Insertion co-translationnelle de protéines membranaires dans des nanodisques préformés

Résumé

L’insertion co-translationnelle dans des nanodisques préformés permet d’étudier des protéines membranaires synthétisées acellulaires dans des environnements lipidiques définis sans contact avec des détergents. Ce protocole décrit la préparation des composants essentiels du système et les paramètres critiques pour améliorer l’efficacité de l’expression et la qualité de l’échantillon.

Résumé

Les systèmes d’expression acellulaires permettent la conception sur mesure d’environnements de réaction pour soutenir le repliement fonctionnel de protéines même complexes telles que les protéines membranaires. Les procédures expérimentales pour l’insertion et le repliement co-translationnels de protéines membranaires dans des membranes préformées et définies fournies sous forme de nanodisques sont démontrées. Le protocole est totalement exempt de détergent et peut générer des milligrammes d’échantillons purifiés en une journée. Les échantillons de protéines membranaires/nanodisques qui en résultent peuvent être utilisés pour une variété d’études fonctionnelles et d’applications structurelles telles que la cristallisation, la résonance magnétique nucléaire ou la microscopie électronique. La préparation de composants clés de base tels que les lysats acellulaires, les nanodisques avec des membranes conçues, les solutions mères critiques ainsi que l’assemblage de réactions d’expression sans cellules à deux compartiments sont décrites. Étant donné que les exigences de repliement des protéines membranaires peuvent être très diverses, l’un des principaux objectifs de ce protocole est la modulation des paramètres et des étapes de réaction importantes pour la qualité de l’échantillon, tels que les composés réactionnels de base critiques, la composition membranaire des nanodisques, l’environnement redox et chaperon, ou la conception de modèles d’ADN. L’ensemble du processus est démontré avec la synthèse de la protéorhodopsine et d’un récepteur couplé aux protéines G.

Introduction

Les protéines membranaires (MP) sont des cibles difficiles dans les études de production de protéines en raison de leur insolubilité dans des environnements aqueux. Les plates-formes de production MP conventionnelles comprennent des systèmes cellulaires tels que E. coli, la levure ou les cellules eucaryotes. Les MP recombinants synthétisés sont soit extraits des membranes cellulaires, soit repliés à partir des corps d’inclusion¹. Après solubilisation du détergent, les MP peuvent être transférés dans des environnements membranaires appropriés par des protocoles de reconstitution in vitro établis. Outre les vésicules et les liposomes, la reconstitution de MP en membranes planes sous forme de nanodisques² ou de particules de salipro³ est devenue une technique de routine ces derniers temps. Cependant, toutes ces stratégies impliquent un contact détergent avec les MP qui peut entraîner une déstabilisation, une dissociation des oligomères, voire une perte de structure et d’activité^{protéique 4}. Le dépistage des conditions optimales de solubilisation et de reconstitution des détergents peut donc être fastidieux et chronophage⁵.

La nature ouverte des systèmes acellulaires (CF) permet d’alimenter directement la réaction d’expression avec des membranes préformées avec une composition lipidique définie. Dans ce mode d’expression à base de lipides (L-CF), les MP synthétisés ont la possibilité d’insérer en co-traduction dans les bicouches^{fournies 6,7} (Figure 1). Les nanodisques constitués d’une protéine d’échafaudage membranaire (MSP) entourant un disque bicouche lipidique planaire⁸ semblent particulièrement adaptés à cette stratégie ^9,10. Les nanodisques peuvent être assemblés in vitro avec une variété de lipides différents, ils sont très stables et les stocks peuvent être concentrés jusqu’à 1 mM. Cependant, l’expression du MSP dans E. coli et sa purification sont nécessaires. Comme stratégie alternative, le MSP peut être co-exprimé avec le MP cible dans les réactions de mucoviscidose fournies avec des liposomes^11,12,13. Des modèles d’ADN pour MSP et MP sont ajoutés dans la réaction et MP / nanodisques peuvent se former lors de l’expression. Bien que la production de MSP soit évitée, la stratégie de co-expression nécessite un réglage minutieux des concentrations finales de la matrice d’ADN et on peut s’attendre à des variations plus importantes dans l’efficacité de la production d’échantillons.

L’insertion co-translationnelle de MP dans les membranes de nanodisques préformés est un mécanisme non physiologique et encore largement inconnu indépendant des machines de translocon et des séquences de signaux^13,14,15,16. Les principaux déterminants de l’efficacité de l’insertion sont le type de protéine membranaire ainsi que la composition lipidique de la membrane fournie, avec une préférence fréquente pour les lipides chargés négativement^15,17. Comme les membranes nanodisques sont relativement confinées en taille, une quantité importante de lipides est libérée lors de l’insertion^{de MP 18}. La variation de la taille des nanodisques permet l’insertion et l’ajustement de complexes MP oligomères supérieurs^15,18. Entre autres, l’assemblage correct de complexes homooligomères a été montré pour le canal ionique KcsA, pour la pompe ionique protéorhodopsine (PR) et pour le transporteur multidrogue EmrE^15,18. Les MP sont susceptibles de pénétrer dans la membrane nanodisque symétrique des deux côtés à une fréquence relativement égale. Il faut donc considérer que différents monomères ou oligomères insérés dans un nanodisque peuvent avoir des orientations opposées. Cependant, un biais d’orientation pourrait être causé par des mécanismes d’insertion coopératifs tels que rapportés pour la formation d’hexamères PR et de tétramères KcsA¹⁸. Un autre biais dans l’orientation des MP pourrait résulter des commutateurs d’orientation des MP insérés probablement au bord des membranes nanodisques.

La production de lysats de mucoviscidose à partir de souches d’E. coli est une technique de routine fiable et peut être effectuée dans presque tous les laboratoires biochimiques^19,20. Il faut considérer qu’en plus de la formation du pont disulfure, la plupart des autres modifications post-traductionnelles sont absentes si un MP est synthétisé à l’aide de lysats E. coli. Bien que cela puisse générer des échantillons plus homogènes pour les études structurelles, il peut être nécessaire d’exclure les effets potentiels sur la fonction des cibles MP individuelles. Cependant, la production efficace d’échantillons de haute qualité de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG)14,21,22^, de transporteurs eucaryotes 23 ou de grands assemblages hétéromères ²⁴ dans les lysats de E. coli CF indique leur adéquation même à des cibles complexes. Les quantités d’échelle préparative (≈ 1 mg/mL) d’un échantillon peuvent être obtenues avec la configuration sans cellule à échange continu (CECF) à deux compartiments, composée d’un compartiment de mélange réactionnel (RM) et d’un compartiment de mélange d’alimentation (FM). Le volume FM dépasse le volume RM de 15 à 20 fois et fournit un réservoir de composés énergétiques et de précurseurs de faible poids moléculaire¹⁹. La réaction d’expression est ainsi prolongée de plusieurs heures et le rendement final de la cible MP est augmenté. Les compartiments RM et FM sont séparés par une membrane de dialyse avec une coupure de 10-14 kDa. Les deux compartiments nécessitent une conception spéciale du récipient de réaction CECF (figure 1). Les cassettes de dialyse commerciales en tant que récipients RM en combinaison avec des récipients en plexiglas sur mesure contenant le FM sont des exemples appropriés. Les rendements MP peuvent en outre être manipulés en modifiant les rapports RM:FM ou en échangeant le FM après une certaine période d’incubation.

Le rendement et la qualité d’un MP nécessitent souvent une optimisation intense des paramètres de réaction. Un avantage important de l’expression CF est la possibilité de modifier et d’affiner presque n’importe quel composé en fonction des exigences individuelles d’un MP. Une stratégie simple consiste à se concentrer d’abord sur l’amélioration du rendement d’un MP en établissant un protocole de production de base, puis à optimiser la qualité du MP en affinant les conditions de réaction et de repliement. L’absence de processus physiologiques dans les lysats de mucoviscidose et leur complexité réduite se traduisent par des taux de réussite élevés pour la production efficace de MP²⁵. Les considérations de routine pour la conception de modèles d’ADN et l’optimisation de la concentration d’ions Mg 2⁺ sont dans la plupart des cas suffisantes pour obtenir des rendements satisfaisants²⁶. Selon le mode d’expression, l’optimisation de la qualité MP peut prendre beaucoup de temps, car une plus grande variété de paramètres doivent être examinés^14,17,22.

Pour établir la plateforme d’expression de la mucoviscidose décrite, des protocoles sont nécessaires pour la production de lysat d’E. coli (i), d’ARN polymérase T7 (ii), de nanodisques (iii) et des composés réactionnels CECF de base (iv) (Figure 1). Les dérivés A19²⁷ ou BL21 de la souche K12 d’E. coli sont fréquemment utilisés pour la préparation de lysats efficaces de S30 (centrifugation à 30 000 x g). Outre les lysats S30, des lysats correspondants centrifugés à d’autres forces g (par exemple S12) peuvent être utilisés. Les lysats diffèrent par l’efficacité de l’expression et la complexité du protéome. Le protéome du lysat S30 préparé par le protocole décrit a été étudié en détail²⁸. Le protéome S30 contient encore des protéines résiduelles de la membrane externe qui pourraient donner des problèmes de fond lors de l’expression et de l’analyse des canaux ioniques. Pour de telles cibles, l’utilisation de lysats S80-S100 est recommandée. Une modification précieuse lors de la préparation du lysat est l’induction de la réponse SOS par un choc thermique combiné et un apport d’éthanol à mi-phase de croissance logarithmique des cellules. Les lysats HS30 qui en résultent sont enrichis en chaperons et peuvent être utilisés dans des mélanges avec des lysats S30 pour un repliement MP²² amélioré. L’expression de la mucoviscidose dans les lysats d’E. coli est exploitée comme un processus couplé de transcription/traduction avec des matrices d’ADN contenant des promoteurs contrôlés par l’ARN polymérase T7 (T7RNAP). L’enzyme peut être produite efficacement dans les cellules étoiles BL21 (DE3) portant le plasmide pAR1219²⁹.

Deux copies de MSP1E3D1 s’assemblent en un nanodisque d’un diamètre de 10 à 12 nm, mais le protocole décrit ci-dessous peut également fonctionner pour d’autres dérivés MSP. Cependant, les nanodisques plus grands que ceux formés avec MSP1E3D1 ont tendance à être moins stables, tandis que les nanodisques plus petits formés avec des dérivés MSP tels que MSP1 peuvent ne pas accueillir de plus grands MP ou complexes MP. Les nanodisques MSP1E3D1 peuvent être assemblés in vitro avec une grande variété de lipides différents ou des mélanges lipidiques. Les nanodisques préformés sont généralement stables pendant > 1 an à -80 °C, tandis que la stabilité peut varier pour différents composants lipidiques. Pour le criblage des effets lipidiques sur le repliement et la stabilité d’un MP, il est nécessaire de préparer un ensemble complet de nanodisques assemblés avec une variété représentative de lipides/mélanges lipidiques. Les lipides suivants peuvent donner un bon choix de départ: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycéro-3-phospho-(1'-rac-glycérol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DMPC), 1,2 dioléoyl-sn-glycéro-3-phospho-rac-(1-glycérol) (DOPG), 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phospho-(1'-rac-glycérol) (POPG) et 1-palmitoyl-2-oléoyl-glycéro-3-phosphocholine (POPC).

Un protocole pour la préparation d’une réaction CECF de 3 mL est décrit. Une mise à l’échelle plus élevée ou plus basse dans un rapport de 1:1 est possible. Pour la configuration CECF à deux compartiments, un RM contenant tous les composés et un FM contenant uniquement les composés de faible poids moléculaire doivent être préparés. Les appareils de dialyse commerciaux de 3 ml avec MWCO de 10 à 14 kDa peuvent être utilisés comme contenants RM, qui sont ensuite placés dans des contenants en plexiglas fabriqués sur mesure contenant le FM (Figure 1D)³⁰. Le rapport RM:FM est de 1:20, donc 60 mL de FM doivent être préparés pour 3 mL RM. La qualité, la concentration ou le type de plusieurs composants peuvent être critiques pour le rendement final et/ou la qualité du MP synthétisé (tableau 1). Les modèles d’ADN doivent être préparés conformément aux lignes directrices publiées et l’optimisation du codon du cadre de lecture de la cible peut encore améliorer considérablement le rendement du produit²⁶. Pour la réaction CECF à l’échelle préparatrice, un protocole établi pour la production de PN est décrit. Pour établir des protocoles d’expression pour les nouveaux MP, il est généralement nécessaire d’effectuer des criblages d’optimisation de certains composés (tableau 1) afin d’améliorer le rendement et la qualité. Pour les ions Mg²⁺ , il existe un optimum de concentration bien ciblé qui montre souvent une variation significative pour différents modèles d’ADN. D’autres composés réactionnels de la mucoviscidose, tels que de nouveaux lots de lysats T7RNAP ou S30, peuvent modifier davantage la concentration optimale de Mg²⁺ . À titre d’exemple, un écran Mg 2+ typique dans la plage de concentration de^14-24 mM et par pas de 2 mM est décrit. Chaque concentration est examinée en double et dans des réactions CECF à l’échelle analytique. En tant que conteneur de réaction CECF, des conteneurs en plexiglas Mini-CECF³⁰ sur mesure contenant le RM sont utilisés en combinaison avec des microplaques standard à 24 puits contenant le FM (Figure 1B). On peut aussi utiliser des cartouches de dialyse commerciales en combinaison avec des microplaques de puits de 96 profondeurs ou d’autres dispositifs de dialyseur commerciaux dans des configurations appropriées (figure 1C).

Protocole

1. Préparation du lysat S30

1. Jour 1 : Extraire les cellules des stocks de glycérol sur une plaque de gélose LB et incuber à 37 ° C pendant la nuit.
2. Jour 2 : Inoculer 200 mL de milieu LB avec les cellules de la plaque de gélose et incuber à 37 °C pendant 12-14 h.
3. Jour 3 : Inoculer 10 L de milieu YPTG stérile (extrait de levure de 10 g/L, 16 g/L de tryptone, 5 g/L de NaCl, 19,8 g/L de glucose, 4,4 mM KH₂PO₄, 8 mM_K2HP4) tempéré à 37 °C dans un réacteur en cuve agitée de 15 L avec 100 mL de préculture (1:100). Cultiver à 37 °C, 500 tr/min et une forte aération (~ 3 volumes d’air par minute). Pour éviter la formation excessive de mousse, ajoutez un antimousse stérile.
4. Mesurer la densité optique (DO) à 600 nm à intervalles réguliers. Après environ 2 h, la culture entrera dans la phase logarithmique.
5. Modification pour le lysat HS30: Lorsque les cellules sont en phase logarithmique (OD600 ≈ 3,6-4,2), ajoutez 300 ml d’éthanol dans le milieu de culture et procédez à la culture à 42 °C, 500 tr/min et à une aération élevée (environ 3 volumes d’air par minute) pendant 45 minutes supplémentaires. Procédez ensuite au refroidissement et à la récolte de la culture cellulaire comme décrit à l’étape 1.6. Pour la production du lysat S30 standard, ignorez cette étape et passez à l’étape 1.6.
6. Lorsque les cellules sont en phase logarithmique (OD600 ≈ 3,6-4,2), refroidir le fermenteur à une température inférieure à 20 °C en < 30 minutes. L’OD600 final devrait se situer autour de 4,5-5,5. Récolter les cellules à 4 500 x g pendant 20 min à 4 °C et éliminer le surnageant. Conserver les cellules à 4 °C tout au long des étapes suivantes.
   REMARQUE: Pendant le refroidissement, une formation excessive de mousse peut se produire. Dans ce cas, ajoutez de l’antimousse ou réduisez la vitesse d’agitation et/ou diminuez le flux d’air dans le bioréacteur.
7. Suspendre complètement les cellules dans 300 mL de tampon S30-A (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KCl, 6 mM 2-mercaptoéthanol) à l’aide d’une spatule suivie d’un pipetage de la suspension de haut en bas jusqu’à homogénéité. Centrifuger à 8 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Répétez cette étape deux fois.
   ATTENTION : Le 2-mercaptoéthanol est toxique. Éviter tout contact avec la peau ou les voies respiratoires. Si possible, travaillez sous un capot. Pesez le bécher à centrifuger vide avant la dernière étape de lavage. Après la centrifugation, peser la pastille de cellules humides et passer à l’étape 1.8 ou conserver la pastille jusqu’à une utilisation ultérieure.
   NOTE: Le poids de la pastille de cellules humides est de 5-7 g par culture de bioréacteur de 1 L. À ce stade, le protocole peut être suspendu et la pastille peut être congelée dans de l’azote liquide et stockée à -80 °C pendant 4 à 8 semaines.
8. Suspendre complètement les cellules dans 1,1 volume (1 g = 1 mL) de tampon S30-B (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)₂, 60 mM KOAc, 1 mM DTT, 1 comprimé d’inhibiteur de protéase cOmplete). Remplissez la suspension dans une cellule de pression de presse Français pré-refroidie et perturbez les cellules à 1 000 psig. Passez les cellules à travers le Français appuyez une fois.
9. Centrifuger le lysat à 30 000 x g pendant 30 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans un tube neuf et répéter l’étape de centrifugation.
   NOTE: Une couche lâche et visqueuse peut être présente sur le dessus de la pastille après la première centrifugation, qui ne doit pas être transférée avec le surnageant.
10. Appliquez une étape de sel et de chaleur élevée pour éliminer les composants instables du lysat et libérer l’ARNm des ribosomes. Régler le lysat à 0,4 M NaCl et incuber à 42 °C pendant 45 minutes au bain-marie.
    REMARQUE: Cette étape entraînera une formation de précipité importante. Retourner ou retourner le tube pendant l’incubation de temps en temps.
11. Transférer la suspension trouble (habituellement 50-80 mL) dans des tubes de dialyse avec une coupure de 10-14 kDa et dialyser contre un tampon S30-C de 5 L (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)₂, 60 mM KOAc, 0,5 mM DTT). Échangez le tampon de dialyse S30-C après 2-3 h et dialysez pendant 12-14 heures supplémentaires.
12. Jour 4 : Transférer la suspension dialysée dans des tubes à centrifuger et centrifuger à 30 000 x g pendant 30 min à 4 °C. Transvaser le surnageant (lysat S30) dans des tubes frais de 50 ml et mélanger délicatement. La concentration en protéines du lysat devrait être d’environ 30-40 mg / mL. Congeler les aliquotes de choc (p. ex. 0,5 mL, 1 mL) dans de l’azote liquide et les conserver à -80 °C. Les aliquotes sont stables pendant > 1 an.

2. Expression et purification de l’ARN polymérase T7

1. Jour 1 : Inoculer 200 mL de milieu LB contenant 100 μg/mL d’ampicilline avec des cellules BL21(DE3) Star x pAR1219 fraîchement plaquées et incuber à 37 °C et 180 rpm pendant 12-16 h.
2. Jour 2 : Inoculer 1 L de bouillon formidable (12 g/L de tryptone, 24 g/L d’extrait de levure, 4 mL/L de glycérol) dans une fiole déflecteur de 2 L avec 10 mL de préculture et incuber à 37 °C et 180 rpm d’agitation. L’OD600 de départ devrait être d’environ 0,1.
3. Lorsque l’OD600 atteint 0,6-0,9, ajouter IPTG à une concentration finale de 1 mM pour induire l’expression de T7RNAP et continuer la culture pendant encore 5 heures.
4. Récolter les cellules par centrifugation à 4 500 x g pendant 20 min à 4 °C. Congeler les cellules dans de l’azote liquide et les conserver à -80 °C.
   REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.
5. Jour 3 : Ajouter 30 mL de tampon de suspension glacée (30 mM de Tris-HCl, pH 8,0 avec un comprimé d’inhibiteur de protéase cOmplete) à la pastille de cellules congelées et décongeler la pastille au bain-marie à température ambiante. Ensuite, suspendez la pastille en tuytant de haut en bas jusqu’à homogénéité.
6. Effectuez une interruption de cellule à l’aide d’une presse Français comme décrit dans la section précédente ou utilisez un dispositif de sonication conformément aux recommandations du fabricant. Ensuite, centrifuger à 20 000 x g pendant 30 min à 4 °C et transférer le surnageant dans un tube neuf.
7. Pour précipiter l’ADN génomique, ajouter le sulfate de streptomycine lentement et sous agitation douce au surnageant jusqu’à ce qu’une concentration finale de 3% (p / v) soit atteinte. Incuber à 4 °C pendant 5-10 min sous agitation douce. Centrifuger à 20 000 x g pendant 30 min à 4 °C.
8. Filtrer le surnageant avec un filtre de 0,45 μm et le charger sur une colonne Q-Sépharose d’un volume de colonne (CV) de 40 mL équilibré avec un tampon d’équilibrage à 2 CV (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5% glycérol et 10 mM 2-mercaptoéthanol) à l’aide d’une pompe péristaltique à un débit de 4 mL/min. Ensuite, connectez la colonne à un détecteur UV et continuez l’élution avec un tampon d’équilibrage jusqu’à ce que le signal UV à 280 nm atteigne une ligne de base stable.
9. Elute T7RNAP avec un gradient de 50 mM à 500 mM NaCl par CV à un débit de 3 mL/min. Prélever 1 mL de fractions et préparer des échantillons pour l’analyse SDS-PAGE en mélangeant 10 μL de chaque fraction avec 2 x tampon d’échantillon SDS. Exécutez SDS-PAGE et colorez le gel avec Coomassie Blue R. T7RNAP devrait apparaître comme une bande proéminente à environ 90 kDa avec de nombreuses bandes supplémentaires d’impuretés.
10. Fractions de pool contenant T7RNAP et dialyse à l’aide de membranes avec un MWCO de 12-14 kDa pendant 12-16 h dans un tampon de dialyse (10 mM K2 HPO 4/KH₂PO₄, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT, 5% (p/v) glycérol).
11. Jour 4 : Recueillir la solution et le concentré T7RNAP à l’aide d’unités de filtration contenant 12 à 14 MWCO jusqu’à une concentration finale de 3 à 10 mg/mL. T7RNAP peut commencer à précipiter pendant la concentration. Arrêtez la concentration instantanément dès que la turbidité de l’échantillon se produit. Ajouter le glycérol à une concentration finale de 50% (p / v) et mélanger délicatement. Congeler 0,5-1 mL d’aliquotes et conserver à -80 °C. Les aliquotes T7RNAP fonctionnelles peuvent être conservées à -20 °C.
    REMARQUE : Environ 20 à 40 mL de T7RNAP partiellement purifié de 5 mg/mL avec 20 000 à 40 000 unités doivent être obtenus à partir d’une fermentation de 1 L. Pour tester la quantité optimale de chaque lot de T7RNAP, des réactions d’expression de la FK de la protéine fluorescente verte (GFP) contenant 0,02 mg/mL-0,1 mg/mL de l’échantillon préparé de T7RNAP doivent être effectuées.

3. Expression et purification de MSP1E3D1

1. Jour 1 : Transformez les cellules stellaires d’E. coli BL21 (DE3) avec le vecteur pET28(a)-MSP1E3D1³¹ en utilisant des protocoles standard de transformation ou d’électroporation des chocs thermiques. Streak out ou plaque transformée cellules sur gélose LB contenant 30 μg/mL de kanamycine et incuber à 37 °C pendant 12-16 h.
2. Jour 2 : Inoculer 200 mL de milieu LB supplémenté avec 0,5% (p/v) de glucose et 30 μg/mL de kanamycine avec une seule colonie prélevée dans la plaque de gélose et incuber à 37 °C à 180 rpm pendant 12-16 h.
3. Jour 3 : Inoculer 10 L de milieu LB supplémenté avec 0,5 % (p/v) de glucose et 30 μg/mL de kanamycine avec 100 mL de pré-culture dans un bioréacteur en cuve agitée. Effectuer la fermentation à 37 °C, 500 tr/min et l’aération d’environ 3 volumes de bioréacteur par minute. En cas de moussage excessif, ajoutez de l’antimousse.
   REMARQUE: Des flacons agités déconcertés peuvent être utilisés à la place d’un fermenteur.
4. À OD600 de 6,5-7,5, ajouter IPTG à une concentration finale de 1 mM et poursuivre l’incubation à 37 °C pendant 1 h. Récolter les cellules par centrifugation à 4 500 x g pendant 20 min à 4 °C. Laver les granulés de cellule avec 200 ml de NaCl à 0,9 % (p/v) et centrifuger à nouveau à 8 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Jeter le surnageant et transférer les cellules dans des tubes de 50 ml à l’aide d’une spatule. Le poids attendu des pastilles humides est de 8 à 12 g par L de culture de bioréacteur. Congeler les granulés de cellules dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C jusqu’à nouvelle utilisation.
   REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.
5. Jour 4 : Pour la purification, décongeler les granulés de cellules dans un bain-marie à TA. Suspendre les cellules dans un tampon MSP-A (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1% (p/v) Triton X-100, 1 comprimé de cocktail d’inhibiteurs de protéase c0mplete par suspension cellulaire de 50 mL) pour obtenir une suspension cellulaire de 30 à 40% (p / v).
6. Perturbez les cellules par sonication ou à l’aide d’une presse Français et d’une centrifugeuse à 30 000 x g pendant 30 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans un tube neuf et filtrer à travers un filtre de 0,45 μm. Appliquer le filtrat sur une colonne d’acide nitrilotriacétique chargée de Ni²⁺ (CV > 15 mL) équilibrée avec 5 CV de tampon MSP-B (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1% (p/v) Triton X-100) à l’aide d’une pompe péristaltique.
   REMARQUE: Pour faciliter la filtration, le surnageant peut être soniqué pendant une minute supplémentaire pour décomposer de gros fragments d’ADN.
7. Après chargement de l’échantillon, laver la colonne avec 5 CV MSP-B, 5 CV MSP-C (40 mM Tris-HCl, pH 8,9, 300 mM NaCl, 50 mM acide cholique), 5 CV MSP-D (40 mM Tris-HCl, pH 8,9, 300 mM NaCl), 5 CV MSP-E (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl) et 5 CV MSP-F (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole).
   REMARQUE: L’acide cholique dans le tampon MSP-C est important pour éliminer les lipides attachés au MSP. L’acide cholique n’est pas complètement soluble à de faibles valeurs de pH. La valeur du pH doit donc être ajustée à 8,9 en MSP-C et MSP-D. Il est important de laver la colonne avec un tampon MSP-D, car un pH plus bas pourrait provoquer la précipitation de l’acide cholique résiduel et bloquer ou endommager la colonne.
8. Elute MSP avec MSP-G (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 300 mM imidazole). Recueillir des fractions de 1 mL et surveiller l’absorption UV à 280 nm. Recueillir et mettre en commun les fractions du pic d’élution.
9. Transvaser les fractions MSP regroupées dans des tubes à membrane de dialyse MWCO de 12 à 14 kDa et dialyser contre 5 L de MSP-H (40 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM de NaCl, 10 % (p/v) de glycérol) pendant 2 à 3 h à 4 °C. Passer à un tampon MSP-H frais de 5 L et dialyser pendant encore 12-16 h à 4 °C.
10. Jour 5 : Transférer la solution MSP dans des tubes à centrifuger et centrifuger à 18 000 x g pendant 30 min à 4 °C pour éliminer le précipité. Transvaser le surnageant dans un tube frais et le concentrer à 200-800 μM à l’aide de dispositifs d’ultrafiltration avec 12-14 kDa MWCO à 4 °C. Mesurer la concentration à l’aide d’un appareil de mesure UV/VIS. Utiliser le coefficient d’extinction de 27,31 M-1 ^cm-1 et la masse moléculaire de 31,96 kDa pour calculer la concentration.
    REMARQUE : L’expression dans un bioréacteur donne habituellement 15 à 30 mg de MSP1E3D1 par culture de L.
11. Aliquotes congelées de la solution concentrée de MSP dans de l’azote liquide et stockées à -80 °C.

4. Assemblage de nanodisques MSP1E3D1

1. Jour 1 : Préparer 1 à 2 mL de souches lipidiques de 50 mM (DMPG, DOPG, POPG DMPC, DOPC ou POPC) dans du cholate de sodium de 100 mM. Conserver à -20 °C s’il n’est pas utilisé le jour même.
   NOTE: La solution lipidique doit être claire. Si la solution n’est pas claire, la concentration de cholate de sodium peut être augmentée à 150 mM.
2. Mélanger la solution MSP1E3D1 avec la solution lipidique. Ajouter la phosphocholine dodécylique (DPC) à une concentration finale de 0,1% (p / v). Les réactions d’assemblage peuvent être ajustées à des volumes finaux de 3 mL (tableau 2) ou 12 mL correspondant aux volumes typiques des cassettes de dialyse (10 kDa MWCO). Incuber les réactions d’assemblage pendant 1 h à 21 °C sous agitation douce.
   NOTE: Pour chaque lipide, un rapport MSP1E3D1:lipide spécifique doit être utilisé pour assurer une préparation homogène des nanodisques (Tableau 2). Pour les nouveaux lipides ou mélanges lipidiques, le rapport optimal doit être déterminé à l’aide d’une expérience pilote et d’une analyse chromatographique d’exclusion^{de taille 14}.
3. Pré-mouiller la membrane d’une cassette de dialyse avec tampon de formation de disque (DF) (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl). Transférer le mélange d’assemblage dans la cassette de dialyse avec une seringue. Les bulles d’air potentielles peuvent être éliminées par aspiration à l’aide de la seringue.
4. Jours 1 à 4 : Dialyser contre un tampon 3 x 5 L DF pendant 10-20 h à TA sous agitation à l’aide d’une barre d’agitation. Transférez ensuite le mélange d’assemblage de la cassette de dialyse dans des unités de filtration centrifuges avec 10 kDa MWCO équilibré avec un tampon DF. Concentrer à 4 000 x g à 4 °C.
   REMARQUE: Un mélange de dialyse trouble pourrait indiquer un mauvais rapport stœchiométrique de MSP:lipide. Le précipité doit être éliminé à 18 000 x g pendant 20 min à 4 °C avant la concentration de l’échantillon. Pour éviter les précipitations pendant la concentration de l’échantillon, utilisez des unités d’ultrafiltration avec une grande butée sèche.
5. Concentrer les nanodisques assemblés à une concentration d’au moins 300 μM. Mesurer la concentration à l’aide d’un lecteur UV/VIS. Considérez qu’un nanodisque est formé par deux molécules MSP1E3D1 et que, par conséquent, la concentration de MSP doit être divisée par 2 pour déterminer la quantité correcte de nanodisques.
   REMARQUE : La configuration décrite (tableau 2) produira 0,6 à 1 mL d’une solution nanodisque de 300 μM.
6. Centrifuger la préparation concentrée de nanodisques à 18 000 x g pendant 20 min à 4 °C pour éliminer le précipité. Ensuite, aspirer le surnageant et congeler 50 μL aliquotes dans de l’azote liquide et stocker à -80 °C.
   NOTE: Il est conseillé d’évaluer le succès de la formation de nanodisques en utilisant la chromatographie d’exclusion de taille. L’échantillon doit être monodispersé et ne doit contenir qu’une faible quantité d’agrégats. Les agrégats indiquent que la quantité de lipides dans la configuration est trop élevée. À titre de référence, le MSP1E3D1 purifié peut être utilisé. Si la préparation du nanodisque montre un pic à la hauteur du pic MSP1E3D1 de référence, le rapport lipide / MSP1E3D1 choisi était trop faible.

5. Mise en place de réaction CECF à l’échelle préparative de 3 mL

1. Jour 1 : Préparez toutes les solutions mères nécessaires telles qu’énumérées (tableau 3). Les stocks sont stockés à -20 °C et décongelés à température ambiante. Assurez-vous de bien mélanger tous les bouillons après la décongélation et avant le pipetage. Calculer les volumes requis pour tous les stocks et établir un système de pipetage (tableau 4). Les composés de poids moléculaire élevé ne seront ajoutés que dans le RM. Pour les composés de faible poids moléculaire, un mastermix combiné 3 x pour RM et FM peut être préparé.
   NOTE: Les volumes finaux des mélanges composés peuvent être inférieurs à ceux calculés en raison de la perte de volume pendant le mélange. Cela peut être évité en ajoutant un volume excédentaire de 2 à 5% pour compenser la perte de volume.
2. Équilibrer la membrane d’une cassette de dialyse de 3 mL dans 100 mM de tris-acétate, pH 8,0. Assurez-vous de supprimer l’excès de tampon.
3. Utiliser une seringue pour transférer le RM dans la cassette de dialyse. Éliminer l’excès d’air dans le compartiment RM par aspiration avec la seringue. Placez la cassette de dialyse dans la chambre de dialyse.
4. Remplissez la chambre de dialyse avec 60 ml de FM. Placez le couvercle sur la chambre et serrez les vis pour le fixer. Incuber la chambre pendant 12-16 h à 30 °C à 200 tr/min.
   REMARQUE: Assurez-vous que la chambre reste en position verticale pendant l’agitation, sinon l’échange de composés de faible poids moléculaire sera entravé.
5. Jour 2 : À l’aide d’une seringue, aspirer le RM de la chambre de dialyse. Transférer le RM dans des tubes frais et centrifuger à 16 000 x g à 4 °C pendant 10 min pour éliminer le précipité. Transférer le surnageant dans des tubes frais. La protéine dans le surnageant peut maintenant être analysée plus avant.
   NOTE: Dans certains cas, une pastille sera présente après la centrifugation. Cela peut fournir des informations importantes sur la pertinence des nanodisques analysés ou des composés réactionnels pour maintenir la MP synthétisée soluble. Il est donc conseillé d’analyser la quantité de cible potentiellement présente dans le précipité à l’aide de SDS-PAGE, Western Blot, ou par évaluation visuelle de la taille de la pastille.

6. Échelle analytique Configuration de réaction CECF 60 μL pour le criblage ionique Mg²⁺

1. Jour 1 : Mélangez tous les composants du mélange principal 3x respectif et distribuez 60 μL au RM et 825 μL au FM. Remplissez la FM avec H₂O et mélangez la FM par vortex. Transférer le FM dans 3 puits sur la microplaque de 24 puits (tableau 5).
   REMARQUE : Étant donné que le contenant personnalisé Mini-CECF pourrait ne pas être accessible, les volumes du tableau 5 sont calculés pour une réaction effectuée dans des cartouches de dialyse (10-14 kDa MWCO, RM : 100 μL) avec un volume FM de 1,7 mL dans 96 plaques de puits profonds (2 mL) (Figure 1).
2. Couper les tubes de dialyse en cellulose régénérée avec un MWCO de 10 à 14 kDa en morceaux d’environ 25 x 20 mm et les conserver dans H₂O avec 0,05 % (p/v) d’azoture de sodium.
   ATTENTION : L’azoture de sodium est très toxique. Évitez tout contact avec la peau ou les muqueuses. N’utilisez pas de contenants métalliques, car l’azoture de sodium peut réagir avec les métaux pour former des azotures métalliques explosifs.
3. Avant l’assemblage du récipient Mini-CECF, retirez l’excès de H₂O des membranes de dialyse avec un mouchoir. Placez un morceau de membrane sur chaque récipient et fixez les membranes avec un anneau en polytétrafluoréthylène.
4. Transférer le contenant Mini-CECF dans les puits d’une plaque de 24 puits contenant 825 μL de FM. Évitez les bulles d’air sous la membrane de dialyse du contenant Mini-CECF.
5. Ajouter des composants moléculaires élevés au RM comme décrit (tableau 5) et mélanger en pipetant de haut en bas. Ajouter 60 μL dans le récipient de réaction. Évitez les bulles d’air pendant le transfert de la solution visqueuse.
6. Coupez 2 feuilles de 8 x 10 cm d’un film thermoplastique d’étanchéité et enroulez-les autour de la plaque de 24 puits avec les récipients de réaction à l’intérieur. Cela réduira l’évaporation du mélange réactionnel. Maintenant, placez le couvercle de la plaque de culture cellulaire sur la plaque et fixez-le avec du ruban adhésif. Incuber la plaque à 30 °C et 200 tr/min en agitation pendant 12-16 h.
7. Jour 2 : Récolter le mélange réactionnel en perçant la membrane de dialyse avec l’embout de la pipette au récipient Mini-CECF et aspirer le RM. Transvaser RM dans des tubes frais et centrifuger à 16 000 x g à 4 °C pendant 10 min pour éliminer les précipités. Transférer le surnageant dans des tubes frais. La protéine dans le surnageant peut maintenant être analysée plus avant.
   NOTE: Dans certains cas, après la centrifugation, une pastille sera présente. Cela peut fournir des informations importantes sur la pertinence des nanodisques analysés ou d’autres composés réactionnels pour maintenir le MP synthétisé soluble. Il est donc conseillé d’analyser la quantité de cible potentiellement présente dans le précipité par SDS-PAGE, Western Blot, ou évaluation visuelle de la taille de la pastille.

Résultats

L’impact du réglage fin des composés réactionnels sur le rendement final ou la qualité des MP synthétisés est illustré. Une approche de routine fréquente consiste à ajuster la concentration optimale de Mg²⁺ dans les réactions de mucoviscidose par expression de protéine fluorescente verte (GFP) comme moniteur pratique de l’efficacité du système. À titre d’exemple, la GFP a été synthétisée à partir d’un vecteur pET-21a(+) à des concentrations de Mg 2+ comprises entre 14 et²⁴

Discussion

La configuration et les stratégies visant à optimiser l’expression de la mucoviscidose et l’insertion co-translationnelle de MP fonctionnels dans les nanodisques sont décrites. L’équipement requis comprend un bioréacteur, un dispositif de presse à Français ou similaire, un lecteur UV/VIS et de fluorescence, des cuves de réaction CF adaptées à une configuration à deux compartiments et un incubateur à température contrôlée. D’autres équipements standard sont des centrifugeuses pour la récolte de ce...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG)	Avanti Polar Lipids (USA)	840445P
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids (USA)	850345C
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC)	Avanti Polar Lipids (USA)	850375C
1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG)	Avanti Polar Lipids (USA)	840475C
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids (USA)	850457C
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG)	Avanti Polar Lipids (USA)	840034C
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris)	Carl Roth (Germany)	4855
2-Mercaptoethanol	Carl Roth (Germany)	4227
2-Propanol	Carl Roth (Germany)	9781
[3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride	American Radiolabeled Chemicals (USA)	ART0134
Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP)	Merck (Germany)	1409
Adenosine 5’-triphosphate (ATP)	Sigma Aldrich (Germany)	A9251
Alprenolol hydrochloride	Merck (Germany)	A0360000
Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose®	Sigma-Aldrich (Germany)	Q1126
Autoclave Type GE 446EC-1	Gettinge (Germany)
Bioreactor Type 884 124/1	B.Braun (Germany)
Centrifuge	Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)
Cholic acid	Carl Roth (Germany)	8137
Coomassie Brilliant Blue R250	Carl Roth (Germany)	3862
Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks	Schott Duran (Germany)
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt	Sigma-Aldrich (Germany)	C1506
D-glucose monohydrate	Carl Roth (Germany)	6780
Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate	Carl Roth (Germany)	6878
Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing	Fisher Scientific (Germany)	8700152
Dithiothreit	Carl Roth (Germany)	6908
Ethanol	Carl Roth (Germany)	K928
Folinic acid calcium salt hydrate	Sigma-Aldrich (Germany)	47612
French pressure cell disruptor	SLM; Amico Instruments (USA)
Glycerol	Carl Roth (Germany)	3783
Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP)	Sigma-Aldrich (Germany)	G8877
Hydrochloric Acid	Carl Roth (Germany)	K025
IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL	GE Life Sciences (Germany)	GE17-5248
Imidazole	Carl Roth (Germany)	3899
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)	Carl Roth (Germany)	2316
Kanamycin	Carl Roth (Germany)	T832
L-Alanine	Carl Roth (Germany)	3076.1
L-Arginine	Carl Roth (Germany)	6908
L-Asparagine	Carl Roth (Germany)	HN23
L-Aspartic Acid	Carl Roth (Germany)	T202
L-Cysteine	Carl Roth (Germany)	T203
L-Glutamic Acid	Carl Roth (Germany)	3774
L-Glutamine	Carl Roth (Germany)	3772
L-Glycine	Carl Roth (Germany)	3187
L-Histidine	Carl Roth (Germany)	3852
L-Isoleucine	Carl Roth (Germany)	3922
L-Leucine	Carl Roth (Germany)	1699
L-Lysine	Carl Roth (Germany)	4207
L-Methionine	Carl Roth (Germany)	9359
L-Proline	Carl Roth (Germany)	1713
L-Phenylalanine	Carl Roth (Germany)	1709
L-Serine	Carl Roth (Germany)	4682
L-Threonine	Carl Roth (Germany)	1738
L-Tryptophane	Carl Roth (Germany)	7700
L-Tyrosine	Carl Roth (Germany)	T207
MD100 dialysis units	Scienova (Germany)	40077
N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES)	Carl Roth (Germany)	6763
n-dodecylphosphocholine	Antrace (USA)	F308S
PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell	Biorad (Germany)
PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems	Biorad (Germany)
PAGE gel power supply: Power Pac 3000	Biorad (Germany)
Tryptone/peptone from caseine	Carl Roth (Germany)	6681
Peristaltic pump: ip-12	Ismatec (Germany)
Phosphoenol pyruvate monopotassium salt	Sigma Aldrich (Germany)	860077
Potassium dihydrogen phosphate	Carl Roth (Germany)	P018
Potassium acetate	Carl Roth (Germany)	4986
Potassium chloride	Carl Roth (Germany)	6781
Pyruvate Kinase	Roche (Germany)	10109045001
Scintillation counter: Hidex 300 SL	Hidex (Finland)
SDS pellets	Carl Roth (Germany)	8029
Sodium azide	Sigma-Aldrich (Germany)	K305
Sodium chloride	Carl Roth (Germany)	P029
Spectrophotometer Nanodrop	Peqlab (Germany)
Spectrophotometer/fluorescence reader Spark®	Tecan (Switzerland)
tRNA (E. coli)	Roche (Germany)	10109550001
Ultra sonificator	Labsonic U, B. Braun (Germany)
Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP)	Sigma-Aldrich (Germany)	U6625
Y-30 antifoam	Sigma-Aldrich (Germany)	A6457
Yeast extract	Carl Roth (Germany)	2904