준비에 대해 설명합니다. 막 단백질의 접힘 요구 사항은 매우 다양할 수 있으므로 이 프로토콜의 주요 초점은 중요한 염기성 반응 화합물, 나노디스크의 막 조성, 산화 환원 및 샤페론 환경 또는 DNA 주형 설계와 같은 샘플 품질에 중요한 파라미터 및 반응 단계의 조절입니다. 전체 과정은 프로테오르호돕신과 G-단백질 결합 수용체의 합성으로 입증됩니다.

서문

막 단백질(MPs)은 수성 환경에서의 불용성으로 인해 단백질 생산 연구에서 도전적인 표적입니다. 기존의 MP 생산 플랫폼은 대장균, 효모 또는 진핵 세포와 같은 세포 기반 시스템으로 구성됩니다. 합성된 재조합 MP는 세포막으로부터 추출되거나 봉^{입체로부터} 재접힌다1. 세제 가용화 후, MP는 체외 재구성 프로토콜을 확립하여 적절한 막 환경으로 옮겨질 수 있습니다. 소포 및 리포좀 외에도 MP는 나노 디스크² 또는 살리 프로³ 입자 형태의 평면 막으로 재구성되어 최근에 일상적인 기술이되었습니다. 그러나 이러한 모든 전략은 불안정화, 올리고머의 해리, 심지어 단백질 구조^{및 활성의} 손실을 초래할 수 있는 MP와의 세제 접촉을 의미합니다4. 따라서 최적의 세제 가용화 및 재구성 조건을 위한 스크리닝은 지루하고 시간이 많이 소요될 수 있습니다⁵.

무세포(CF) 시스템의 개방 특성으로 인해 발현 반응이 정의된 지질 조성으로 미리 형성된 멤브레인에 직접 공급될 수 있습니다. 이 지질 기반 발현 모드(L-CF)에서, 합성된 MP는 제공된 이중층(^6,7)에 공동 병진적으로 삽입할 기회를 갖는다(도 1). 평면 지질 이중층 디스크(⁸)를 둘러싸는 막 스캐폴드 단백질(MSP)로 구성된 나노디스크는 이러한 전략^{9, 10}에 특히 적합한 것으로 보인다. 나노디스크는 다양한 지질로 시험관 내에서 일상적으로 조립할 수 있고, 매우 안정적이며, 스톡은 최대 1mM까지 농축될 수 있다. 그러나 대장균에서의 MSP 발현 및 정제가 필요합니다. 대안적인 전략으로서, MSP는 리포좀^11,12,13과 함께 공급된 CF 반응에서 표적 MP와 함께 발현될 수 있다. MSP와 MP 모두에 대한 DNA 템플릿이 반응에 추가되고 발현 시 MP/나노디스크가 형성될 수 있습니다. MSP 생산은 피할 수 있지만 공동 발현 전략은 최종 DNA 주형 농도를 신중하게 미세 조정해야 하며 샘플 생산 효율성의 더 높은 변동을 기대할 수 있습니다.

미리 형성된 나노 디스크의 막에 MP의 공동 번역 삽입은 트랜스 로콘 기계 및 신호 서열^13,14,15,16과 독립적 인 비 생리 학적 및 여전히 크게 알려지지 않은 메커니즘입니다. 삽입 효율의 주요 결정 인자는 막 단백질의 유형뿐만 아니라 제공된 막의 지질 조성이며, 음전하를 띤 지질에 대한 빈번한 선호^15,17. 나노디스크 막이 크기가 상대적으로 제한되어 있기 때문에, MP 삽입시 상당한 양의 지질이 방출된다(¹⁸). 나노디스크 크기의 변화는 더 높은 올리고머 MP 복합체(^15,18)의 삽입 및 튜닝을 가능하게 한다. 그 중에서도 이온 채널 KcsA, 이온 펌프 프로테오르호돕신(PR) 및 다제 수송체 EmrE^15,18에 대해 호모올리고머 복합체의 올바른 조립이 나타났습니다. MP는 상대적으로 동일한 주파수로 양쪽에서 대칭 나노 디스크 막으로 들어갈 가능성이 높습니다. 따라서 하나의 나노 디스크에 삽입 된 상이한 단량체 또는 올리고머는 반대 배향을 가질 수 있음을 고려해야한다. 그러나, 배향의 편향은 PR 헥사머 및 KcsA 사량체¹⁸의 형성에 대해 보고된 바와 같은 협력적 삽입 메커니즘에 의해 야기될 수 있다. MP 방향의 추가 편향은 아마도 나노 디스크 멤브레인의 가장자리에 삽입 된 MP의 방향 스위치로 인해 발생할 수 있습니다.

E. coli 균주로부터 CF 용해물의 생산은 신뢰할 수 있는 일상적인 기술이며 거의 모든 생화학 실험실(^19,20)에서 수행될 수 있습니다. 이황화 다리 형성 외에도 MP가 대장균 용해물을 사용하여 합성되는 경우 대부분의 다른 번역 후 변형이 없다는 점을 고려해야합니다. 이것은 구조 연구를 위해 더 균질한 샘플을 생성할 수 있지만 개별 MP 표적의 기능에 대한 잠재적 영향을 배제해야 할 수도 있습니다. 그러나, E. coli CF 용해물에서 G- 단백질 결합 수용체 (GPCR) 14,21,22^, 진핵 수송 체 23 또는 큰 이종 이성질체 어셈블리 ²⁴의 고품질 샘플의 효율적인 생산은 복잡한 표적에 대한 적합성을 나타냅니다. 시료의 분취 스케일 양(≈ 1 mg/mL)은 반응 혼합물(RM)과 공급 혼합물(FM) 구획으로 구성된 2구획 연속 교환 무세포(CECF) 구성으로 얻을 수 있습니다. FM 부피는 RM 부피의 15 내지 20배를 초과하고, 저분자량 에너지 화합물 및 전구체(¹⁹)의 저장소를 제공한다. 따라서 발현 반응은 수 시간 동안 연장되고 MP 표적의 최종 수율이 증가합니다. RM 및 FM 구획은 10-14kDa 컷오프가있는 투석막으로 분리됩니다. 두 구획에는 CECF 반응 용기의 특수 설계가 필요합니다(그림 1). RM 용기로서의 상업용 투석 카세트와 FM을 보유하는 맞춤형 플렉시 유리 용기가 적합한 예입니다. MP 수율은 RM:FM 비율을 수정하거나 일정 기간 배양 후 FM을 교환하여 추가로 조작할 수 있습니다.

MP의 수율과 품질은 종종 반응 파라미터의 집중적인 최적화를 필요로 합니다. CF 발현의 중요한 장점은 MP의 개별 요구 사항에 따라 거의 모든 화합물을 수정하고 미세 조정할 수 있다는 것입니다. 간단한 전략은 먼저 기본 생산 프로토콜을 수립하여 MP의 수율을 개선하는 데 집중한 다음 반응 및 접힘 조건을 미세 조정하여 MP 품질을 최적화하는 것입니다. CF 용해물에 생리학적 과정이 없고 복잡성이 감소하면^MP25의 효율적인 생산을 위한 높은 성공률이 발생합니다. DNA 주형 설계 및^Mg2+ 이온 농도의 최적화를 위한 통상적인 고려사항은 대부분의 경우 만족스러운 수율(²⁶)을 얻기에 충분하다. 발현 모드에 따라, MP 품질의 최적화는 더 다양한 파라미터가 스크리닝될 필요가 있기 때문에(^14,17,22) 시간이 많이 소요될 수 있다.

설명된 CF 발현 플랫폼을 확립하려면 대장균 CF 용해물(i), T7 RNA 중합효소(ii), 나노디스크(iii) 및 염기성 CECF 반응 화합물(iv)의 생산에 프로토콜이 필요합니다(그림 1). E. coli K12 균주 A19²⁷ 또는 BL21 유도체는 효율적인 S30(30,000 x g에서 원심분리) 용해물의 제조에 자주 사용됩니다. S30 용해물 외에, 다른 g-force(예: S12)에서 원심분리된 상응하는 용해물이 사용될 수 있다. 용해물은 발현 효율과 프로테옴 복잡성이 다릅니다. 기재된 프로토콜에 의해 제조된 S30 용해물의 프로테옴은^{도 28}에서 상세히 연구되었다. S30 프로테옴에는 여전히 이온 채널의 발현 및 분석시 배경 문제를 일으킬 수있는 일부 잔류 외막 단백질이 포함되어 있습니다. 이러한 표적의 경우 S80-S100 용해물을 사용하는 것이 좋습니다. 용해물 준비 중 유용한 변형은 세포의 중간 로그 성장 단계에서 열 충격과 에탄올 공급을 결합하여 SOS 반응을 유도하는 것입니다. 생성된 HS30 용해물은 샤페론이 풍부하고, 개선된 MP 폴딩(²²)을 위해 S30 용해물과의 블렌드에 사용될 수 있다. 대장균 용해물에서의 CF 발현은 T7 RNA 중합효소(T7RNAP)에 의해 제어되는 프로모터를 포함하는 DNA 주형과의 결합된 전사/번역 과정으로 작동됩니다. 효소는 pAR1219 플라스미드²⁹를 운반하는 BL21(DE3) 스타 세포에서 효율적으로 생산될 수 있습니다.

MSP1E3D1의 두 사본은 직경이 10-12 nm 인 하나의 나노 디스크로 조립되지만 아래에 설명 된 프로토콜은 다른 MSP 유도체에도 작동 할 수 있습니다. 그러나, MSP1E3D1로 형성된 것보다 큰 나노디스크는 덜 안정한 경향이 있는 반면, MSP1과 같은 MSP 유도체로 형성된 더 작은 나노디스크는 더 큰 MPs 또는 MP 복합체를 수용하지 못할 수 있다. MSP1E3D1 나노디스크는 매우 다양한 지질 또는 지질 혼합물로 시험관내에서 조립할 수 있습니다. 예비 성형 된 나노 디스크는 일반적으로 -80 ° C에서 > 1 년 동안 안정하지만 안정성은 지질 성분에 따라 다를 수 있습니다. MP의 접힘 및 안정성에 대한 지질 효과를 스크리닝하려면 대표적인 다양한 지질/지질 혼합물로 조립된 포괄적인 나노디스크 세트를 준비해야 합니다. 다음의 지질은 좋은 출발 선택을 제공할 수 있다: 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-락-글리세롤) (DMPG), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-락-(1-글리세롤) (DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-glycerol) (POPG) 및 1-팔미토일-2-올레오일-글리세로-3-포스포콜린 (POPC).

3mL CECF 반응의 제조를 위한 프로토콜이 기재되어 있다. 1:1 비율로 추가 확장 또는 축소가 가능합니다. 2구획 CECF 구성의 경우 모든 화합물을 포함하는 RM과 저분자량 화합물만 포함하는 FM을 준비해야 합니다. 10-14kDa MWCO의 상업용 3mL 투석 장치를 RM 용기로 사용할 수 있으며, 이를 FM을 고정하는 맞춤형 플렉시 유리 용기에 넣을 수 있습니다(그림 1D)³⁰. RM:FM의 비율은 1:20이므로 3mL RM에 대해 60mL의 FM을 준비해야 합니다. 여러 성분의 품질, 농도 또는 유형은 합성된 MP의 최종 수율 및/또는 품질에 중요할 수 있습니다(표 1). DNA 주형은 공개된 가이드라인에 따라 제조되어야 하며, 표적의 판독 프레임의 코돈 최적화는 생성물 수율을 더욱 크게 향상시킬 수 있다(²⁶). 분취 규모 CECF 반응의 경우, PR 생산을 위한 확립된 프로토콜이 기재되어 있다. 새로운 MP에 대한 발현 프로토콜을 확립하려면 일반적으로 수율과 품질을 개선하기 위해 특정 화합물(표 1)의 최적화 스크린을 수행해야 합니다. Mg²⁺ 이온의 경우, 상이한 DNA 주형에 대해 유의한 변화를 자주 보여주는 잘 집중된 최적 농도가 존재한다. T7RNAP 또는 S30 용해물의 새로운 배치와 같은 다른 CF 반응 화합물은 최적의^Mg2+ 농도를 추가로 이동시킬 수 있습니다. 예로서, 14-24 mM 농도의 범위 내에서 및 2 mM의 단계에서의 전형적인^Mg2+ 화가 설명된다. 각 농도는 중복 및 분석 규모 CECF 반응으로 스크리닝됩니다. CECF 반응 용기로서, RM을 보유하는 맞춤형 Mini-CECF 플렉시글라스 용기(³⁰ )가 FM을 보유하는 표준 24웰 마이크로플레이트와 조합하여 사용된다(도 1B). 대안적으로, 96-딥 웰 마이크로플레이트 또는 적절한 셋업의 다른 상용 투석기 장치와 조합된 상업용 투석 카트리지가 사용될 수 있다(도 1C).

프로토콜

1. S30 용해물의 제조

1. 1일차: LB 한천 플레이트의 글리세롤 스톡에서 세포를 추출하고 37 ° C에서 밤새 배양합니다.
2. 2일차: 한천 플레이트의 세포에 LB 배지 200mL를 접종하고 37°C에서 12-14시간 동안 배양합니다.
3. 3 일째 : 100 mL의 사전 배양 (1 : 100 mL의 15 L 교반 탱크 반응기에서 37 °C로 템퍼링 된 멸균 YPTG 배지 (10 g / L 효모 추출물, 16 g / L 트립톤, 5 g / L NaCl, 19.8 g / L 포도당, 4.4 mM KH_2PO4, 8 mM K₂HPO₄)를 접종한다. 37 ° C, 500 rpm 및 높은 통기 (분당 ~ 3 풍량)에서 배양하십시오. 과도한 거품을 방지하려면 멸균 소포제를 첨가하십시오.
4. 일정한 시간 간격으로 600nm에서 광학 밀도(OD)를 측정합니다. 약 2시간 후에 배양은 로그 단계에 들어갑니다.
5. HS30 용해물에 대한 수정 : 세포가 중간 로그 단계 (OD600 ≈ 3.6-4.2)에있을 때 배양 배지에 에탄올 300mL를 넣고 42 ° C, 500rpm 및 높은 통기 (분당 약 3 풍량)에서 45 분 동안 배양을 진행합니다. 이어서, 단계 1.6에 기재된 바와 같이 세포 배양물의 냉각 및 수확을 진행한다. 표준 S30 용해물 생산의 경우이 단계를 건너 뛰고 1.6 단계로 진행하십시오.
6. 셀이 중간 로그 단계 (OD600 ≈ 3.6-4.2)에있을 때 발효기를 < 30 분 이내에 20 ° C 이하로 냉각시킵니다. 최종 OD600은 약 4.5-5.5여야 합니다. 세포를 4°C에서 20분 동안 4,500 x g에서 수확하고 상청액을 버린다. 다음 단계 동안 세포를 4°C로 유지하십시오.
   알림: 냉각 중에 과도한 거품이 발생할 수 있습니다. 이 경우 소포제를 추가하거나 교반 속도를 줄이거 나 생물 반응기의 공기 흐름을 줄이십시오.
7. 주걱을 사용하여 300mL의 S30-A 완충액(10mM Tris-HCl, pH 8.2, 14mM Mg(OAc)2, 60mM KCl, 6mM ₂-메르캅토에탄올)에 세포를 완전히 현탁시킨 후 균질해질 때까지 현탁액을 위아래로 피펫팅합니다. 4°C에서 10분 동안 8,000 x g 로 원심분리합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.
   주의 : 2- 메르 캅토 에탄올은 독성이 있습니다. 피부 나 호흡기와의 접촉을 피하십시오. 가능하면 후드 아래에서 작업하십시오. 마지막 세척 단계 전에 빈 원심분리기 비커의 무게를 잰다. 원심분리 후 습식 셀 펠릿의 무게를 측정하고 1.8단계를 진행하거나 추가 사용이 있을 때까지 펠릿을 보관하십시오.
   참고: 습식 세포 펠릿의 무게는 1L 생물반응기 배양물당 5-7g입니다. 이 시점에서 프로토콜은 일시 중지될 수 있고 펠릿은 액체 질소에서 동결되고 -80°C에서 4-8주 동안 저장될 수 있습니다.
8. S30-B 완충액(10 mM Tris-HCl, pH 8.2, 14 mM Mg(OAc)₂, 60 mM KOAc, 1 mM DTT, cOmplete 프로테아제 억제제 1정 1정)의 1.1 부피(1 g = 1 mL)에 세포를 완전히 현탁시킵니다. 현탁액을 사전 냉각된 프렌치 프레스 압력 셀에 채우고 1,000psig에서 세포를 파쇄합니다. 프랑스 언론을 통해 세포를 한 번 통과시킵니다.
9. 용해물을 30,000 x g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다. 상청액을 새로운 튜브로 옮기고 원심분리 단계를 반복합니다.
   알림: 첫 번째 원심분리 후 펠릿 위에 느슨하고 끈적끈적한 층이 존재할 수 있으며, 이는 상청액과 함께 옮겨져서는 안 됩니다.
10. 불안정한 용해물 성분을 제거하고 리보솜에서 mRNA를 방출하기 위해 높은 염분 및 열 단계를 적용합니다. 용해물을 0.4 M NaCl로 조정하고 수조에서 45분 동안 42°C에서 배양한다.
    알림: 이 단계는 상당한 침전물 형성을 유발합니다. 때때로 배양하는 동안 튜브를 뒤집거나 뒤집습니다.
11. 탁한 현탁액(보통 50-80mL)을 10-14kDa 컷오프가 있는 투석관으로 옮기고 5L S30-C 완충액(10mM Tris-HCl, pH 8.2, 14mM Mg(OAc)₂, 60mM KOAc, 0.5mM DTT)에 대해 투석합니다. 2-3 시간 후에 S30-C 투석 완충액을 교환하고 12-14 시간 동안 투석하십시오.
12. 4 일째 : 투석된 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고 30,000 x g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다. 상청액(S30 용해물)을 신선한 50mL 튜브에 옮기고 부드럽게 혼합합니다. 용해물의 단백질 농도는 약 30-40 mg / mL이어야합니다. 분취량(예: 0.5mL, 1mL)을 액체 질소에 충격 동결하고 -80°C에서 보관합니다. 분취량은 > 1년 동안 안정적입니다.

2. T7 RNA 중합효소의 발현 및 정제

1. 1일차: 100μg/mL 암피실린이 포함된 200mL LB 배지에 새로 플레이팅된 BL21(DE3) Star x pAR1219 세포를 접종하고 37°C 및 180rpm에서 12-16시간 동안 배양합니다.
2. 2일차: 2L 배플 플라스크에 1L 훌륭한 국물(12g/L 트립톤, 24g/L 효모 추출물, 4mL/L 글리세롤)을 10mL의 전배양액과 함께 접종하고 37°C 및 180rpm 교반에서 배양합니다. 시작 OD600은 약 0.1이어야 합니다.
3. OD600이 0.6-0.9에 도달하면 IPTG를 최종 농도 1mM에 추가하여 T7RNAP 발현을 유도하고 5시간 동안 배양을 계속합니다.
4. 4°C에서 20분 동안 4,500 x g 에서 원심분리하여 세포를 수확합니다. 액체 질소에 세포를 동결시키고 -80 °C에서 보관하십시오.
   참고: 여기에서 프로토콜이 일시 중지될 수 있습니다.
5. 3 일째 : 동결된 세포 펠릿에 30mL의 얼음처럼 차가운 현탁액 완충액(30mM Tris-HCl, cOmplete 프로테아제 억제제 1정 포함 pH 8.0)을 추가하고 펠릿을 실온의 수조에서 해동합니다. 그런 다음 균질해질 때까지 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 현탁시킵니다.
6. 이전 섹션에서 설명한 대로 프렌치 프레스를 사용하여 세포 파괴를 수행하거나 제조업체의 권장 사항에 따라 초음파 처리 장치를 사용하십시오. 이어서, 4°C에서 30분 동안 20,000 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 새로운 튜브로 옮긴다.
7. 게놈 DNA를 침전시키려면 최종 농도가 3%(w/v)에 도달할 때까지 상청액에 스트렙토마이신 설페이트를 천천히 부드럽게 교반하여 추가합니다. 부드러운 교반하에 4 ° C에서 5-10 분 동안 배양하십시오. 20,000 x g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다.
8. 0.45μm 필터로 상청액을 여과하고 4mL/분의 유속으로 연동 펌프를 사용하여 2CV 평형 완충액(30mM Tris-HCl, pH 8.0, 10mM EDTA, 50mM NaCl, 5% 글리세롤 및 10mM 2-메르캅토에탄올)으로 평형화된 컬럼 부피(CV)가 40mL인 Q-세파로즈 컬럼에 로드합니다. 그런 다음 컬럼을 UV 검출기에 연결하고 280nm의 UV 신호가 안정적인 기준선에 도달할 때까지 평형 버퍼로 용리를 계속합니다.
9. 3mL/분의 유속에서 CV당 50mM에서 500mM NaCl까지의 구배로 T7RNAP를 용리합니다. 1mL 분획을 수집하고 각 분획의 10μL를 2 x SDS 시료 완충액과 혼합하여 SDS-PAGE 분석용 시료를 준비합니다. SDS-PAGE를 실행하고 쿠마시 블루 R로 겔을 염색합니다. T7RNAP는 수많은 추가 불순물 밴드와 함께 약 90kDa에서 두드러진 밴드로 나타나야 합니다.
10. T7RNAP를 함유하는 풀 분획을 투석 완충액 (10 mM K2HPO4/KH2PO4, pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT, 5% (w/v) 글리세롤) 중에서 12-14 kDa MWCO를 갖는 막을 사용하여 투석한다.
11. 4 일째 : T7RNAP 용액을 수집하고 12-14 MWCO의 필터 장치를 사용하여 최종 농도 3-10 mg / mL까지 농축합니다. T7RNAP는 농축 중에 침전되기 시작할 수 있습니다. 샘플의 탁도가 발생하는 즉시 농축을 중지하십시오. 글리세롤을 최종 농도 50%(w/v)까지 넣고 부드럽게 섞습니다. 0.5-1 mL 분취량을 충격 동결하고 -80 °C에서 보관합니다. 작동 T7RNAP 분취량은 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
    알림: 20L 발효에서 20,000-40,000 단위의 5mg/mL 부분 정제 T7RNAP의 약 40-40mL를 얻어야 합니다. 각 T7RNAP 배치의 최적량을 테스트하려면 준비된 T7RNAP 샘플 0.02mg/mL-0.1mg/mL를 포함하는 녹색 형광 단백질(GFP)의 CF 발현 반응을 수행해야 합니다.

3. MSP1E3D1의 발현 및 정제

1. 1일차: 표준 열 충격 변환 또는 전기 천공 프로토콜을 사용하여 pET28(a)-MSP1E3D1 벡터³¹로 대장균 BL21(DE3) 스타 셀을 변환합니다. 30μg/mL 카나마이신을 함유한 LB 한천에서 형질전환된 세포를 줄무늬 또는 플레이트에 넣고 37°C에서 12-16시간 동안 배양합니다.
2. 2일차: 한천 플레이트에서 선택한 단일 콜로니와 함께 0.5%(w/v) 포도당과 30μg/mL 카나마이신이 보충된 LB 배지 200mL를 접종하고 37°C에서 180rpm으로 12-16시간 동안 배양합니다.
3. 3 일째 : 교반 탱크 생물 반응기에서 0.5 % (w / v) 포도당과 30μg / mL 카나마이신이 보충 된 100 L LB 배지에 100 mL의 사전 배양물을 접종합니다. 37 °C, 500 rpm에서 발효를 수행하고 분당 약 3 개의 생물 반응기 부피를 폭기합니다. 과도한 거품이 발생하는 경우 소포제를 첨가하십시오.
   알림: 발효기 대신 배플 쉐이킹 플라스크를 사용할 수 있습니다.
4. 6.5-7.5의 OD600에서, IPTG를 1 mM의 최종 농도로 첨가하고, 37°C에서 1 h 동안 인큐베이션을 계속한다. 4°C에서 20분 동안 4,500 x g 에서 원심분리하여 세포를 수확합니다. 200mL의 0.9%(w/v) NaCl로 셀 펠릿을 세척하고 8,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 다시 원심분리합니다. 상청액을 버리고 주걱을 사용하여 세포를 50mL 튜브로 옮깁니다. 예상되는 습식 펠렛 중량은 생물 반응기 배양 L 당 8-12g입니다. 액체 질소에 충격 동결 세포 펠릿을 넣고 추가 사용이 될 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.
   참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
5. 4 일째 : 정제를 위해, 세포 펠릿을 RT의 수조에서 해동시킨다. 세포를 MSP-A 완충액(40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 1%(w/v) Triton X-100, 50 mL 세포 현탁액당 c0mplete 프로테아제 억제제 칵테일 1정)에 현탁시켜 30-40%(w/v) 세포 현탁액을 수득한다.
6. 초음파 처리 또는 프렌치 프레스 및 원심분리기를 사용하여 4°C에서 30분 동안 30,000 x g 로 세포를 파쇄합니다. 상청액을 새로운 튜브로 옮기고 0.45μm 필터를 통해 여과합니다. 연동 펌프를 사용하여 5CV의 MSP-B 완충액(40mM Tris-HCl, pH 8.0, 300mM NaCl, 1%(w/v) Triton X-100)으로 평형화된^Ni2+ 로딩된 니트릴로트리아세트산 컬럼(CV > 15mL) 상에 여과액을 도포한다.
   알림: 여과를 용이하게하기 위해 상청액을 1 분 더 초음파 처리하여 큰 DNA 단편을 분해 할 수 있습니다.
7. 샘플 로딩 후, 컬럼을 5 CV MSP-B, 5 CV MSP-C (40 mM 트리스-HCl, pH 8.9, 300 mM NaCl, 50 mM 콜산), 5 CV MSP-D (40 mM 트리스-HCl, pH 8.9, 300 mM NaCl), 5 CV msp-E (40 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl) 및 5 CV MSP-F (40 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 50 mM 이미다졸).
   참고: MSP-C 완충액의 콜산은 MSP에 부착된 지질을 제거하는 데 중요합니다. 콜산은 낮은 pH 값에서 완전히 용해되지 않습니다. 따라서 MSP-C 및 MSP-D에서 pH 값을 8.9로 조정해야 합니다. pH가 낮으면 잔류 콜산이 침전되어 컬럼이 막히거나 손상될 수 있으므로 MSP-D 완충액으로 컬럼을 세척하는 것이 중요합니다.
8. MSP-G (40 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 300 mM 이미다졸)로 MSP를 용리시킨다. 1mL의 분획을 수집하고 280nm에서 UV 흡수를 모니터링합니다. 용리 피크의 분획을 수집하고 풀링합니다.
9. 풀링된 MSP 분획을 12-14kDa MWCO 투석막 튜브로 옮기고 5L의 MSP-H(40mM Tris-HCl, pH 8.0, 300mM NaCl, 10%(w/v) 글리세롤)에 대해 4°C에서 2-3시간 동안 투석합니다. 새로운 5L MSP-H 완충액으로 변경하고 4°C에서 12-16시간 더 투석합니다.
10. 5 일째 : MSP 용액을 원심분리 튜브에 옮기고 18,000 x g에서 4°C에서 30분 동안 원심분리하여 침전물을 제거합니다. 상청액을 새로운 튜브로 옮기고 4 ° C에서 12-14 kDa MWCO의 한외 여과 장치를 사용하여 200-800 μM으로 농축합니다. UV/VIS 측정 장치를 사용하여 농도를 측정합니다. 농도 계산을 위해 27.31 M-1 ^cm-1의 흡광 계수와 31.96 kDa의 분자량을 사용하십시오.
    참고: 바이오리액터에서의 발현은 일반적으로 L 배양물당 15-30mg의 MSP1E3D1을 산출합니다.
11. 농축된 MSP 용액의 분취량을 액체 질소에 충격-동결시키고 -80°C에서 저장한다.

4. MSP1E3D1 나노 디스크의 조립

1. 1일차: 100mM 콜레이트 나트륨에 50mM 지질 스톡 (DMPG, DOPG, POPG DMPC, DOPC 또는 POPC) 1-2mL를 준비합니다. 당일 사용하지 않을 경우 -20°C에서 보관하십시오.
   알림: 지질 용액은 깨끗해야합니다. 용액이 투명하지 않으면 나트륨 콜레이트 농도가 150mM로 증가 할 수 있습니다.
2. MSP1E3D1 용액을 지질 용액과 혼합합니다. 도데실 포스포콜린(DPC)을 최종 농도 0.1%(w/v)로 추가합니다. 조립 반응은 투석 카세트(10kDa MWCO)의 전형적인 부피에 해당하는 3mL(표 2) 또는 12mL의 최종 부피로 조정될 수 있다. 부드러운 교반 하에 21°C에서 1시간 동안 조립체 반응을 배양합니다.
   참고: 각 지질에 대해 균일한 나노디스크 준비를 보장하기 위해 특정 MSP1E3D1:지질 비율을 사용해야 합니다(표 2). 새로운 지질 또는 지질 혼합물의 경우, 최적의 비율은 파일럿 실험 및 크기 배제 크로마토그래피 분석⁽¹⁴)으로 결정되어야 한다.
3. 투석 카세트의 막을 디스크 형성(DF) 완충액(10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl)으로 미리 습윤시켰다. 조립 혼합물을 주사기로 투석 카세트로 옮깁니다. 잠재적 인 기포는 주사기를 사용하여 흡인하여 제거 할 수 있습니다.
4. 1-4 일 : 교반 막대를 사용하여 교반 하에 RT에서 10-20시간 동안 3 x 5 L DF 완충액에 대해 투석합니다. 그런 다음 조립 혼합물을 투석 카세트에서 DF 버퍼로 평형화된 10kDa MWCO의 원심 필터 장치로 옮깁니다. 4 °C에서 4,000 x g 으로 농축합니다.
   알림: 탁한 투석 혼합물은 MSP:지질의 잘못된 화학량론적 비율을 나타낼 수 있습니다. 침전물은 샘플을 농축하기 전에 4 ° C에서 20 분 동안 18,000 x g 에서 제거해야합니다. 시료 농축 중 침전을 방지하려면 데드스톱이 큰 한외여과 장치를 사용하십시오.
5. 조립된 나노디스크를 최소 300μM의 농도로 농축합니다. UV/VIS 리더를 사용하여 농도를 측정합니다. 하나의 나노디스크가 두 개의 MSP1E3D1 분자에 의해 형성되므로 정확한 양의 나노디스크를 결정하기 위해 MSP의 농도를 2로 나누어야 한다고 가정하십시오.
   참고: 설명된 설정(표 2)은 0.6-1mL의 300μM 나노디스크 용액을 생성합니다.
6. 농축된 나노디스크 제제를 18,000 x g 에서 4°C에서 20분 동안 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 이어서, 상청액 50 μL 분취량을 액체 질소에서 충격 동결하고 -80°C에서 저장한다.
   참고: 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 나노디스크 형성의 성공을 평가하는 것이 좋습니다. 샘플은 단분산이어야 하며 적은 양의 응집체만 포함해야 합니다. 응집체는 설정에서 지질의 양이 너무 높다는 것을 나타냅니다. 참고로 정제된 MSP1E3D1을 사용할 수 있습니다. 나노디스크 제제가 기준 MSP1E3D1 피크의 높이에서 피크를 나타내는 경우, 선택된 지질 대 MSP1E3D1 비율이 너무 낮았다.

5. 분취 저울 3mL CECF 반응 설정

1. 1일차: 나열된 대로 필요한 모든 스톡 솔루션을 준비합니다(표 3). 주식은 -20°C에서 보관하고 실온에서 해동한다. 해동 후와 피펫팅 전에 모든 스톡을 철저히 혼합하십시오. 모든 주식에 필요한 부피를 계산하고 피펫팅 계획을 세웁니다(표 4). 고분자량 화합물은 RM에만 첨가됩니다. 저분자량 화합물의 경우 RM 및 FM을 위한 결합된 3 x 마스터믹스를 제조할 수 있습니다.
   알림: 혼합 혼합물의 최종 부피는 혼합 중 부피 손실로 인해 계산된 것보다 적을 수 있습니다. 이는 체적 손실을 보상하기 위해 2-5%의 초과 부피를 추가하여 피할 수 있습니다.
2. 3 mL 투석 카세트의 막을 100 mM 트리스-아세테이트, pH 8.0에서 평형화시킨다. 초과 버퍼를 제거하십시오.
3. 주사기를 사용하여 RM을 투석 카세트로 옮깁니다. 주사기로 흡인하여 RM 구획의 과도한 공기를 제거하십시오. 투석 카세트를 투석실에 넣습니다.
4. 투석실에 FM 60mL를 채웁니다. 챔버에 뚜껑을 덮고 나사를 조여 고정합니다. 챔버를 200 rpm에서 30°C에서 12-16 h 동안 인큐베이션한다.
   알림: 교반하는 동안 챔버가 수직 위치에 있는지 확인하십시오., 그렇지 않으면 저분자 화합물의 교환이 방해받을 것입니다.
5. 2일차: 주사기를 사용하여 투석실에서 RM을 흡인합니다. RM을 새로운 튜브로 옮기고 4°C에서 16,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 침전물을 제거합니다. 상청액을 신선한 튜브로 옮깁니다. 이제 상청액의 단백질을 추가로 분석할 수 있습니다.
   알림: 어떤 경우에는 원심분리 후 펠릿이 존재합니다. 이는 합성된 MP를 용해성으로 유지하기 위해 분석된 나노디스크 또는 반응 화합물의 적합성에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있습니다. 따라서 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯을 사용하거나 펠릿 크기의 육안 평가를 통해 침전물에 잠재적으로 존재하는 표적의 양을 분석하는 것이 좋습니다.

6. Mg²⁺ 이온 스크리닝을 위한 분석 스케일 60 μL CECF 반응 설정

1. 1일차: 각각의 3x 마스터 믹스의 모든 성분을 혼합하고 RM에 60μL, FM에 825μL를 분배합니다. FM을 H₂O로 채우고 와동으로 FM을 혼합합니다. FM을 24웰 마이크로플레이트의 3웰로 옮깁니다(표 5).
   참고: 맞춤형 Mini-CECF 용기에 접근할 수 없기 때문에 표 5 의 부피는 96개의 딥웰(2mL) 플레이트에서 FM 부피가 1.7mL인 투석 카트리지(10-14kDa MWCO, RM: 100μL)에서 수행된 반응에 대해 계산됩니다(그림 1).
2. 10-14 kDa MWCO의 재생 셀룰로오스 투석관을 약 25 x 20 mm 크기의 조각으로 자르고 0.05 % (w / v) 나트륨 아 지드화물로 H₂O에 보관하십시오.
   주의 : 아 지드 화 나트륨은 매우 독성이 있습니다. 피부 나 점막과의 접촉을 피하십시오. 아지드화 나트륨은 금속과 반응하여 폭발성 금속 아자이드를 형성할 수 있으므로 금속 용기를 사용하지 마십시오.
3. Mini-CECF 용기 조립 전에, 티슈로 투석막으로부터 과도한_H2O를 제거한다. 각 용기에 하나의 멤브레인 조각을 놓고 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 링으로 멤브레인을 고정하십시오.
4. Mini-CECF 용기를 825μL의 FM이 있는 24웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. Mini-CECF 용기의 투석막 아래에 기포가 생기지 않도록 합니다.
5. 설명된 대로 RM에 고분자 성분을 추가하고(표 5) 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 반응 용기에 60 μL를 첨가한다. 점성 용액을 옮기는 동안 기포를 피하십시오.
6. 밀봉 열가소성 필름 2 장의 8 x 10cm 시트를 자르고 반응 용기가 들어있는 24 웰 플레이트 주위를 감 쌉니다. 이것은 반응 혼합물로부터의 증발을 감소시킬 것이다. 이제 세포 배양 접시의 뚜껑을 접시에 놓고 테이프로 고정하십시오. 플레이트를 30°C 및 200rpm 교반에서 12-16시간 동안 인큐베이션한다.
7. 2일차: Mini-CECF 용기의 피펫 팁으로 투석막을 관통하여 반응 혼합물을 수확하고 RM을 흡인합니다. RM을 새 튜브로 옮기고 4°C에서 16,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 침전물을 제거합니다. 상청액을 신선한 튜브로 옮깁니다. 이제 상청액의 단백질을 추가로 분석할 수 있습니다.
   알림: 어떤 경우에는 원심분리 후 펠릿이 존재합니다. 이는 합성된 MP를 용해성으로 유지하기 위해 분석된 나노디스크 또는 다른 반응 화합물의 적합성에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있습니다. 따라서 침전물에 잠재적으로 존재하는 표적의 양을 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯, 또는 펠릿 크기의 육안 평가에 의해 분석하는 것이 바람직하다.

결과

미세 조정 반응 화합물이 합성된 MP의 최종 수율 또는 품질에 미치는 영향이 예시됩니다. 빈번한 일상적인 접근법은 시스템 효율의 편리한 모니터로서 녹색 형광 단백질 (GFP)의 발현에 의해 CF 반응에서 최적의 Mg²⁺ 농도를 조정하는 것입니다. 예를 들어, GFP는 14와 24 mM 사이의 Mg 2+ 농도에서^pET-21a(+) 벡터로부터 합성되었습니다(그림 2). SDS-PAGE 분석은 20 mM에서 최...

토론

CF 발현을 최적화하기 위한 설정 및 전략과 기능성 MP를 나노디스크에 공동 번역하여 삽입하는 방법이 설명되어 있습니다. 필요한 장비는 바이오리액터, 프렌치 프레스 장치 또는 이와 유사한 장치, UV/VIS 및 형광 판독기, 2구획 구성 설정에 적합한 CF 반응 용기 및 온도 제어 인큐베이터로 구성됩니다. 추가 표준 장비로는 대장균 세포 수확을 위한 원심분리기와 S30 용해물 준비를 위해 최소 30,...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG)	Avanti Polar Lipids (USA)	840445P
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids (USA)	850345C
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC)	Avanti Polar Lipids (USA)	850375C
1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG)	Avanti Polar Lipids (USA)	840475C
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids (USA)	850457C
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG)	Avanti Polar Lipids (USA)	840034C
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris)	Carl Roth (Germany)	4855
2-Mercaptoethanol	Carl Roth (Germany)	4227
2-Propanol	Carl Roth (Germany)	9781
[3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride	American Radiolabeled Chemicals (USA)	ART0134
Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP)	Merck (Germany)	1409
Adenosine 5’-triphosphate (ATP)	Sigma Aldrich (Germany)	A9251
Alprenolol hydrochloride	Merck (Germany)	A0360000
Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose®	Sigma-Aldrich (Germany)	Q1126
Autoclave Type GE 446EC-1	Gettinge (Germany)
Bioreactor Type 884 124/1	B.Braun (Germany)
Centrifuge	Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)
Cholic acid	Carl Roth (Germany)	8137
Coomassie Brilliant Blue R250	Carl Roth (Germany)	3862
Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks	Schott Duran (Germany)
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt	Sigma-Aldrich (Germany)	C1506
D-glucose monohydrate	Carl Roth (Germany)	6780
Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate	Carl Roth (Germany)	6878
Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing	Fisher Scientific (Germany)	8700152
Dithiothreit	Carl Roth (Germany)	6908
Ethanol	Carl Roth (Germany)	K928
Folinic acid calcium salt hydrate	Sigma-Aldrich (Germany)	47612
French pressure cell disruptor	SLM; Amico Instruments (USA)
Glycerol	Carl Roth (Germany)	3783
Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP)	Sigma-Aldrich (Germany)	G8877
Hydrochloric Acid	Carl Roth (Germany)	K025
IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL	GE Life Sciences (Germany)	GE17-5248
Imidazole	Carl Roth (Germany)	3899
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)	Carl Roth (Germany)	2316
Kanamycin	Carl Roth (Germany)	T832
L-Alanine	Carl Roth (Germany)	3076.1
L-Arginine	Carl Roth (Germany)	6908
L-Asparagine	Carl Roth (Germany)	HN23
L-Aspartic Acid	Carl Roth (Germany)	T202
L-Cysteine	Carl Roth (Germany)	T203
L-Glutamic Acid	Carl Roth (Germany)	3774
L-Glutamine	Carl Roth (Germany)	3772
L-Glycine	Carl Roth (Germany)	3187
L-Histidine	Carl Roth (Germany)	3852
L-Isoleucine	Carl Roth (Germany)	3922
L-Leucine	Carl Roth (Germany)	1699
L-Lysine	Carl Roth (Germany)	4207
L-Methionine	Carl Roth (Germany)	9359
L-Proline	Carl Roth (Germany)	1713
L-Phenylalanine	Carl Roth (Germany)	1709
L-Serine	Carl Roth (Germany)	4682
L-Threonine	Carl Roth (Germany)	1738
L-Tryptophane	Carl Roth (Germany)	7700
L-Tyrosine	Carl Roth (Germany)	T207
MD100 dialysis units	Scienova (Germany)	40077
N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES)	Carl Roth (Germany)	6763
n-dodecylphosphocholine	Antrace (USA)	F308S
PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell	Biorad (Germany)
PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems	Biorad (Germany)
PAGE gel power supply: Power Pac 3000	Biorad (Germany)
Tryptone/peptone from caseine	Carl Roth (Germany)	6681
Peristaltic pump: ip-12	Ismatec (Germany)
Phosphoenol pyruvate monopotassium salt	Sigma Aldrich (Germany)	860077
Potassium dihydrogen phosphate	Carl Roth (Germany)	P018
Potassium acetate	Carl Roth (Germany)	4986
Potassium chloride	Carl Roth (Germany)	6781
Pyruvate Kinase	Roche (Germany)	10109045001
Scintillation counter: Hidex 300 SL	Hidex (Finland)
SDS pellets	Carl Roth (Germany)	8029
Sodium azide	Sigma-Aldrich (Germany)	K305
Sodium chloride	Carl Roth (Germany)	P029
Spectrophotometer Nanodrop	Peqlab (Germany)
Spectrophotometer/fluorescence reader Spark®	Tecan (Switzerland)
tRNA (E. coli)	Roche (Germany)	10109550001
Ultra sonificator	Labsonic U, B. Braun (Germany)
Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP)	Sigma-Aldrich (Germany)	U6625
Y-30 antifoam	Sigma-Aldrich (Germany)	A6457
Yeast extract	Carl Roth (Germany)	2904