Membran Proteinlerinin Önceden Oluşturulmuş Nanodisklere Ko-Translasyonel Olarak Yerleştirilmesi

Özet

Önceden oluşturulmuş nanodisklere birlikte translasyonel yerleştirme, tanımlanmış lipit ortamlarında deterjanlarla temas etmeden hücresiz sentezlenmiş membran proteinlerinin incelenmesini mümkün kılar. Bu protokol, temel sistem bileşenlerinin hazırlanmasını ve ifade verimliliğini ve numune kalitesini artırmak için kritik parametreleri açıklar.

Özet

Hücresiz ekspresyon sistemleri, membran proteinleri gibi karmaşık proteinlerin bile işlevsel katlanmasını desteklemek için reaksiyon ortamlarının özel tasarımına izin verir. Membran proteinlerinin nanodiskler olarak tedarik edilen önceden oluşturulmuş ve tanımlanmış membranlara ko-translasyonel olarak yerleştirilmesi ve katlanması için deneysel prosedürler gösterilmiştir. Protokol tamamen deterjansızdır ve bir gün içinde miligram saflaştırılmış numune üretebilir. Elde edilen membran proteini / nanodisk örnekleri, çeşitli fonksiyonel çalışmalar ve kristalizasyon, nükleer manyetik rezonans veya elektron mikroskobu gibi yapısal uygulamalar için kullanılabilir. Hücresiz lizatlar, tasarlanmış membranlı nanodiskler, kritik stok çözeltileri ve iki bölmeli hücresiz ekspresyon reaksiyonlarının montajı gibi temel anahtar bileşenlerin hazırlanması açıklanmaktadır. Membran proteinlerinin katlanma gereksinimleri çok çeşitli olabileceğinden, bu protokolün ana odak noktası, kritik temel reaksiyon bileşikleri, nanodisklerin membran bileşimi, redoks ve şaperon ortamı veya DNA şablon tasarımı gibi numune kalitesi için önemli olan parametrelerin ve reaksiyon adımlarının modülasyonudur. Tüm süreç proteorhodopsin ve bir G-protein eşleşmiş reseptör sentezi ile gösterilmiştir.

Giriş

Membran proteinleri (MPS), sulu ortamlarda çözünmemeleri nedeniyle protein üretim çalışmalarında zorlu hedeflerdir. Geleneksel MP üretim platformları, E. coli, maya veya ökaryotik hücreler gibi hücre tabanlı sistemlerden oluşur. Sentezlenen rekombinant milletvekilleri ya hücre zarlarından ekstrakte edilir ya da inklüzyon cisimciklerinden yeniden katlanır¹. Deterjan çözünürlüğünden sonra milletvekilleri, in vitro sulandırma protokolleri oluşturularak uygun membran ortamlarına aktarılabilir. Veziküller ve lipozomların yanı sıra, nanodiskler² veya salipro³ parçacıkları şeklinde düzlemsel membranlara MP resuentasyonu son zamanlarda rutin teknikler haline gelmiştir. Bununla birlikte, tüm bu stratejiler, milletvekilleriyle deterjan temasının istikrarsızlaşmaya, oligomerlerin ayrışmasına ve hatta protein yapısının ve aktivitesinin kaybına neden olabileceği anlamına^{gelir 4}. Bu nedenle optimum deterjan çözünürlüğü ve sulandırma koşullarının taranması sıkıcı ve zaman alıcı olabilir⁵.

Hücresiz (CF) sistemlerin açık doğası, ekspresyon reaksiyonunun, tanımlanmış bir lipit bileşimine sahip önceden oluşturulmuş membranlarla doğrudan sağlanmasını sağlar. Bu lipit bazlı ekspresyon modunda (L-CF), sentezlenmiş milletvekilleri, sağlanan çift katmanlı ^6,7'ye birlikte translasyonel olarak ekleme fırsatına sahiptir (Şekil 1). Düzlemsel lipid çift katmanlı disk^8'i çevreleyen bir membran iskele proteininden (MSP) oluşan nanodiskler, bu strateji ^9,10 için özellikle uygun görünmektedir. Nanodiskler rutin olarak çeşitli farklı lipitlerle in vitro olarak monte edilebilir, çok kararlıdırlar ve stoklar 1 mM'ye kadar konsantre edilebilir. Bununla birlikte, E. coli'de MSP ekspresyonu ve saflaştırılması gereklidir. Alternatif bir strateji olarak MSP, lipozomlarla beslenen KF reaksiyonlarında hedef MP ile birlikte eksprese edilebilir^11,12,13. Hem MSP hem de MP için DNA şablonları reaksiyona eklenir ve ifade üzerine MP / nanodiskler oluşabilir. MSP üretiminden kaçınılırken, birlikte ekspresyon stratejisi, nihai DNA şablon konsantrasyonlarının dikkatli bir şekilde ince ayarlanmasını gerektirir ve numune üretiminin verimliliğinde daha yüksek varyasyonlar beklenebilir.

Milletvekillerinin önceden oluşturulmuş nanodisklerin zarlarına ko-translasyonel olarak eklenmesi, translokon makinelerinden ve sinyal dizileri^{13,14,15,16'dan} bağımsız^, fizyolojik olmayan ve hala büyük ölçüde bilinmeyen bir mekanizmadır. Yerleştirme etkinliğinin başlıca belirleyicileri, membran proteininin tipi ve sağlanan membranın lipit bileşimidir ve negatif yüklü lipitler için sıklıkla tercih edilir^15,17. Nanodisk membranları nispeten sınırlı boyuttadır, MP yerleştirme¹⁸ üzerine önemli miktarda lipit salınır. Nanodisk boyutunun değişimi, daha yüksek oligomerik MP komplekslerinin ^15,18'in yerleştirilmesini ve ayarlanmasını sağlar. Diğerlerinin yanı sıra, iyon kanalı KcsA, iyon pompası proteorhodopsin (PR) ve çoklu ilaç taşıyıcı EmrE^15,18 için homooligomerik komplekslerin doğru montajı gösterilmiştir. Milletvekillerinin simetrik nanodisk membranına her iki taraftan da nispeten eşit frekansta girmeleri muhtemeldir. Bu nedenle, bir nanodiske yerleştirilen farklı monomerlerin veya oligomerlerin zıt yönelimlere sahip olabileceği düşünülmelidir. Bununla birlikte, oryantasyondaki bir önyargı, PR hexamers ve KcsA tetramerlerinin oluşumu için bildirilen işbirlikçi yerleştirme mekanizmalarından kaynaklanabilir¹⁸. MP oryantasyonundaki başka bir önyargı, muhtemelen nanodisk membranlarının kenarına yerleştirilmiş MP'lerin oryantasyon anahtarlarından kaynaklanabilir.

E. coli suşlarından CF lizat üretimi güvenilir bir rutin tekniktir ve hemen hemen her biyokimyasal laboratuvarda gerçekleştirilebilir^19,20. Disülfit köprü oluşumunun yanı sıra, bir MP'nin E. coli lizatları kullanılarak sentezlenmesi durumunda, diğer birçok çeviri sonrası modifikasyonun bulunmadığı düşünülmelidir. Bu, yapısal çalışmalar için daha homojen örnekler üretebilirken, bireysel MP hedeflerinin işlevi üzerindeki potansiyel etkileri dışlamak gerekebilir. Bununla birlikte, E. coli CF lizatlarında G-protein kuplajlı reseptörlerin (GPCR) 14,21,22^, ökaryotik taşıyıcıların 23 veya büyük heteromerik montajların ^24'ünün yüksek kaliteli örneklerinin verimli bir şekilde üretilmesi, karmaşık hedefler için bile uygunluklarını göstermektedir. Bir numunenin hazırlık ölçeği miktarları (≈ 1 mg/mL), bir reaksiyon karışımı (RM) ve bir besleme karışımı (FM) bölmesinden oluşan iki bölmeli sürekli değişim hücresiz (CECF) konfigürasyonu ile elde edilebilir. FM hacmi, RM hacmini 15 ila 20 kat aşıyor ve düşük moleküler ağırlıklı enerji bileşikleri ve öncülleri^19'dan oluşan bir rezervuar sağlıyor. Böylece reaksiyon ifadesi birkaç saat uzatılır ve MP hedefinin nihai verimi artırılır. RM ve FM bölmeleri, 10-14 kDa kesimli bir diyaliz membranı ile ayrılır. İki bölme, CECF reaksiyon kabının özel bir tasarımını gerektirir (Şekil 1). FM'i tutan özel pleksiglas kaplar ile birlikte RM kapları olarak ticari diyaliz kasetleri uygun örneklerdir. MP verimleri, RM: FM oranlarını değiştirerek veya belirli bir inkübasyon süresinden sonra FM'yi değiştirerek daha da manipüle edilebilir.

Bir MP'nin verimi ve kalitesi sıklıkla reaksiyon parametrelerinin yoğun optimizasyonunu gerektirir. CF ifadesinin önemli bir avantajı, bir MP'nin bireysel gereksinimlerine göre hemen hemen her bileşiği değiştirme ve ince ayar yapma olasılığıdır. Basit bir strateji, önce temel bir üretim protokolü oluşturarak bir MP'nin verimini artırmaya odaklanmak ve daha sonra reaksiyon ve katlama koşullarına ince ayar yaparak MP kalitesini optimize etmektir. KF lizatlarında fizyolojik süreçlerin olmaması ve karmaşıklığının azalması, milletvekillerinin verimli üretimi için yüksek başarı oranlarına neden olmaktadır²⁵. DNA şablon tasarımı ve Mg^{2 +} iyon konsantrasyonunun optimizasyonu için rutin hususlar çoğu durumda tatmin edici verimler elde etmek için yeterlidir²⁶. İfade moduna bağlı olarak, MP kalitesinin optimizasyonu zaman alıcı olabilir, çünkü daha çeşitli parametrelerin^{taranması gerekir 14,17,22}.

Tanımlanan CF ekspresyon platformunu oluşturmak için, E. coli CF lizat (i), T7 RNA polimeraz (ii), nanodiskler (iii) ve temel CECF reaksiyon bileşiklerinin (iv) üretimi için protokoller gereklidir (Şekil 1). E. coli K12 suşu A19²⁷ veya BL21 türevleri, verimli S30 (30.000 x g'de santrifüjleme) lizatlarının hazırlanmasında sıklıkla kullanılır. S30 lizatlarının yanı sıra, diğer g-kuvvetlerinde (örneğin S12) santrifüj edilmiş karşılık gelen lizatlar da kullanılabilir. Lisatlar ekspresyon verimliliği ve proteom karmaşıklığı bakımından farklılık gösterir. Tanımlanan protokol ile hazırlanan S30 lizatının proteomu²⁸ ayrıntılı olarak incelenmiştir. S30 proteomu hala iyon kanallarının ekspresyonu ve analizi üzerine arka plan problemleri verebilecek bazı artık dış zar proteinleri içerir. Bu tür hedefler için S80-S100 lizat kullanılması önerilir. Lisat hazırlama sırasında değerli bir modifikasyon, hücrelerin orta log büyüme fazında kombine ısı şoku ve etanol beslemesi ile SOS yanıtının indüklenmesidir. Elde edilen HS30 lizatları şaperonlar bakımından zenginleştirilmiştir ve gelişmiş MP katlama²² için S30 lizatlarla karışımlarda kullanılabilir. E. coli lizatlarındaki CF ekspresyonu, T7 RNA polimeraz (T7RNAP) tarafından kontrol edilen promotörler içeren DNA şablonları ile birleştirilmiş bir transkripsiyon / translasyon işlemi olarak çalıştırılır. Enzim, pAR1219 plazmid^29'u taşıyan BL21 (DE3) Yıldız hücrelerinde verimli bir şekilde üretilebilir.

MSP1E3D1'in iki kopyası, 10-12 nm çapında bir nanodiskte toplanır, ancak aşağıda açıklanan protokol diğer MSP türevleri için de çalışabilir. Bununla birlikte, MSP1E3D1 ile oluşturulanlardan daha büyük nanodiskler daha az kararlı olma eğilimindeyken, MSP1 gibi MSP türevleriyle oluşturulan daha küçük nanodiskler daha büyük MP'leri veya MP komplekslerini barındırmayabilir. MSP1E3D1 nanodiskleri, çok çeşitli farklı lipitler veya lipit karışımları ile in vitro olarak monte edilebilir. Önceden oluşturulmuş nanodiskler genellikle -80 ° C'de 1 yıl > stabildir, stabilite ise farklı lipit bileşenleri için değişebilir. Bir MP'nin katlanması ve stabilitesi üzerindeki lipit etkilerinin taranması için, temsili çeşitli lipitler / lipit karışımları ile monte edilmiş kapsamlı bir nanodisk seti hazırlamak gerekir. Aşağıdaki lipitler iyi bir başlangıç seçimi sağlayabilir: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG) ve 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC).

3 mL CECF reaksiyonunun hazırlanması için bir protokol tanımlanmıştır. 1: 1 oranında daha fazla yukarı veya aşağı ölçeklendirme mümkündür. İki bölmeli CECF konfigürasyonu için, tüm bileşikleri içeren bir RM ve sadece düşük moleküler ağırlıklı bileşikleri içeren bir FM hazırlanmalıdır. 10-14 kDa MWCO'lu ticari 3 mL diyaliz cihazları RM konteyner olarak kullanılabilir ve daha sonra FM'i tutan özel yapım pleksiglas kaplara yerleştirilir (Şekil 1D)³⁰. RM: FM oranı 1: 20'dir, bu nedenle 3 mL RM için 60 mL FM hazırlanmalıdır. DNA şablonları yayınlanan kılavuzlara göre hazırlanmalıdır ve hedefin okuma çerçevesinin kodon optimizasyonu ürün verimini daha da artırabilir²⁶. Hazırlık ölçeği CECF reaksiyonu için, PR üretimi için belirlenmiş bir protokol tanımlanmıştır. Yeni milletvekilleri için ifade protokolleri oluşturmak için, verimi ve kaliteyi artırmak için genellikle belirli bileşiklerin optimizasyon ekranlarını (Tablo 1) gerçekleştirmek gerekir. Mg^{2 +} iyonları için, farklı DNA şablonları için sıklıkla önemli varyasyonlar gösteren iyi odaklanmış bir konsantrasyon optimumluğu vardır. Yeni T7RNAP veya S30 lizat partileri gibi diğer CF reaksiyon bileşikleri, optimal Mg^{2 +} konsantrasyonunu daha da değiştirebilir. Örnek olarak, 14-24 mM konsantrasyon aralığında ve 2 mM'lik adımlar halinde tipik bir Mg²⁺ ekran tanımlanmıştır. Her konsantrasyon kopyalar halinde ve analitik ölçekte CECF reaksiyonlarında taranır. CECF reaksiyon kabı olarak, RM'yi tutan özel yapım Mini-CECF Pleksiglas kaplar³⁰, FM'yi tutan standart 24 delikli mikro plakalarla birlikte kullanılır (Şekil 1B). Alternatif olarak, uygun kurulumlarda 96 derin kuyucuklu mikroplakalar veya diğer ticari diyalizör cihazları ile birlikte ticari diyaliz kartuşları kullanılabilir (Şekil 1C).

Protokol

1. S30 lizat hazırlanması

1. 1. Gün: Bir LB agar plakasındaki gliserol stoklarından hücreleri dışarı çıkarın ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
2. 2. Gün: Agar plakasındaki hücrelerle 200 mL LB ortamını aşılayın ve 12-14 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
3. 3. Gün: 10 L steril YPTG ortamını (10 g / L maya ekstresi, 16 g / L tripton, 5 g / L NaCl, 19.8 g / L glikoz, 4.4 mM KH 2 PO 4, 8 mM K₂HPO₄) 100 mL ön kültür (1:100) ile 15 L karıştırılmış bir tank reaktöründe 37 ° C'ye temperlenmiş olarak aşılayın. 37 ° C, 500 rpm ve yüksek havalandırmada (~ dakikada 3 hava hacmi) yetiştirin. Aşırı köpüklenmeyi önlemek için steril köpük önleyici ekleyin.
4. Optik yoğunluğu (OD) düzenli zaman aralıklarında 600 nm'de ölçün. Yaklaşık 2 saat sonra kültür log fazına girecektir.
5. HS30 lizat için değişiklik: Hücreler orta log fazındayken (OD600 ≈ 3.6-4.2) kültür ortamına 300 mL etanol ekleyin ve 45 dakika daha 42 ° C, 500 rpm ve yüksek havalandırmada (dakikada yaklaşık 3 hava hacmi) ekime devam edin. Ardından, adım 1.6'da açıklandığı gibi hücre kültürünün soğutulması ve toplanmasına devam edin. Standart S30 lizat üretimi için bu adımı atlayın ve adım 1.6 ile devam edin.
6. Hücreler orta log fazında olduğunda (OD600 ≈ 3.6-4.2), fermentörü < 30 dakika içinde 20 ° C'nin altında soğutun. Son OD600 4.5-5.5 civarında olmalıdır. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 4.500 x g'deki hücreleri toplayın ve süpernatanı atın. Aşağıdaki adımlar boyunca hücreleri 4 ° C'de tutun.
   NOT: Soğutma sırasında aşırı köpüklenme meydana gelebilir. Bu durumda, köpük önleyici ekleyin veya karıştırma hızını azaltın ve / veya biyoreaktördeki hava akışını azaltın.
7. Bir spatula kullanarak hücreleri 300 mL S30-A tamponunda (10 mM Tris-HCl, pH 8.2, 14 mM Mg (OAc)2, 60 mM KCl, 6 mM 2-merkaptoetanol) tamamen askıya alın ve ardından homojenliğe kadar süspansiyonu yukarı ve aşağı pipetleyin. 4 °C'de 10 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
   DİKKAT: 2-merkaptoetanol toksiktir. Cilt veya solunum yolu ile temasından kaçının. Mümkünse, bir kaputun altında çalışın. Son yıkama adımından önce boş santrifüj kabını tartın. Santrifüjlemeden sonra, ıslak hücre peletini tartın ve adım 1.8 ile devam edin veya peleti daha fazla kullanıma kadar saklayın.
   NOT: Islak hücre peletinin ağırlığı 1 L biyoreaktör kültürü başına 5-7 g'dır. Bu noktada protokol duraklatılabilir ve pelet sıvı azotta dondurulabilir ve 4-8 hafta boyunca -80 ° C'de saklanabilir.
8. Hücreleri 1.1 hacim (1 g = 1 mL) S30-B tamponunda (10 mM Tris-HCl, pH 8.2, 14 mM Mg (OAc)₂, 60 mM KOAc, 1 mM DTT, 1 tablet cOmplete proteaz inhibitörü) iyice askıya alın. Süspansiyonu önceden soğutulmuş bir Fransız pres basınç hücresine doldurun ve hücreleri 1.000 psig'de bozun. Hücreleri Fransız basınından bir kez geçirin.
9. Lisatı 4 °C'de 30 dakika boyunca 30.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı taze bir tüpe aktarın ve santrifüjleme adımını tekrarlayın.
   NOT: İlk santrifüjlemeden sonra peletin üstünde gevşek ve sümüksü bir tabaka bulunabilir ve bu tabaka süpernatant ile aktarılmamalıdır.
10. Kararsız lizat bileşenlerini çıkarmak ve ribozomlardan mRNA'yı serbest bırakmak için yüksek bir tuz ve ısı adımı uygulayın. Lisatı 0,4 M NaCl'ye ayarlayın ve bir su banyosunda 45 dakika boyunca 42 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Bu adım önemli çökelti oluşumuna neden olur. Zaman zaman inkübasyon sırasında tüpü çevirin veya ters çevirin.
11. Bulanık süspansiyonu (genellikle 50-80 mL) 10-14 kDa kesme ve 5 L S30-C tamponuna (10 mM Tris-HCl, pH 8.2, 14 mM Mg (OAc)₂, 60 mM KOAc, 0.5 mM DTT) karşı diyaliz tüplerine aktarın. S30-C diyaliz tamponunu 2-3 saat sonra değiştirin ve 12-14 saat daha diyaliz yapın.
12. 4. Gün: Diyalizli süspansiyonu santrifüj tüplerine aktarın ve 4 °C'de 30 dakika boyunca 30.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı (S30 lizat) taze 50 mL tüplere aktarın ve yavaşça karıştırın. Lisatın protein konsantrasyonu yaklaşık 30-40 mg/mL olmalıdır. Alikotları (örneğin 0,5 mL, 1 mL) sıvı azotta şok dondurma ve -80 °C'de saklayın. Aliquots > 1 yıl boyunca stabildir.

2. T7 RNA polimerazın ekspresyonu ve saflaştırılması

1. 1. Gün: 100 μg/mL ampisilin içeren 200 mL LB besiyerini, taze kaplanmış BL21(DE3) Star x pAR1219 hücrelerle aşılayın ve 12-16 saat boyunca 37 °C ve 180 rpm'de inkübe edin.
2. 2. Gün: 1 L müthiş et suyunu (12 g / L tripton, 24 g / L maya özü, 4 mL / L gliserol) 10 mL ön kültür ile 2 L şaşkın bir şişeye aşılayın ve 37 ° C ve 180 rpm ajitasyonda inkübe edin. Başlangıç OD600 0.1 civarında olmalıdır.
3. OD600 0.6-0.9'a ulaştığında, T7RNAP ekspresyonunu indüklemek ve 5 saat daha ekime devam etmek için 1 mM'lik son konsantrasyona IPTG ekleyin.
4. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 4.500 x g'de santrifüjleme ile hücreleri hasat edin. Hücreleri sıvı azotta dondurun ve -80 °C'de saklayın.
   NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
5. 3. Gün: Dondurulmuş hücre peletine 30 mL buz gibi soğuk süspansiyon tamponu (30 mM Tris-HCl, bir tablet cOmplete proteaz inhibitörü ile pH 8.0) ekleyin ve peleti oda sıcaklığında bir su banyosunda çözün. Ardından, homojenliğe kadar yukarı ve aşağı pipetleyerek, peleti askıya alın.
6. Önceki bölümde açıklandığı gibi bir Fransız basını kullanarak hücre bozulması gerçekleştirin veya üreticinin tavsiyelerine göre bir sonikasyon cihazı kullanın. Daha sonra, 4 ° C'de 30 dakika boyunca 20.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı taze bir tüpe aktarın.
7. Genomik DNA'yı çökeltmek için, streptomisin sülfatı yavaşça ve süpernatantına% 3'lük (w / v) nihai konsantrasyona ulaşana kadar yumuşak ajitasyon altında ekleyin. Nazik ajitasyon altında 5-10 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. 4 °C'de 30 dakika boyunca 20.000 x g'de santrifüj.
8. Süpernatantı 0,45 μm'lik bir filtre ile filtreleyin ve 4 mL/dak akış hızında peristaltik bir pompa kullanarak 2 CV denge tamponu (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl,% 5 gliserol ve 10 mM 2-merkaptoetanol) ile dengelenmiş 40 mL'lik bir sütun hacmine (CV) sahip bir Q-Sefarose kolonuna yükleyin. Ardından, kolonu bir UV dedektörüne bağlayın ve 280 nm'deki UV sinyali sabit bir taban çizgisine ulaşana kadar denge tamponu ile elüsyona devam edin.
9. 3 mL/dak akış hızında CV başına 50 mM'den 500 mM'ye kadar NaCl gradyanı olan Elute T7RNAP. 1 mL fraksiyon toplayın ve her fraksiyonun 10 μL'sini 2 x SDS numune tamponu ile karıştırarak SDS-PAGE analizi için numuneler hazırlayın. SDS-PAGE'i çalıştırın ve jeli Coomassie Blue R. T7RNAP ile lekeleyin, çok sayıda ek safsızlık bandı ile birlikte yaklaşık 90 kDa'da belirgin bir bant olarak görünmelidir.
10. Diyaliz tamponunda 12-16 saat boyunca 12-14 kDa MWCO'lu membranlar kullanılarak T7RNAP ve diyaliz içeren havuz fraksiyonları (10 mM K 2 HPO 4/KH₂PO₄, pH 8.0,10 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT, %5 (w/v) gliserol).
11. 4. Gün: T7RNAP çözeltisini toplayın ve 12-14 MWCO'lu filtre ünitelerini kullanarak 3-10 mg/mL'lik nihai konsantrasyona konsantre olun. T7RNAP konsantrasyon sırasında çökelmeye başlayabilir. Numunede bulanıklık oluşur oluşmaz konsantrasyonu anında durdurun. Gliserol % 50'lik (w / v) son konsantrasyona ekleyin ve yavaşça karıştırın. 0.5-1 mL alikotları şok dondurma ve -80 ° C'de saklayın. Çalışan T7RNAP alikotları -20 °C'de saklanabilir.
    NOT: 1 L'lik bir fermantasyondan 20.000-40.000 ünite ile yaklaşık 20-40 mL 5 mg/mL kısmen saflaştırılmış T7RNAP elde edilmelidir. Her T7RNAP partisinin optimum miktarını test etmek için, hazırlanan T7RNAP örneğinin 0.02 mg / mL-0.1 mg / mL'sini içeren yeşil floresan proteinin (GFP) CF ekspresyon reaksiyonları gerçekleştirilmelidir.

3. MSP1E3D1'in ifadesi ve saflaştırılması

1. 1. Gün: Standart ısı şoku dönüşümü veya elektroporasyon protokollerini kullanarak E. coli BL21 (DE3) Yıldız hücrelerini pET28(a)-^{MSP1E3D1 vektör 31} ile dönüştürün. 30 μg / mL kanamisin içeren LB agar üzerindeki hücreleri çizgilendirin veya plakaya dönüştürün ve 12-16 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
2. 2. Gün: Agar plakasından toplanan tek bir koloni ile% 0.5 (w / v) glikoz ve 30 μg / mL kanamisin ile desteklenmiş 200 mL LB ortamını aşılayın ve 12-16 saat boyunca 180 rpm'de 37 ° C'de inkübe edin.
3. 3. Gün: Karıştırılmış tank biyoreaktöründe 100 mL ön kültür ile% 0.5 (w / v) glikoz ve 30 μg / mL kanamisin ile desteklenmiş 10 L LB ortamını aşılayın. 37 °C, 500 rpm'de fermantasyon ve dakikada yaklaşık 3 biyoreaktör hacminde havalandırma yapın. Aşırı köpüklenme durumunda, köpük önleyici ekleyin.
   NOT: Fermentör yerine şaşkın sallama şişeleri kullanılabilir.
4. 6.5-7.5 OD600'de, 1 mM'lik son konsantrasyona IPTG ekleyin ve 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübasyona devam edin. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 4.500 x g'de santrifüjleme ile hücreleri hasat edin. Hücre peletlerini 200 mL% 0,9 (w/v) NaCl ile yıkayın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 8.000 x g'de tekrar santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve hücreleri bir spatula kullanarak 50 mL tüplere aktarın. Beklenen ıslak pelet ağırlığı, L biyoreaktör kültürü başına 8-12 g'dır. Sıvı azotta şok dondurma hücre peletleri ve daha fazla kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
   NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
5. 4. Gün: Saflaştırma için, RT'deki bir su banyosunda hücre peletlerini çözün. % 30-40 (w / v) hücre süspansiyonu elde etmek için MSP-A tamponundaki hücreleri askıya alın (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl,% 1 (w / v) Triton X-100, 50 mL hücre süspansiyonu başına 1 tablet c0mplete proteaz inhibitörü kokteyli).
6. Sonikasyon yoluyla veya bir Fransız presi kullanarak hücreleri bozun ve 30,000 ° C'de 30 dakika boyunca 4 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı taze bir tüpe aktarın ve 0,45 μm'lik bir filtreden süzün. Filtratın, peristaltik bir pompa kullanarak 5 CV MSP-B tamponu (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl,% 1 (w / v) Triton X-100) ile dengelenmiş bir Ni²⁺ yüklü nitrilotriasetik asit kolonuna (CV > 15 mL) uygulayın.
   NOT: Filtrasyonu kolaylaştırmak için, süpernatant büyük DNA parçalarını parçalamak için bir dakika daha sonikleştirilebilir.
7. Numune yüklendikten sonra, kolonu 5 CV MSP-B, 5 CV MSP-C (40 mM Tris-HCl, pH 8.9, 300 mM NaCl, 50 mM kolik asit), 5 CV MSP-D (40 mM Tris-HCl, pH 8.9, 300 mM NaCl), 5 CV MSP-E (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl) ve 5 CV MSP-F (40 mM Tris-HCl, pH 8.0) ile yıkayın. 300 mM NaCl, 50 mM imidazol).
   NOT: MSP-C tamponundaki kolik asit, MSP'ye bağlı lipitleri çıkarmak için önemlidir. Kolik asit düşük pH değerlerinde tamamen çözünmez. Bu nedenle pH değeri MSP-C ve MSP-D'de 8.9'a ayarlanmalıdır. Kolonu MSP-D tamponu ile yıkamak önemlidir, çünkü daha düşük bir pH, artık kolik asidin çökelmesine ve kolonu bloke etmesine veya zarar vermesine neden olabilir.
8. MSP-G ile Elute MSP (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 300 mM imidazol). 1 mL'lik fraksiyonları toplayın ve 280 nm'de UV emilimini izleyin. Elüsyon zirvesinin fraksiyonlarını toplayın ve bir araya getirin.
9. Havuzlanmış MSP fraksiyonlarını 12-14 kDa MWCO diyaliz membran tüplerine aktarın ve 4 °C'de 2-3 saat boyunca 5 L MSP-H'ye (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl,% 10 (w / v) gliserol karşı) diyaliz yapın. Yeni 5 L MSP-H arabelleğe geçin ve 4 °C'de 12-16 saat daha diyaliz yapın.
10. 5. Gün: MSP çözeltisini santrifüj tüplerine aktarın ve çökeltiyi gidermek için 4 °C'de 30 dakika boyunca 18.000 x g'de santrifüj yapın. Supernatant'ı taze bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 12-14 kDa MWCO ile ultrafiltrasyon cihazlarını kullanarak 200-800 μM'ye konsantre olun. Bir UV/VIS ölçüm cihazı kullanarak konsantrasyonu ölçün. Konsantrasyonun hesaplanması için 27.31 M-1 ^cm-1 yok olma katsayısını ve 31.96 kDa'lık moleküler kütleyi kullanın.
    NOT: Bir biyoreaktördeki ekspresyon genellikle L kültürü başına 15-30 mg MSP1E3D1 verir.
11. Konsantre MSP çözeltisinin alikotlarını sıvı azotta şok dondurma ve -80 °C'de saklayın.

4. MSP1E3D1 nanodisklerin montajı

1. 1. Gün: 100 mM sodyum kolatta 1-2 mL 50 mM lipit stokları (DMPG, DOPG, POPG DMPC, DOPC veya POPC) hazırlayın. Aynı gün kullanılmadığı takdirde -20 °C'de saklayın.
   NOT: Lipid çözeltisi berrak olmalıdır. Çözelti net değilse, sodyum kolat konsantrasyonu 150 mM'ye yükseltilebilir.
2. MSP1E3D1 çözeltisini lipit çözeltisiyle karıştırın. Dodesil fosfokolin (DPC) % 0.1'lik (w / v) son konsantrasyonda ekleyin. Montaj reaksiyonları, diyaliz kasetlerinin tipik hacimlerine (10 kDa MWCO) karşılık gelen 3 mL (Tablo 2) veya 12 mL'lik nihai hacimlere ayarlanabilir. Nazik ajitasyon altında 21 ° C'de 1 saat boyunca montaj reaksiyonlarını inkübe edin.
   NOT: Her lipit için, homojen nanodisk preparasyonunu sağlamak için belirli bir MSP1E3D1: lipit oranı kullanılmalıdır (Tablo 2). Yeni lipitler veya lipit karışımları için, optimal oran bir pilot deney ve boyut dışlama kromatografisi analizi¹⁴ ile belirlenmelidir.
3. Disk oluşumu (DF) tamponlu (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl) diyaliz kasetinin zarını önceden ıslatın. Montaj karışımını bir şırınga ile diyaliz kasetine aktarın. Potansiyel hava kabarcıkları şırınga kullanılarak aspirasyon ile giderilebilir.
4. 1-4. Günler: Bir karıştırma çubuğu kullanarak karıştırma altında RT'de 10-20 saat boyunca 3 x 5 L DF tamponuna karşı diyaliz yapın. Daha sonra montaj karışımını diyaliz kasetinden DF tamponu ile dengelenmiş 10 kDa MWCO ile santrifüj filtre ünitelerine aktarın. 4 °C'de 4.000 x g'de konsantre olun.
   NOT: Bulanık bir diyaliz karışımı, MSP:lipid'in yanlış stokiyometrik oranını gösterebilir. Çökeltiniz, numune konsantrasyonundan önce 4 °C'de 20 dakika boyunca 18.000 x g'de uzaklaştırılmalıdır. Numune konsantrasyonu sırasında çökelmeyi önlemek için, büyük bir çıkmaza sahip ultrafiltrasyon üniteleri kullanın.
5. Birleştirilen nanodiskleri en az 300 μM'lik bir konsantrasyona konsantre edin. Bir nanodiskin iki MSP1E3D1 molekülü tarafından oluşturulduğunu ve bu nedenle doğru nanodisk miktarını belirlemek için MSP konsantrasyonunun 2'ye bölünmesi gerektiğini düşünün.
   NOT: Açıklanan kurulum (Tablo 2), 300 μM nanodisk çözeltisinin 0,6-1 mL'sini verecektir.
6. Çökeltiyi gidermek için konsantre nanodisk preparatını 18.000 x g'da 4 ° C'de 20 dakika boyunca santrifüj edin. Daha sonra, süpernatantı aspire edin ve sıvı azotta 50 μL alikotları şok dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
   NOT: Boyut dışlama kromatografisi kullanarak nanodisk oluşumunun başarısını değerlendirmeniz önerilir. Numune monodispers olmalı ve sadece düşük miktarda agrega içermelidir. Agregalar, kurulumdaki lipit miktarının çok yüksek olduğunu gösterir. Referans olarak, saflaştırılmış MSP1E3D1 kullanılabilir. Nanodisk preparatı referans MSP1E3D1 zirvesinin yüksekliğinde bir tepe gösteriyorsa, seçilen lipitin MSP1E3D1 oranı çok düşüktü.

5. Hazırlık ölçeği 3 mL CECF reaksiyon kurulumu

1. 1. Gün: Gerekli tüm stok çözümlerini listelendiği gibi hazırlar (Tablo 3). Stoklar -20 °C'de depolanır ve oda sıcaklığında çözülür. Çözdükten sonra ve pipetlemeden önce tüm stokları iyice karıştırdığınızdan emin olun. Tüm stoklar için gerekli hacimleri hesaplayın ve pipetleme şeması yapın (Tablo 4). Yüksek moleküler ağırlıklı bileşikler sadece RM'ye eklenecektir. Düşük moleküler ağırlıklı bileşikler için, RM ve FM için kombine 3 x mastermix hazırlanabilir.
   NOT: Bileşik karışımların nihai hacimleri, karıştırma sırasındaki hacim kaybı nedeniyle hesaplanandan daha az olabilir. Bu, hacim kaybını telafi etmek için% 2-5'lik bir fazla hacim eklenerek önlenebilir.
2. 3 mL'lik bir diyaliz kasetinin zarını 100 mM Tris-asetat, pH 8.0'da dengeleyin. Fazla arabelleği çıkardığınızdan emin olun.
3. RM'yi diyaliz kasetine aktarmak için bir şırınga kullanmak. RM bölmesindeki aşırı havayı şırınga ile aspirasyon yaparak çıkarın. Diyaliz kasetini diyaliz odasına yerleştirin.
4. Diyaliz odasını 60 mL FM ile doldurun. kapağı hazneye yerleştirin ve sabitlemek için vidaları sıkın. Odayı 200 rpm'de 30 °C'de 12-16 saat boyunca inkübe edin.
   NOT: Karıştırma sırasında odanın dik konumda kaldığından emin olun, aksi takdirde düşük moleküler bileşiklerin değişimi engellenecektir.
5. 2. Gün: Bir şırınga kullanarak, RM'yi diyaliz odasından aspire edin. RM'yi taze tüplere aktarın ve çökeltiyi gidermek için 10 dakika boyunca 4 ° C'de 16.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı taze tüplere aktarın. Süpernatanttaki protein şimdi daha fazla analiz edilebilir.
   NOT: Bazı durumlarda, santrifüjlemeden sonra bir pelet mevcut olacaktır. Bu, analiz edilen nanodisklerin veya sentezlenen MP'yi çözünür tutmak için reaksiyon bileşiklerinin uygunluğu hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Bu nedenle, çökelti içinde potansiyel olarak bulunan hedef miktarının SDS-PAGE, Western Blot kullanılarak veya pelet boyutunun görsel olarak değerlendirilmesi ile analiz edilmesi önerilir.

6. Mg²⁺ iyon taraması için analitik ölçek 60 μL CECF reaksiyon kurulumu

1. 1. Gün: İlgili 3x ana karışımın tüm bileşenlerini karıştırın ve RM'ye 60 μL ve FM'ye₈₂₅μL dağıtın. FM'yi H2 O ile doldurun ve FM'i vorteks yaparak karıştırın. FM'i 24 kuyucuklu mikro plakanın 3 kuyucuğuna aktarın (Tablo 5).
   NOT: Özelleştirilmiş Mini-CECF kabına erişilemeyebileceğinden, Tablo 5'teki hacimler, 96 derin kuyucuklu (2 mL) plakada FM hacmi 1,7 mL'lik bir FM hacmine sahip diyaliz kartuşlarında (10-14 kDa MWCO, RM: 100 μL) gerçekleştirilen bir reaksiyon için hesaplanmıştır (Şekil 1).
2. 10-14 kDa MWCO ile rejenere selüloz diyaliz tüplerini yaklaşık 25 x 20 mm boyutlarında parçalara bölün ve% 0,05 (w / v) sodyum azid ile H₂O'da saklayın.
   DİKKAT: Sodyum azid çok toksiktir. Cilt veya mukoza zarı ile herhangi bir temastan kaçının. Metal kapları kullanmayın, çünkü sodyum azid patlayıcı metal azidler oluşturmak için metallerle reaksiyona girebilir.
3. Mini-CECF konteyner montajından önce, diyaliz zarlarından aşırı_H2O'yu bir doku ile çıkarın. Her kaba bir membran parçası yerleştirin ve membranları bir politetrafloretilen halka ile sabitleyin.
4. Mini-CECF kabını, 825 μL FM içeren 24 delikli bir plakanın kuyucuklarına aktarın. Mini-CECF kabının diyaliz zarının altındaki hava kabarcıklarından kaçının.
5. RM'ye açıklandığı gibi yüksek moleküler bileşenler ekleyin (Tablo 5) ve yukarı ve aşağı pipetle çekerek karıştırın. Reaksiyon kabına 60 μL ekleyin. Viskoz çözeltinin transferi sırasında hava kabarcıklarından kaçının.
6. Sızdırmazlık termoplastik filminden 2 adet 8 x 10 cm'lik tabaka kesin ve içindeki reaksiyon kapları ile 24 delikli plakanın etrafına sarın. Bu, reaksiyon karışımından buharlaşmayı azaltacaktır. Şimdi hücre kültürü plakasının kapağını plakaya yerleştirin ve bantla sabitleyin. Plakayı 30 ° C'de ve 12-16 saat boyunca 200 rpm ajitasyonda inkübe edin.
7. 2. Gün: Mini-CECF kabındaki pipet ucu ile diyaliz membranını delerek reaksiyon karışımını toplayın ve RM'yi aspire edin. RM'yi taze tüplere aktarın ve çökeltileri çıkarmak için 10 dakika boyunca 4 ° C'de 16.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı taze tüplere aktarın. Süpernatanttaki protein şimdi daha fazla analiz edilebilir.
   NOT: Bazı durumlarda, santrifüjlemeden sonra bir pelet mevcut olacaktır. Bu, sentezlenen MP'yi çözünür tutmak için analiz edilen nanodisklerin veya diğer reaksiyon bileşiklerinin uygunluğu hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Bu nedenle, çökelti içinde potansiyel olarak bulunan hedef miktarının SDS-PAGE, Western Blot veya pelet boyutunun görsel değerlendirmesi ile analiz edilmesi önerilir.

Sonuçlar

İnce ayar reaksiyon bileşiklerinin, sentezlenmiş milletvekillerinin nihai verimi veya kalitesi üzerindeki etkisi örneklendirilmiştir. Sık kullanılan rutin bir yaklaşım, CF reaksiyonlarında optimal Mg²⁺ konsantrasyonunu, sistem verimliliğinin uygun bir monitörü olarak yeşil floresan proteini (GFP) ekspresyonu ile ayarlamaktır. Örnek olarak, GFP, 14 ila 24 mM arasındaki Mg 2+ konsantrasyonlarında bir pET-21a (+) vektöründen sentezlendi (Şekil 2). SDS...

Tartışmalar

CF ekspresyonunu optimize etmek için kurulum ve stratejiler ve fonksiyonel milletvekillerinin nanodisklere birlikte translasyonel olarak yerleştirilmesi açıklanmaktadır. Gerekli ekipman bir biyoreaktör, bir Fransız pres cihazı veya benzeri, bir UV / VIS ve floresan okuyucu, iki bölmeli bir konfigürasyon kurulumu için uygun CF reaksiyon kapları ve sıcaklık kontrollü bir inkübatörden oluşur. Diğer standart ekipmanlar, E. coli hücrelerinin toplanması için santrifüjlerin yanı sıra S30 lizatl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG)	Avanti Polar Lipids (USA)	840445P
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids (USA)	850345C
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC)	Avanti Polar Lipids (USA)	850375C
1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG)	Avanti Polar Lipids (USA)	840475C
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids (USA)	850457C
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG)	Avanti Polar Lipids (USA)	840034C
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris)	Carl Roth (Germany)	4855
2-Mercaptoethanol	Carl Roth (Germany)	4227
2-Propanol	Carl Roth (Germany)	9781
[3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride	American Radiolabeled Chemicals (USA)	ART0134
Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP)	Merck (Germany)	1409
Adenosine 5’-triphosphate (ATP)	Sigma Aldrich (Germany)	A9251
Alprenolol hydrochloride	Merck (Germany)	A0360000
Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose®	Sigma-Aldrich (Germany)	Q1126
Autoclave Type GE 446EC-1	Gettinge (Germany)
Bioreactor Type 884 124/1	B.Braun (Germany)
Centrifuge	Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)
Cholic acid	Carl Roth (Germany)	8137
Coomassie Brilliant Blue R250	Carl Roth (Germany)	3862
Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks	Schott Duran (Germany)
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt	Sigma-Aldrich (Germany)	C1506
D-glucose monohydrate	Carl Roth (Germany)	6780
Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate	Carl Roth (Germany)	6878
Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing	Fisher Scientific (Germany)	8700152
Dithiothreit	Carl Roth (Germany)	6908
Ethanol	Carl Roth (Germany)	K928
Folinic acid calcium salt hydrate	Sigma-Aldrich (Germany)	47612
French pressure cell disruptor	SLM; Amico Instruments (USA)
Glycerol	Carl Roth (Germany)	3783
Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP)	Sigma-Aldrich (Germany)	G8877
Hydrochloric Acid	Carl Roth (Germany)	K025
IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL	GE Life Sciences (Germany)	GE17-5248
Imidazole	Carl Roth (Germany)	3899
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)	Carl Roth (Germany)	2316
Kanamycin	Carl Roth (Germany)	T832
L-Alanine	Carl Roth (Germany)	3076.1
L-Arginine	Carl Roth (Germany)	6908
L-Asparagine	Carl Roth (Germany)	HN23
L-Aspartic Acid	Carl Roth (Germany)	T202
L-Cysteine	Carl Roth (Germany)	T203
L-Glutamic Acid	Carl Roth (Germany)	3774
L-Glutamine	Carl Roth (Germany)	3772
L-Glycine	Carl Roth (Germany)	3187
L-Histidine	Carl Roth (Germany)	3852
L-Isoleucine	Carl Roth (Germany)	3922
L-Leucine	Carl Roth (Germany)	1699
L-Lysine	Carl Roth (Germany)	4207
L-Methionine	Carl Roth (Germany)	9359
L-Proline	Carl Roth (Germany)	1713
L-Phenylalanine	Carl Roth (Germany)	1709
L-Serine	Carl Roth (Germany)	4682
L-Threonine	Carl Roth (Germany)	1738
L-Tryptophane	Carl Roth (Germany)	7700
L-Tyrosine	Carl Roth (Germany)	T207
MD100 dialysis units	Scienova (Germany)	40077
N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES)	Carl Roth (Germany)	6763
n-dodecylphosphocholine	Antrace (USA)	F308S
PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell	Biorad (Germany)
PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems	Biorad (Germany)
PAGE gel power supply: Power Pac 3000	Biorad (Germany)
Tryptone/peptone from caseine	Carl Roth (Germany)	6681
Peristaltic pump: ip-12	Ismatec (Germany)
Phosphoenol pyruvate monopotassium salt	Sigma Aldrich (Germany)	860077
Potassium dihydrogen phosphate	Carl Roth (Germany)	P018
Potassium acetate	Carl Roth (Germany)	4986
Potassium chloride	Carl Roth (Germany)	6781
Pyruvate Kinase	Roche (Germany)	10109045001
Scintillation counter: Hidex 300 SL	Hidex (Finland)
SDS pellets	Carl Roth (Germany)	8029
Sodium azide	Sigma-Aldrich (Germany)	K305
Sodium chloride	Carl Roth (Germany)	P029
Spectrophotometer Nanodrop	Peqlab (Germany)
Spectrophotometer/fluorescence reader Spark®	Tecan (Switzerland)
tRNA (E. coli)	Roche (Germany)	10109550001
Ultra sonificator	Labsonic U, B. Braun (Germany)
Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP)	Sigma-Aldrich (Germany)	U6625
Y-30 antifoam	Sigma-Aldrich (Germany)	A6457
Yeast extract	Carl Roth (Germany)	2904