Inserimento co-traduzionale di proteine di membrana in nanodischi preformati

Riepilogo

L'inserimento co-traduzionale in nanodischi preformati rende possibile lo studio di proteine di membrana sintetizzate prive di cellule in ambienti lipidici definiti senza contatto con detergenti. Questo protocollo descrive la preparazione dei componenti essenziali del sistema e i parametri critici per migliorare l'efficienza dell'espressione e la qualità del campione.

Abstract

I sistemi di espressione cell-free consentono la progettazione su misura di ambienti di reazione per supportare il ripiegamento funzionale di proteine anche complesse come le proteine di membrana. Vengono dimostrate le procedure sperimentali per l'inserimento e il ripiegamento co-traduzionale di proteine di membrana in membrane preformate e definite fornite come nanodischi. Il protocollo è completamente privo di detergenti e può generare milligrammi di campioni purificati in un giorno. I campioni di proteine di membrana/nanodisco risultanti possono essere utilizzati per una varietà di studi funzionali e applicazioni strutturali come la cristallizzazione, la risonanza magnetica nucleare o la microscopia elettronica. Viene descritta la preparazione di componenti chiave di base come lisati cell-free, nanodischi con membrane progettate, soluzioni stock critiche e l'assemblaggio di reazioni di espressione prive di cellule a due compartimenti. Poiché i requisiti di ripiegamento delle proteine di membrana possono essere molto diversi, un obiettivo principale di questo protocollo è la modulazione dei parametri e delle fasi di reazione importanti per la qualità del campione come i composti critici di reazione di base, la composizione della membrana dei nanodischi, l'ambiente redox e chaperone o la progettazione del modello di DNA. L'intero processo è dimostrato con la sintesi di proteorodopsina e un recettore accoppiato alla proteina G.

Introduzione

Le proteine di membrana (MP) sono obiettivi impegnativi negli studi sulla produzione di proteine a causa della loro insolubilità in ambienti acquosi. Le piattaforme di produzione MP convenzionali comprendono sistemi basati su cellule come E. coli, lievito o cellule eucariotiche. Gli MP ricombinanti sintetizzati vengono estratti dalle membrane cellulari o ripiegati dai corpi di inclusione¹. Dopo la solubilizzazione del detergente, gli MP possono essere trasferiti in ambienti di membrana adatti mediante protocolli di ricostituzione in vitro stabiliti. Oltre alle vescicole e ai liposomi, la ricostituzione di MP nelle membrane planari sotto forma di nanodischi² o particelle salipro³ è diventata una tecnica di routine negli ultimi tempi. Tuttavia, tutte queste strategie implicano il contatto del detergente con i MP che può provocare destabilizzazione, dissociazione degli oligomeri e persino perdita della struttura e dell'attività proteica⁴. Lo screening per condizioni ottimali di solubilizzazione e ricostituzione del detergente può quindi essere noioso e richiedere molto tempo⁵.

La natura aperta dei sistemi cell-free (CF) consente di fornire direttamente la reazione di espressione con membrane preformate con una composizione lipidica definita. In questa modalità di espressione a base lipidica (L-CF), i MP sintetizzati hanno l'opportunità di inserire co-traduzionalmente nei doppi strati forniti ^6,7 (Figura 1). I nanodischi costituiti da una proteina di scaffold di membrana (MSP) che circonda un disco planare lipidico a doppio strato⁸ sembrano essere particolarmente adatti per questa strategia ^9,10. I nanodischi possono essere assemblati di routine in vitro con una varietà di lipidi diversi, sono molto stabili e le scorte possono essere concentrate fino a 1 mM. Tuttavia, l'espressione della MSP in E. coli e la sua purificazione sono necessarie. Come strategia alternativa, la MSP può essere co-espressa insieme al target MP nelle reazioni CF fornite con liposomi^11,12,13. I modelli di DNA sia per MSP che MP vengono aggiunti nella reazione e MP/nanodischi possono formarsi durante l'espressione. Mentre la produzione di MSP è evitata, la strategia di co-espressione richiede un'attenta messa a punto delle concentrazioni finali del modello di DNA e ci si possono aspettare variazioni più elevate nell'efficienza della produzione del campione.

L'inserimento co-traduzionale di MP in membrane di nanodischi preformati è un meccanismo non fisiologico e ancora in gran parte sconosciuto indipendente dai macchinari translocon e dalle sequenze di segnale^13,14,15,16. I principali determinanti dell'efficienza di inserzione sono il tipo di proteina di membrana e la composizione lipidica della membrana fornita, con una frequente preferenza per i lipidi caricati negativamente^15,17. Poiché le membrane dei nanodischi sono di dimensioni relativamente limitate, una notevole quantità di lipidi viene rilasciata dopo l'inserimento MP¹⁸. La variazione della dimensione del nanodisco consente l'inserimento e la messa a punto di complessi MP oligomerici superiori^15,18. Tra gli altri, è stato dimostrato il corretto assemblaggio di complessi omooligomerici per il canale ionico KcsA, per la pompa ionica proteorodopsina (PR) e per il trasportatore multifarmaco EmrE^15,18. È probabile che gli MP entrino nella membrana simmetrica del nanodisco da entrambi i lati con una frequenza relativamente uguale. Va pertanto considerato che diversi monomeri o oligomeri inseriti in un nanodisco possono avere orientamenti opposti. Tuttavia, un bias nell'orientamento potrebbe essere causato da meccanismi di inserzione cooperativa come riportato per la formazione di esameri PR e tetrameri KcsA¹⁸. Un'ulteriore distorsione nell'orientamento MP potrebbe derivare da interruttori di orientamento di MP inseriti probabilmente sul bordo delle membrane del nanodisco.

La produzione di lisati CF da ceppi di E. coli è una tecnica di routine affidabile e può essere eseguita in quasi tutti i laboratori biochimici^19,20. Va considerato che, oltre alla formazione di ponti disolfuro, la maggior parte delle altre modifiche post-traduzionali sono assenti se un MP viene sintetizzato usando lisati di E. coli. Sebbene ciò possa generare campioni più omogenei per gli studi strutturali, potrebbe essere necessario escludere potenziali effetti sulla funzione dei singoli bersagli MP. Tuttavia, la produzione efficiente di campioni di alta qualità di recettori accoppiati a proteine G (GPCR)14,21,22^, trasportatori eucariotici 23 o grandi gruppi eteromerici ²⁴ in lisati CF di E. coli indica la loro idoneità anche per bersagli complessi. Le quantità su scala preparativa (≈ 1 mg/ml) di un campione possono essere ottenute con la configurazione senza cella a scambio continuo a due compartimenti (CECF), composta da un compartimento di una miscela di reazione (RM) e da un compartimento di miscela di alimentazione (FM). Il volume FM supera il volume RM da 15 a 20 volte e fornisce un serbatoio di composti energetici a basso peso molecolare e precursori¹⁹. La reazione di espressione viene così estesa per diverse ore e la resa finale del target MP viene aumentata. I compartimenti RM e FM sono separati da una membrana di dialisi con un cutoff di 10-14 kDa. I due compartimenti richiedono un design speciale del contenitore di reazione CECF (Figura 1). Le cassette di dialisi commerciali come contenitori RM in combinazione con contenitori in plexiglass su misura contenenti il FM sono esempi adatti. Le rese MP possono essere ulteriormente manipolate modificando i rapporti RM:FM o scambiando l'FM dopo un certo periodo di incubazione.

La resa e la qualità di un MP richiedono spesso un'intensa ottimizzazione dei parametri di reazione. Un importante vantaggio dell'espressione CF è la possibilità di modificare e mettere a punto quasi tutti i composti in base alle esigenze individuali di un MP. Una strategia semplice consiste nel concentrarsi prima sul miglioramento della resa di un MP stabilendo un protocollo di produzione di base e quindi sull'ottimizzazione della qualità MP regolando le condizioni di reazione e piegatura. L'assenza di processi fisiologici nei lisati CF e la loro ridotta complessità si traducono in alti tassi di successo per la produzione efficiente di MP²⁵. Le considerazioni di routine per la progettazione del modello di DNA e l'ottimizzazione della concentrazione di ioni Mg 2⁺ sono nella maggior parte dei casi sufficienti per ottenere rendimenti soddisfacenti²⁶. A seconda della modalità di espressione, l'ottimizzazione della qualità MP può richiedere molto tempo, poiché è necessario esaminare una maggiore varietà di parametri^14,17,22.

Per stabilire la piattaforma di espressione CF descritta, sono necessari protocolli per la produzione di E. coli CF lisato (i), T7 RNA polimerasi (ii), nanodischi (iii) e composti di reazione CECF di base (iv) (Figura 1). I derivati di E. coli K12 ceppo A19²⁷ o BL21 sono frequentemente utilizzati per la preparazione di lisati efficienti S30 (centrifugazione a 30.000 x g). Oltre ai lisati S30, possono essere utilizzati lisati corrispondenti centrifugati ad altre forze g (ad esempio S12). I lisati differiscono nell'efficienza di espressione e nella complessità del proteoma. Il proteoma del lisato S30 preparato dal protocollo descritto è stato studiato in dettaglio²⁸. Il proteoma S30 contiene ancora alcune proteine residue della membrana esterna che potrebbero dare problemi di fondo durante l'espressione e l'analisi dei canali ionici. Per tali obiettivi, si raccomanda l'uso di lisati S80-S100. Una preziosa modifica durante la preparazione del lisato è l'induzione della risposta SOS mediante shock termico combinato e fornitura di etanolo nella fase di crescita intermedia delle cellule. I lisati HS30 risultanti sono arricchiti in chaperoni e possono essere utilizzati in miscele con lisati S30 per migliorare il ripiegamento MP²². L'espressione di CF in lisati di E. coli è operata come un processo di trascrizione/traduzione accoppiato con modelli di DNA contenenti promotori controllati dalla T7 RNA polimerasi (T7RNAP). L'enzima può essere prodotto in modo efficiente nelle cellule stellari BL21(DE3) che trasportano il plasmide 29 pAR1219.

Due copie di MSP1E3D1 si assemblano in un nanodisco con un diametro di 10-12 nm, ma il protocollo descritto di seguito può funzionare anche per altri derivati MSP. Tuttavia, i nanodischi più grandi di quelli formati con MSP1E3D1 tendono ad essere meno stabili, mentre i nanodischi più piccoli formati con derivati MSP come MSP1 potrebbero non ospitare MP o complessi MP più grandi. I nanodischi MSP1E3D1 possono essere assemblati in vitro con una grande varietà di lipidi o miscele lipidiche diverse. I nanodischi preformati sono generalmente stabili per > 1 anno a -80 °C, mentre la stabilità può variare per diversi componenti lipidici. Per lo screening degli effetti lipidici sul ripiegamento e sulla stabilità di un MP, è necessario preparare un set completo di nanodischi assemblati con una varietà rappresentativa di miscele lipidiche / lipidiche. I seguenti lipidi possono dare una buona selezione di partenza: 1,2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerolo) (DMPG), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), 1,2 dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-rac-(1-glicerolo) (DOPG), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerolo) (POPG) e 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC).

Viene descritto un protocollo per la preparazione di una reazione CECF da 3 ml. È possibile un ulteriore ridimensionamento verso l'alto o verso il basso in un rapporto 1:1. Per la configurazione CECF a due compartimenti, devono essere preparati un RM contenente tutti i composti e un FM contenente solo i composti a basso peso molecolare. I dispositivi commerciali per dialisi da 3 mL con MWCO da 10-14 kDa possono essere utilizzati come contenitori RM, che vengono poi collocati in contenitori in plexiglass personalizzati contenenti FM (Figura 1D)³⁰. Il rapporto RM:FM è 1:20, quindi 60 mL di FM devono essere preparati per 3 mL RM. La qualità, la concentrazione o il tipo di diversi componenti possono essere critici per la resa finale e/o la qualità del MP sintetizzato (Tabella 1). I modelli di DNA devono essere preparati secondo le linee guida pubblicate e l'ottimizzazione del codone del frame di lettura del bersaglio può migliorare ulteriormente significativamente la resa del prodotto²⁶. Per la reazione CECF su scala preparativa, viene descritto un protocollo stabilito per la produzione di PR. Per stabilire protocolli di espressione per i nuovi MP, di solito è necessario eseguire schermate di ottimizzazione di alcuni composti (Tabella 1) per migliorare la resa e la qualità. Per gli ioni Mg²⁺ , esiste un ottimale di concentrazione ben focalizzato che spesso mostra variazioni significative per diversi modelli di DNA. Altri composti di reazione CF come nuovi lotti di lisati T7RNAP o S30 possono spostare ulteriormente la concentrazione ottimale di Mg²⁺ . Ad esempio, viene descritto un tipico schermo Mg 2+ nell'intervallo di concentrazione di^14-24 mM e in incrementi di 2 mM. Ogni concentrazione viene sottoposta a screening in duplicati e in reazioni CECF su scala analitica. Come contenitore di reazione CECF, i contenitori in plexiglas Mini-CECF su misura³⁰ che contengono l'RM vengono utilizzati in combinazione con micropiastre standard a 24 pozzetti che contengono l'FM (Figura 1B). In alternativa, possono essere utilizzate cartucce per dialisi commerciali in combinazione con micropiastre a pozzetti profondi 96 o altri dispositivi dializzatori commerciali in configurazioni appropriate (Figura 1C).

Protocollo

1. Preparazione del lisato S30

1. Giorno 1: Striare le cellule dalle scorte di glicerolo su una piastra di agar LB e incubare a 37 °C durante la notte.
2. Giorno 2: Inoculare 200 mL di terreno LB con le cellule della piastra di agar e incubare a 37 °C per 12-14 ore.
3. Giorno 3: Inoculare 10 L di terreno YPTG sterile (10 g/L di estratto di lievito, 16 g/L di triptone, 5 g/L di NaCl, 19,8 g/L di glucosio, 4,4 mM KH 2 PO 4, 8 mM K₂HPO₄) temperato a 37 °C in un reattore a serbatoio agitato da 15 L con 100 mL di precoltura (1:100). Coltivare a 37 °C, 500 giri/min e alta aerazione (~ 3 volumi d'aria al minuto). Per evitare un'eccessiva formazione di schiuma, aggiungere antischiuma sterile.
4. Misurare la densità ottica (OD) a 600 nm a intervalli di tempo regolari. Dopo circa 2 ore la coltura entrerà nella fase logaritmica.
5. Modifica per HS30 lisato: Quando le cellule sono in fase intermedia (OD600 ≈ 3,6-4,2) aggiungere 300 ml di etanolo al terreno di coltura e procedere alla coltivazione a 42 °C, 500 giri/min e alta aerazione (circa 3 volumi d'aria al minuto) per altri 45 minuti. Quindi procedere con il raffreddamento e la raccolta della coltura cellulare come descritto al punto 1.6. Per la produzione di lisato S30 standard, saltare questo passaggio e procedere con il passaggio 1.6.
6. Quando le celle sono in fase intermedia (OD600 ≈ 3,6-4,2), raffreddare il fermentatore sotto i 20 °C entro < 30 minuti. L'OD600 finale dovrebbe essere di circa 4,5-5,5. Raccogliere le celle a 4.500 x g per 20 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante. Mantenere le celle a 4 °C durante i passaggi successivi.
   NOTA: Durante il raffreddamento, può verificarsi un'eccessiva formazione di schiuma. In questo caso, aggiungere antischiuma o ridurre la velocità di agitazione e / o diminuire il flusso d'aria nel bioreattore.
7. Sospendere completamente le celle in 300 mL di tampone S30-A (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KCl, 6 mM 2-mercaptoetanolo) utilizzando una spatola seguita da pipettare la sospensione su e giù fino all'omogeneità. Centrifugare a 8.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Ripetere questo passaggio due volte.
   ATTENZIONE: il 2-mercaptoetanolo è tossico. Evitare il contatto con la pelle o il tratto respiratorio. Se possibile, lavora sotto un cofano. Pesare il becher della centrifuga vuoto prima dell'ultima fase di lavaggio. Dopo la centrifugazione, pesare il pellet a celle umide e procedere con il punto 1.8 o conservare il pellet fino a un ulteriore utilizzo.
   NOTA: Il peso del pellet a cellule umide è di 5-7 g per coltura di bioreattore da 1 L. A questo punto il protocollo può essere messo in pausa e il pellet può essere congelato in azoto liquido e conservato a -80 °C per 4-8 settimane.
8. Sospendere accuratamente le cellule in 1,1 volumi (1 g = 1 mL) di tampone S30-B (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)₂, 60 mM KOAc, 1 mM DTT, 1 compressa di inibitore della proteasi cOmplete). Riempire la sospensione in una cella di pressione francese pre-raffreddata e interrompere le celle a 1.000 psig. Passare le celle attraverso la stampa francese una volta.
9. Centrifugare il lisato a 30.000 x g per 30 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in un tubo nuovo e ripetere la fase di centrifugazione.
   NOTA: Dopo la prima centrifugazione può essere presente uno strato sciolto e viscido sulla parte superiore del pellet, che non deve essere trasferito con il surnatante.
10. Applicare un alto livello di sale e calore per rimuovere i componenti di lisato instabili e rilasciare l'mRNA dai ribosomi. Regolare il lisato a 0,4 M NaCl e incubare a 42 °C per 45 minuti a bagnomaria.
    NOTA: questo passaggio causerà una significativa formazione di precipitati. Capovolgere o capovolgere il tubo durante l'incubazione di volta in volta.
11. Trasferire la sospensione torbida (di solito 50-80 ml) in tubi di dialisi con un cutoff di 10-14 kDa e dializzarli contro tampone S30-C da 5 L (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)₂, 60 mM KOAc, 0,5 mM DTT). Sostituire il tampone di dialisi S30-C dopo 2-3 ore e dializzarlo per altre 12-14 ore.
12. Giorno 4: Trasferire la sospensione dializzata in provette da centrifuga e centrifugare a 30.000 x g per 30 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante (lisato S30) in provette fresche da 50 mL e mescolare delicatamente. La concentrazione proteica del lisato deve essere di circa 30-40 mg/ml. Aliquote di surgelazione (ad es. 0,5 ml, 1 ml) in azoto liquido e conservare a -80 °C. Le aliquote sono stabili per > 1 anno.

2. Espressione e purificazione della T7 RNA polimerasi

1. Giorno 1: Inoculare 200 mL di terreno LB contenente 100 μg/mL di ampicillina con cellule BL21(DE3) Star x pAR1219 appena placcate e incubare a 37 °C e 180 rpm per 12-16 ore.
2. Giorno 2: Inoculare 1 L di brodo formidabile (12 g/L di triptone, 24 g/L di estratto di lievito, 4 mL/L di glicerolo) in un matraccio da 2 L con 10 mL di precoltura e incubare a 37 °C e agitare a 180 giri/min. L'OD600 iniziale dovrebbe essere intorno a 0,1.
3. Quando l'OD600 raggiunge 0,6-0,9, aggiungere IPTG a una concentrazione finale di 1 mM per indurre l'espressione di T7RNAP e continuare la coltivazione per altre 5 ore.
4. Raccogliere le celle mediante centrifugazione a 4.500 x g per 20 minuti a 4 °C. Congelare le celle in azoto liquido e conservare a -80 °C.
   NOTA: il protocollo potrebbe essere messo in pausa qui.
5. Giorno 3: Aggiungere 30 mL di tampone di sospensione ghiacciato (30 mM Tris-HCl, pH 8,0 con una compressa di inibitore della proteasi cOmple) al pellet cellulare congelato e scongelare il pellet a bagnomaria a temperatura ambiente. Quindi, sospendere il pellet pipettando su e giù fino all'omogeneità.
6. Eseguire l'interruzione delle cellule utilizzando una pressa francese come descritto nella sezione precedente o utilizzare un dispositivo di sonicazione secondo le raccomandazioni del produttore. Successivamente, centrifugare a 20.000 x g per 30 minuti a 4 °C e trasferire il surnatante in una provetta fresca.
7. Per precipitare il DNA genomico, aggiungere streptomicina solfato lentamente e sotto delicata agitazione al surnatante fino a raggiungere una concentrazione finale del 3% (p/v). Incubare a 4 °C per 5-10 minuti agitando delicatamente. Centrifugare a 20.000 x g per 30 minuti a 4 °C.
8. Filtrare il surnatante con un filtro da 0,45 μm e caricarlo su una colonna Q-Sepharose con un volume di colonna (CV) di 40 mL equilibrato con tampone di equilibrio 2 CV (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5% glicerolo e 10 mM 2-mercaptoetanolo) utilizzando una pompa peristaltica ad una portata di 4 mL/min. Quindi, collegare la colonna a un rilevatore UV e continuare l'eluizione con buffer di equilibrio fino a quando il segnale UV a 280 nm raggiunge una linea di base stabile.
9. Eluire T7RNAP con un gradiente da 50 mM a 500 mM NaCl per CV ad una portata di 3 mL/min. Raccogliere 1 mL di frazioni e preparare i campioni per l'analisi SDS-PAGE miscelando 10 μL di ciascuna frazione con 2 x tampone campione SDS. Eseguire SDS-PAGE e colorare il gel con Coomassie Blue R. T7RNAP dovrebbe apparire come una banda prominente a circa 90 kDa insieme a numerose bande aggiuntive di impurità.
10. Frazioni di pool contenenti T7RNAP e dializzazione utilizzando membrane con un MWCO di 12-14 kDa per 12-16 h in tampone di dialisi (10 mM K 2 HPO 4/KH₂PO₄, pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT, glicerolo 5% (p/v).
11. Giorno 4: Raccogliere la soluzione di T7RNAP e concentrare utilizzando unità filtranti con 12-14 MWCO fino a una concentrazione finale di 3-10 mg/ml. T7RNAP può iniziare a precipitare durante la concentrazione. Arrestare immediatamente la concentrazione non appena si verifica torbidità nel campione. Aggiungere il glicerolo ad una concentrazione finale del 50% (p/v) e mescolare delicatamente. Congelare 0,5-1 mL aliquote e conservare a -80 °C. Le aliquote T7RNAP funzionanti possono essere conservate a -20 °C.
    NOTA: Circa 20-40 ml di T7RNAP parzialmente purificato da 5 mg/ml con 20.000-40.000 unità devono essere ottenuti da una fermentazione di 1 L. Per testare la quantità ottimale di ciascun lotto di T7RNAP, devono essere eseguite reazioni di espressione CF della proteina fluorescente verde (GFP) contenente 0,02 mg/mL-0,1 mg/ml del campione T7RNAP preparato.

3. Espressione e purificazione di MSP1E3D1

1. Giorno 1: Trasformare le cellule stellari di E. coli BL21 (DE3) con il vettore pET28(a)-MSP1E3D1³¹ utilizzando protocolli standard di trasformazione da shock termico o elettroporazione. Striare o trasformare le cellule su agar LB contenente 30 μg/mL di kanamicina e incubare a 37 °C per 12-16 ore.
2. Giorno 2: Inoculare 200 mL di terreno LB integrato con glucosio allo 0,5% (p/v) e 30 μg/mL di kanamicina con una singola colonia prelevata dalla piastra di agar e incubare a 37 °C a 180 giri/min per 12-16 ore.
3. Giorno 3: Inoculare 10 L LB terreno integrato con 0,5% (p/v) di glucosio e 30 μg/mL di kanamicina con 100 mL di pre-coltura in un bioreattore a serbatoio agitato. Condurre la fermentazione a 37 °C, 500 rpm e aerazione di circa 3 volumi di bioreattore al minuto. In caso di formazione eccessiva di schiuma, aggiungere antischiuma.
   NOTA: Al posto del fermentatore possono essere utilizzati palloni agitatori sconcertati.
4. A OD600 di 6,5-7,5, aggiungere IPTG ad una concentrazione finale di 1 mM e continuare l'incubazione a 37 °C per 1 ora. Raccogliere le celle mediante centrifugazione a 4.500 x g per 20 minuti a 4 °C. Lavare i pellet con 200 mL di NaCl allo 0,9% (p/v) e centrifugare nuovamente a 8.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e trasferire le cellule in provette da 50 mL usando una spatola. Il peso previsto del pellet umido è di 8-12 g per L di coltura di bioreattori. Congelare i pellet in azoto liquido e conservare a -80 °C fino a ulteriore utilizzo.
   NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.
5. Giorno 4: Per la purificazione, scongelare i pellet cellulari a bagnomaria a RT. Sospendere le cellule in tampone MSP-A (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1% (p/v) Triton X-100, 1 compressa di cocktail di inibitori della proteasi c0mplete per 50 mL di sospensione cellulare) per ottenere una sospensione cellulare del 30-40% (p/v).
6. Interrompere le cellule mediante sonicazione o utilizzando una pressa francese e centrifuga a 30.000 x g per 30 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in un tubo fresco e filtrare attraverso un filtro da 0,45 μm. Applicare il filtrato su una colonna di acido nitrilotriacetico caricata con Ni²⁺ (CV > 15 mL) equilibrata con 5 CV di tampone MSP-B (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1% (p/v) Triton X-100) utilizzando una pompa peristaltica.
   NOTA: Per facilitare la filtrazione, il surnatante può essere sonicato per un altro minuto per abbattere grandi frammenti di DNA.
7. Dopo il caricamento del campione, lavare la colonna con 5 CV MSP-B, 5 CV MSP-C (40 mM Tris-HCl, pH 8,9, 300 mM NaCl, 50 mM acido colico), 5 CV MSP-D (40 mM Tris-HCl, pH 8,9, 300 mM NaCl), 5 CV MSP-E (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl) e 5 CV MSP-F (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 50 mM imidazolo).
   NOTA: L'acido colico nel tampone MSP-C è importante per rimuovere i lipidi attaccati all'MSP. L'acido colico non è completamente solubile a bassi valori di pH. Il valore del pH deve quindi essere regolato a 8,9 in MSP-C e MSP-D. È importante lavare la colonna con tampone MSP-D, poiché un pH più basso potrebbe causare la precipitazione dell'acido colico residuo e bloccare o danneggiare la colonna.
8. Eluire MSP con MSP-G (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 300 mM imidazolo). Raccogliere frazioni di 1 mL e monitorare l'assorbimento UV a 280 nm. Raccogliere e raggruppare le frazioni del picco di eluizione.
9. Trasferire frazioni MSP aggregate in tubi a membrana per dialisi MWCO da 12-14 kDa e dializzarli contro 5 L di MSP-H (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, glicerolo 10% (p/v) per 2-3 ore a 4 °C. Passare a tampone MSP-H fresco da 5 L e dializzare per altre 12-16 ore a 4 °C.
10. Giorno 5: Trasferire la soluzione di MSP in provette da centrifuga e centrifugare a 18.000 x g per 30 minuti a 4 °C per rimuovere il precipitato. Trasferire il surnatante in un tubo fresco e concentrarsi a 200-800 μM utilizzando dispositivi di ultrafiltrazione con MWCO da 12-14 kDa a 4 °C. Misurare la concentrazione utilizzando un dispositivo di misurazione UV/VIS. Utilizzare il coefficiente di estinzione di 27,31 M-1 ^cm-1 e la massa molecolare di 31,96 kDa per il calcolo della concentrazione.
    NOTA: L'espressione in un bioreattore di solito produce 15-30 mg di coltura MSP1E3D1 per L.
11. Aliquote di surge-congelamento della soluzione concentrata di MSP in azoto liquido e conservare a -80 °C.

4. Assemblaggio di nanodischi MSP1E3D1

1. Giorno 1: Preparare 1-2 mL di 50 mM di scorte lipidiche (DMPG, DOPG, POPG DMPC, DOPC o POPC) in 100 mM di colato di sodio. Conservare a -20 °C se non utilizzato lo stesso giorno.
   NOTA: La soluzione lipidica deve essere limpida. Se la soluzione non è limpida, la concentrazione di colato di sodio può essere aumentata a 150 mM.
2. Mescolare la soluzione MSP1E3D1 con la soluzione lipidica. Aggiungere dodecilfosfocolina (DPC) ad una concentrazione finale di 0,1% (p/v). Le reazioni di assemblaggio possono essere regolate a volumi finali di 3 mL (Tabella 2) o 12 mL corrispondenti a volumi tipici di cassette di dialisi (10 kDa MWCO). Incubare le reazioni di assemblaggio per 1 ora a 21 °C sotto delicata agitazione.
   NOTA: Per ogni lipide, è necessario utilizzare uno specifico rapporto MSP1E3D1:lipidi per garantire una preparazione omogenea del nanodisco (Tabella 2). Per i nuovi lipidi o miscele lipidiche, il rapporto ottimale deve essere determinato con un esperimento pilota e un'analisi cromatografica di esclusione dimensionale¹⁴.
3. Pre-bagnare la membrana di una cassetta di dialisi con tampone per formazione del disco (DF) (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl). Trasferire la miscela di assemblaggio nella cassetta di dialisi con una siringa. Le potenziali bolle d'aria possono essere rimosse mediante aspirazione utilizzando la siringa.
4. Giorni 1-4: Dialisi contro 3 tampone DF da 5 L per 10-20 ore a RT sotto agitazione usando una barra di agitazione. Quindi trasferire la miscela di assemblaggio dalla cassetta di dialisi in unità filtranti centrifughe con MWCO da 10 kDa equilibrati con tampone DF. Concentrato a 4.000 x g a 4 °C.
   NOTA: Una miscela di dialisi torbida potrebbe indicare un rapporto stechiometrico errato di MSP:lipid. Il precipitato deve essere rimosso a 18.000 x g per 20 minuti a 4 °C prima della concentrazione del campione. Per evitare precipitazioni durante la concentrazione del campione, utilizzare unità di ultrafiltrazione con un grande deadstop.
5. Concentrare i nanodischi assemblati ad una concentrazione di almeno 300 μM. Misurare la concentrazione utilizzando un lettore UV/VIS. Si consideri che un nanodisco è formato da due molecole MSP1E3D1 e quindi, la concentrazione di MSP deve essere divisa per 2 per determinare la corretta quantità di nanodischi.
   NOTA: La configurazione descritta (Tabella 2) produrrà 0,6-1 mL di una soluzione di nanodisco da 300 μM.
6. Centrifugare la preparazione concentrata di nanodischi a 18.000 x g per 20 minuti a 4 °C per rimuovere il precipitato. Quindi, aspirare il surnatante e congelare 50 μL aliquote in azoto liquido e conservare a -80 °C.
   NOTA: Si consiglia di valutare il successo della formazione di nanodischi utilizzando la cromatografia ad esclusione dimensionale. Il campione deve essere monodisperso e deve contenere solo una bassa quantità di aggregati. Gli aggregati indicano che la quantità di lipidi nella configurazione è troppo alta. Come riferimento, è possibile utilizzare MSP1E3D1 purificato. Se la preparazione del nanodisco mostra un picco all'altezza del picco di riferimento MSP1E3D1, il rapporto lipidico/MSP1E3D1 scelto era troppo basso.

5. Scala preparativa 3 mL CECF impostazione della reazione

1. Giorno 1: Preparare tutte le soluzioni madre necessarie come indicato (Tabella 3). Le scorte vengono conservate a -20 °C e scongelate a temperatura ambiente. Assicurati di miscelare accuratamente tutti i materiali dopo lo scongelamento e prima del pipettaggio. Calcolare i volumi richiesti per tutti gli stock e creare uno schema di pipettaggio (tabella 4). I composti ad alto peso molecolare saranno aggiunti solo nella RM. Per i composti a basso peso molecolare, è possibile preparare un mastermix combinato 3 x per RM e FM.
   NOTA: i volumi finali delle miscele composte potrebbero essere inferiori a quelli calcolati a causa della perdita di volume durante la miscelazione. Questo può essere evitato aggiungendo un volume in eccesso del 2-5% per compensare la perdita di volume.
2. Equilibrare la membrana di una cassetta di dialisi da 3 mL in 100 mM di tris-acetato, pH 8,0. Assicurarsi di rimuovere il buffer in eccesso.
3. Usare una siringa per trasferire la RM nella cassetta di dialisi. Rimuovere l'aria in eccesso nello scomparto RM mediante aspirazione con la siringa. Posizionare la cassetta di dialisi nella camera di dialisi.
4. Riempire la camera di dialisi con 60 ml di FM. Posizionare il coperchio sulla camera e stringere le viti per fissarlo. Incubare la camera per 12-16 h a 30 °C a 200 giri/min.
   NOTA: Assicurarsi che la camera rimanga in posizione verticale durante l'agitazione, altrimenti lo scambio di composti a basso peso molecolare sarà ostacolato.
5. Giorno 2: Utilizzando una siringa, aspirare la RM dalla camera di dialisi. Trasferire l'RM in provette fresche e centrifugare a 16.000 x g a 4 °C per 10 minuti per rimuovere il precipitato. Trasferire il surnatante in provette fresche. La proteina nel surnatante può ora essere ulteriormente analizzata.
   NOTA: In alcuni casi, un pellet sarà presente dopo la centrifugazione. Questo può fornire importanti informazioni sull'idoneità dei nanodischi analizzati o dei composti di reazione per mantenere solubile l'MP sintetizzato. Si consiglia quindi di analizzare la quantità di target potenzialmente presente nel precipitato utilizzando SDS-PAGE, Western Blot, o mediante valutazione visiva della dimensione del pellet.

6. Scala analitica 60 μL CECF impostazione della reazione per lo screening ionico Mg²⁺

1. Giorno 1: Mescolare tutti i componenti del rispettivo master mix 3x e distribuire 60 μL all'RM e 825 μL all'FM. Riempire FM con H₂O e mescolare FM mediante vortexing. Trasferire FM in 3 pozzetti della micropiastra da 24 pozzetti (Tabella 5).
   NOTA: Poiché il contenitore Mini-CECF personalizzato potrebbe non essere accessibile, i volumi nella Tabella 5 sono calcolati per una reazione effettuata in cartucce di dialisi (10-14 kDa MWCO, RM: 100 μL) con un volume FM di 1,7 mL in 96 piastre a pozzetto profondo (2 ml) (Figura 1).
2. Tagliare i tubi di dialisi di cellulosa rigenerata con un MWCO da 10-14 kDa in pezzi di dimensioni circa 25 x 20 mm e conservare in H₂O con azide di sodio allo 0,05% (p/v).
   ATTENZIONE: L'azoturo di sodio è molto tossico. Evitare qualsiasi contatto con la pelle o le mucose. Non utilizzare contenitori metallici poiché l'azoturo di sodio può reagire con i metalli per formare azoturi metallici esplosivi.
3. Prima dell'assemblaggio del contenitore Mini-CECF, rimuovere l'H₂O eccessivo dalle membrane di dialisi con un tessuto. Posizionare un pezzo di membrana su ciascun contenitore e fissare le membrane con un anello di politetrafluoretilene.
4. Trasferire il contenitore Mini-CECF nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti con 825 μL di FM. Evitare bolle d'aria sotto la membrana di dialisi del contenitore Mini-CECF.
5. Aggiungere componenti ad alto peso molecolare alla RM come descritto (Tabella 5) e mescolare mediante pipettaggio su e giù. Aggiungere 60 μL al contenitore di reazione. Evitare bolle d'aria durante il trasferimento della soluzione viscosa.
6. Tagliare 2 fogli di 8 x 10 cm di un film termoplastico sigillante e avvolgerli attorno alla piastra a 24 pozzetti con all'interno i contenitori di reazione. Ciò ridurrà l'evaporazione dalla miscela di reazione. Ora posiziona il coperchio della piastra di coltura cellulare sulla piastra e fissalo con del nastro adesivo. Incubare la piastra a 30 °C e agitare 200 giri/min per 12-16 h.
7. Giorno 2: Raccogliere la miscela di reazione perforando la membrana di dialisi con la punta del pipet nel contenitore Mini-CECF e aspirare la RM. Trasferire RM in tubi freschi e centrifugare a 16.000 x g a 4 °C per 10 minuti per rimuovere i precipitati. Trasferire il surnatante in provette fresche. La proteina nel surnatante può ora essere ulteriormente analizzata.
   NOTA: In alcuni casi, dopo la centrifugazione sarà presente un pellet. Ciò può fornire importanti informazioni sull'idoneità dei nanodischi analizzati o di altri composti di reazione per mantenere solubile l'MP sintetizzato. Si consiglia quindi di analizzare la quantità di target potenzialmente presente nel precipitato mediante SDS-PAGE, Western Blot, o valutazione visiva della dimensione del pellet.

Risultati

L'impatto dei composti di reazione di messa a punto sulla resa finale o sulla qualità dei MP sintetizzati è esemplificato. Un approccio di routine frequente è quello di regolare la concentrazione ottimale di Mg²⁺ nelle reazioni CF mediante l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP) come un comodo monitor dell'efficienza del sistema. Ad esempio, la GFP è stata sintetizzata da un vettore pET-21a (+) a concentrazioni di Mg 2+ comprese tra 14 e²⁴ mM (Figura 2...

Discussione

Vengono descritti il setup e le strategie per ottimizzare l'espressione CF e l'inserimento co-traduttivo di MP funzionali nei nanodischi. L'attrezzatura necessaria comprende un bioreattore, un dispositivo di pressatura francese o simile, un lettore UV / VIS e fluorescenza, recipienti di reazione CF adatti per una configurazione a due compartimenti e un incubatore a temperatura controllata. Ulteriori attrezzature standard sono centrifughe per la raccolta di cellule di E. coli e centrifughe da tavolo che raggiungo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG)	Avanti Polar Lipids (USA)	840445P
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids (USA)	850345C
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC)	Avanti Polar Lipids (USA)	850375C
1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG)	Avanti Polar Lipids (USA)	840475C
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids (USA)	850457C
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG)	Avanti Polar Lipids (USA)	840034C
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris)	Carl Roth (Germany)	4855
2-Mercaptoethanol	Carl Roth (Germany)	4227
2-Propanol	Carl Roth (Germany)	9781
[3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride	American Radiolabeled Chemicals (USA)	ART0134
Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP)	Merck (Germany)	1409
Adenosine 5’-triphosphate (ATP)	Sigma Aldrich (Germany)	A9251
Alprenolol hydrochloride	Merck (Germany)	A0360000
Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose®	Sigma-Aldrich (Germany)	Q1126
Autoclave Type GE 446EC-1	Gettinge (Germany)
Bioreactor Type 884 124/1	B.Braun (Germany)
Centrifuge	Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)
Cholic acid	Carl Roth (Germany)	8137
Coomassie Brilliant Blue R250	Carl Roth (Germany)	3862
Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks	Schott Duran (Germany)
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt	Sigma-Aldrich (Germany)	C1506
D-glucose monohydrate	Carl Roth (Germany)	6780
Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate	Carl Roth (Germany)	6878
Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing	Fisher Scientific (Germany)	8700152
Dithiothreit	Carl Roth (Germany)	6908
Ethanol	Carl Roth (Germany)	K928
Folinic acid calcium salt hydrate	Sigma-Aldrich (Germany)	47612
French pressure cell disruptor	SLM; Amico Instruments (USA)
Glycerol	Carl Roth (Germany)	3783
Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP)	Sigma-Aldrich (Germany)	G8877
Hydrochloric Acid	Carl Roth (Germany)	K025
IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL	GE Life Sciences (Germany)	GE17-5248
Imidazole	Carl Roth (Germany)	3899
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)	Carl Roth (Germany)	2316
Kanamycin	Carl Roth (Germany)	T832
L-Alanine	Carl Roth (Germany)	3076.1
L-Arginine	Carl Roth (Germany)	6908
L-Asparagine	Carl Roth (Germany)	HN23
L-Aspartic Acid	Carl Roth (Germany)	T202
L-Cysteine	Carl Roth (Germany)	T203
L-Glutamic Acid	Carl Roth (Germany)	3774
L-Glutamine	Carl Roth (Germany)	3772
L-Glycine	Carl Roth (Germany)	3187
L-Histidine	Carl Roth (Germany)	3852
L-Isoleucine	Carl Roth (Germany)	3922
L-Leucine	Carl Roth (Germany)	1699
L-Lysine	Carl Roth (Germany)	4207
L-Methionine	Carl Roth (Germany)	9359
L-Proline	Carl Roth (Germany)	1713
L-Phenylalanine	Carl Roth (Germany)	1709
L-Serine	Carl Roth (Germany)	4682
L-Threonine	Carl Roth (Germany)	1738
L-Tryptophane	Carl Roth (Germany)	7700
L-Tyrosine	Carl Roth (Germany)	T207
MD100 dialysis units	Scienova (Germany)	40077
N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES)	Carl Roth (Germany)	6763
n-dodecylphosphocholine	Antrace (USA)	F308S
PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell	Biorad (Germany)
PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems	Biorad (Germany)
PAGE gel power supply: Power Pac 3000	Biorad (Germany)
Tryptone/peptone from caseine	Carl Roth (Germany)	6681
Peristaltic pump: ip-12	Ismatec (Germany)
Phosphoenol pyruvate monopotassium salt	Sigma Aldrich (Germany)	860077
Potassium dihydrogen phosphate	Carl Roth (Germany)	P018
Potassium acetate	Carl Roth (Germany)	4986
Potassium chloride	Carl Roth (Germany)	6781
Pyruvate Kinase	Roche (Germany)	10109045001
Scintillation counter: Hidex 300 SL	Hidex (Finland)
SDS pellets	Carl Roth (Germany)	8029
Sodium azide	Sigma-Aldrich (Germany)	K305
Sodium chloride	Carl Roth (Germany)	P029
Spectrophotometer Nanodrop	Peqlab (Germany)
Spectrophotometer/fluorescence reader Spark®	Tecan (Switzerland)
tRNA (E. coli)	Roche (Germany)	10109550001
Ultra sonificator	Labsonic U, B. Braun (Germany)
Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP)	Sigma-Aldrich (Germany)	U6625
Y-30 antifoam	Sigma-Aldrich (Germany)	A6457
Yeast extract	Carl Roth (Germany)	2904