Co-translationale Insertion von Membranproteinen in vorgeformte Nanoscheiben

Zusammenfassung

Die kotranslationale Insertion in vorgeformte Nanoscheiben ermöglicht es, zellfrei synthetisierte Membranproteine in definierten Lipidumgebungen ohne Kontakt mit Detergenzien zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung wesentlicher Systemkomponenten und die kritischen Parameter zur Verbesserung der Expressionseffizienz und Probenqualität.

Zusammenfassung

Zellfreie Expressionssysteme ermöglichen das maßgeschneiderte Design von Reaktionsumgebungen, um die funktionelle Faltung selbst komplexer Proteine wie Membranproteine zu unterstützen. Die experimentellen Verfahren zur co-translationalen Insertion und Faltung von Membranproteinen in vorgeformte und definierte Membranen, die als Nanoscheiben geliefert werden, werden demonstriert. Das Protokoll ist völlig reinigungsmittelfrei und kann innerhalb eines Tages Milligramm gereinigter Proben erzeugen. Die resultierenden Membranprotein-/Nanoscheibenproben können für eine Vielzahl von funktionellen Studien und strukturellen Anwendungen wie Kristallisation, Kernspinresonanz oder Elektronenmikroskopie verwendet werden. Die Herstellung grundlegender Schlüsselkomponenten wie zellfreie Lysate, Nanoscheiben mit entworfenen Membranen, kritische Stammlösungen sowie der Aufbau von zellfreien Zweikompartiment-Expressionsreaktionen wird beschrieben. Da die Faltungsanforderungen von Membranproteinen sehr unterschiedlich sein können, liegt ein Schwerpunkt dieses Protokolls auf der Modulation von Parametern und Reaktionsschritten, die für die Probenqualität wichtig sind, wie kritische basische Reaktionsverbindungen, Membranzusammensetzung von Nanoscheiben, Redox- und Chaperonumgebung oder DNA-Template-Design. Der gesamte Prozess wird mit der Synthese von Proteorhodopsin und einem G-Protein-gekoppelten Rezeptor demonstriert.

Einleitung

Membranproteine (MPs) sind aufgrund ihrer Unlöslichkeit in wässrigen Umgebungen anspruchsvolle Ziele in Proteinproduktionsstudien. Herkömmliche MP-Produktionsplattformen umfassen zellbasierte Systeme wie E. coli, Hefe oder eukaryotische Zellen. Die synthetisierten rekombinanten MPs werden entweder aus Zellmembranen extrahiert oder aus Einschlusskörpern refoldet¹. Nach der Detergensolubilisierung können MPs durch etablierte In-vitro-Rekonstitutionsprotokolle in geeignete Membranumgebungen überführt werden. Neben Vesikeln und Liposomen ist die MP-Rekonstitution in planare Membranen in Form von Nanodiscs² - oder^{Salipro-3-Partikeln} in jüngster Zeit zur Routine geworden. Alle diese Strategien implizieren jedoch einen Waschmittelkontakt mit MPs, der zu Destabilisierung, Dissoziation von Oligomeren und sogar zum Verlust der Proteinstruktur und -aktivität führen kann⁴. Das Screening auf optimale Reinigungsmittel-Solubilisierungs- und Rekonstitutionsbedingungen kann daher mühsam und zeitaufwendig sein⁵.

Die Offenheit zellfreier (CF) Systeme ermöglicht es, die Expressionsreaktion direkt mit vorgeformten Membranen mit definierter Lipidzusammensetzung zu versorgen. In diesem lipidbasierten Expressionsmodus (L-CF) haben die synthetisierten MPs die Möglichkeit, co-translational in die bereitgestellten Doppelschichten ^6,7 einzufügen (Abbildung 1). Nanoscheiben, die aus einem Membrangerüstprotein (MSP) bestehen, das eine planare Lipiddoppelschichtscheibe⁸ umgibt, scheinen für diese Strategie ^9,10 besonders geeignet zu sein. Nanoscheiben können routinemäßig in vitro mit einer Vielzahl verschiedener Lipide zusammengesetzt werden, sie sind sehr stabil und die Bestände können bis zu 1 mM konzentriert werden. Die MSP-Expression in E. coli und ihre Reinigung ist jedoch notwendig. Als alternative Strategie kann MSP zusammen mit dem Ziel-MP in CF-Reaktionen exprimiert werden, die mit Liposomen^11,12,13 versorgt werden. DNA-Templates für MSP und MP werden der Reaktion hinzugefügt und MP / Nanodiscs können sich bei der Expression bilden. Während die MSP-Produktion vermieden wird, erfordert die Co-Expressionsstrategie eine sorgfältige Feinabstimmung der endgültigen DNA-Template-Konzentrationen, und höhere Schwankungen in der Effizienz der Probenproduktion sind zu erwarten.

Das co-translationale Einfügen von MPs in Membranen vorgeformter Nanoscheiben ist ein unphysiologischer und noch weitgehend unbekannter Mechanismus, der unabhängig von Translokationsmaschinen und Signalsequenzen^13,14,15,16 ist. Hauptdeterminanten der Insertionseffizienz sind die Art des Membranproteins sowie die Lipidzusammensetzung der bereitgestellten Membran, wobei häufig negativ geladene Lipide^{bevorzugt werden 15,17}. Da die Nanoscheibenmembranen relativ begrenzt sind, wird bei MP-Insertion¹⁸ eine beträchtliche Menge an Lipiden freigesetzt. Die Variation der Nanoscheibengröße ermöglicht das Einfügen und Einstellen von höheren oligomeren MP-Komplexen^15,18. Unter anderem wurde der korrekte Aufbau homooligomerer Komplexe für den Ionenkanal KcsA, für die Ionenpumpe Proteorhodopsin (PR) und für den Multidrug-Transporter EmrE^15,18 gezeigt. MPs werden wahrscheinlich von beiden Seiten mit relativ gleicher Frequenz in die symmetrische Nanoscheibenmembran eindringen. Es sollte daher berücksichtigt werden, dass verschiedene Monomere oder Oligomere, die in eine Nanoscheibe eingefügt werden, entgegengesetzte Orientierungen aufweisen können. Eine Verzerrung der Orientierung könnte jedoch durch kooperative Insertionsmechanismen verursacht werden, wie sie für die Bildung von PR-Hexamern und KcsA-Tetrameren berichtet^{wurden 18}. Eine weitere Verzerrung in der MP-Orientierung könnte sich aus Orientierungsschaltern von eingefügten MPs ergeben, wahrscheinlich am Rand der Nanoscheibenmembranen.

Die Herstellung von CF-Lysaten aus E. coli-Stämmen ist eine zuverlässige Routinetechnik und kann in fast jedem biochemischen Labor durchgeführt werden^19,20. Es sollte berücksichtigt werden, dass neben der Disulfidbrückenbildung die meisten anderen posttranslationalen Modifikationen fehlen, wenn ein MP mit E. coli-Lysaten synthetisiert wird. Während dies homogenere Stichproben für Strukturstudien erzeugen könnte, kann es notwendig sein, mögliche Auswirkungen auf die Funktion einzelner MP-Ziele auszuschließen. Die effiziente Herstellung von qualitativ hochwertigen Proben von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR)14,21,22^, eukaryotischen Transportern²³ oder großen heteromeren Anordnungen ²⁴ in E. coli-CF-Lysaten zeigt jedoch deren Eignung auch für komplexe Targets. Präparative Skalenmengen (≈ 1 mg/ml) einer Probe können mit der CECF-Konfiguration (Continuous Exchange Cell-Free) mit zwei Kompartimenten erhalten werden, die aus einem Reaktionsgemisch (RM) und einem Fütterungsgemisch (FM) besteht. Das FM-Volumen übersteigt das RM-Volumen um das 15- bis 20-fache und bietet ein Reservoir an niedermolekularen Energieverbindungen und Vorläufern¹⁹. Die Expressionsreaktion wird somit um mehrere Stunden verlängert und die Endausbeute des MP-Targets erhöht. Die RM- und FM-Fächer sind durch eine Dialysemembran mit einem Cutoff von 10-14 kDa getrennt. Die beiden Kompartimente erfordern ein spezielles Design des CECF-Reaktionsbehälters (Abbildung 1). Kommerzielle Dialysekassetten als RM-Container in Kombination mit maßgeschneiderten Plexiglasbehältern mit dem FM sind geeignete Beispiele. MP-Ausbeuten können weiter manipuliert werden, indem das RM:FM-Verhältnis geändert oder das FM nach einer bestimmten Inkubationszeit ausgetauscht wird.

Ausbeute und Qualität eines MP erfordern häufig eine intensive Optimierung der Reaktionsparameter. Ein wichtiger Vorteil der CF-Expression ist die Möglichkeit, nahezu jede Verbindung nach den individuellen Anforderungen eines MP zu modifizieren und zu feinabstimmen. Eine einfache Strategie besteht darin, sich zunächst auf die Verbesserung der Ausbeute eines MP zu konzentrieren, indem ein grundlegendes Produktionsprotokoll erstellt wird, und dann die MP-Qualität durch Feinabstimmung der Reaktions- und Faltbedingungen zu optimieren. Das Fehlen physiologischer Prozesse in CF-Lysaten und deren reduzierte Komplexität führen zu hohen Erfolgsraten für die effiziente Herstellung von MPs²⁵. Routineüberlegungen für das Design von DNA-Templates und die Optimierung der^Mg2+-Ionenkonzentration reichen in den meisten Fällen aus, um zufriedenstellende Ausbeuten zu erzielen²⁶. Je nach Ausdrucksmodus kann die Optimierung der MP-Qualität zeitaufwändig werden, da eine größere Vielfalt von Parametern gescreent werden muss^14,17,22.

Um die beschriebene CF-Expressionsplattform zu etablieren, sind Protokolle für die Herstellung von E. coli-CF-Lysat (i), T7-RNA-Polymerase (ii), Nanodiscs (iii) und den grundlegenden CECF-Reaktionsverbindungen (iv) erforderlich (Abbildung 1). Die E. coli K12 Stamm A19²⁷ oder BL21 Derivate werden häufig zur Herstellung von effizienten S30 (Zentrifugation bei 30.000 x g) Lysaten verwendet. Neben S30-Lysaten können entsprechende Lysate verwendet werden, die bei anderen g-Kräften (z.B. S12) zentrifugiert wurden. Die Lysate unterscheiden sich in der Expressionseffizienz und in der Proteomkomplexität. Das Proteom des nach dem beschriebenen Protokoll hergestellten S30-Lysats wurde eingehend^{untersucht 28}. Das S30-Proteom enthält noch einige restliche äußere Membranproteine, die Hintergrundprobleme bei der Expression und Analyse von Ionenkanälen verursachen könnten. Für solche Ziele wird die Verwendung von S80-S100-Lysaten empfohlen. Eine wertvolle Modifikation während der Lysataufbereitung ist die Induktion der SOS-Antwort durch kombinierte Hitzeschock- und Ethanolzufuhr in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase der Zellen. Die resultierenden HS30-Lysate sind mit Chaperonen angereichert und können in Mischungen mit S30-Lysaten für eine verbesserte MP-Faltung^{verwendet werden 22}. Die CF-Expression in E. coli-Lysaten wird als gekoppelter Transkriptions-/Translationsprozess mit DNA-Templates betrieben, die Promotoren enthalten, die von der T7-RNA-Polymerase (T7RNAP) kontrolliert werden . Das Enzym kann effizient in BL21(DE3)-Sternzellen hergestellt werden, die das pAR1219-Plasmid²⁹ tragen.

Zwei Kopien von MSP1E3D1 fügen sich zu einer Nanoscheibe mit einem Durchmesser von 10-12 nm zusammen, aber das unten beschriebene Protokoll kann auch für andere MSP-Derivate funktionieren. Nanoscheiben, die größer sind als die mit MSP1E3D1 gebildeten, sind jedoch tendenziell weniger stabil, während kleinere Nanoscheiben, die mit MSP-Derivaten wie MSP1 gebildet werden, möglicherweise keine größeren MPs oder MP-Komplexe aufnehmen. MSP1E3D1-Nanoscheiben können in vitro mit einer Vielzahl unterschiedlicher Lipide oder Lipidgemische zusammengesetzt werden. Vorgeformte Nanoscheiben sind in der Regel für > 1 Jahr bei -80 °C stabil, während die Stabilität für verschiedene Lipidkomponenten variieren kann. Für das Screening von Lipideffekten auf die Faltung und Stabilität eines MP ist es notwendig, einen umfassenden Satz von Nanoscheiben herzustellen, die mit einer repräsentativen Vielfalt von Lipiden / Lipidmischungen zusammengesetzt sind. Die folgenden Lipide können eine gute Ausgangsauswahl ergeben: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC), 1,2 Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerin) (DOPG), 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC), 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG) und 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin (POPC).

Ein Protokoll zur Herstellung einer 3-ml-CECF-Reaktion wird beschrieben. Eine weitere Skalierung nach oben oder unten im Verhältnis 1:1 ist möglich. Für die CECF-Konfiguration mit zwei Kompartimenten muss ein RM hergestellt werden, der alle Verbindungen enthält, und ein FM, der nur die niedermolekularen Verbindungen enthält. Handelsübliche 3-ml-Dialysegeräte mit 10-14 kDa MWCO können als RM-Behälter verwendet werden, die dann in speziell angefertigte Plexiglasbehälter mit dem FM (Abbildung 1D)³⁰ gelegt werden. Das Verhältnis von RM:FM beträgt 1:20, so dass 60 mL FM für 3 mL RM vorbereitet werden müssen. Qualität, Konzentration oder Art mehrerer Komponenten können für die Endausbeute und/oder Qualität des synthetisierten MP entscheidend sein (Tabelle 1). DNA-Templates sollten nach veröffentlichten Richtlinien erstellt werden und die Codon-Optimierung des Leserahmens des Ziels kann die Produktausbeute weiter signifikant verbessern²⁶. Für die CECF-Reaktion im präparativen Maßstab wird ein etabliertes Protokoll für die Herstellung von PR beschrieben. Um Expressionsprotokolle für neue MPs zu erstellen, ist es in der Regel notwendig, Optimierungsscreens bestimmter Verbindungen (Tabelle 1) durchzuführen, um Ausbeute und Qualität zu verbessern. Für Mg²⁺ Ionen existiert ein gut fokussiertes Konzentrationsoptimal, das häufig signifikante Variationen für verschiedene DNA-Templates zeigt. Andere CF-Reaktionsverbindungen wie neue Chargen von T7RNAP oder S30-Lysaten können die optimale^Mg2+ -Konzentration weiter verschieben. Als Beispiel wird ein typischer Mg 2⁺ Bildschirm im Bereich von 14-24 mM Konzentration und in Schritten von 2 mM beschrieben. Jede Konzentration wird in Duplikaten und in analytischen Reaktionen des CECF untersucht. Als CECF-Reaktionsbehälter werden kundenspezifische Mini-CECF-Plexiglasbehälter³⁰ mit dem RM in Kombination mit Standard-24-Well-Mikroplatten verwendet, die das FM enthalten (Abbildung 1B). Alternativ können handelsübliche Dialysekartuschen in Kombination mit 96-tiefen Mikrotiterplatten oder anderen handelsüblichen Dialysatorgeräten in geeigneten Aufbauten verwendet werden (Abbildung 1C).

Protokoll

1. Herstellung von S30-Lysat

1. Tag 1: Streifen Sie Zellen aus Glycerinvorräten auf einer LB-Agarplatte aus und inkubieren Sie bei 37 ° C über Nacht.
2. Tag 2: 200 ml LB-Medium mit den Zellen von der Agarplatte inokulieren und bei 37 °C für 12-14 h inkubieren.
3. Tag 3: 10 l steriles YPTG-Medium (10 g/L Hefeextrakt, 16 g/L Trypton, 5 g/L NaCl, 19,8 g/L Glucose, 4,4 mM KH 2 PO 4, 8 mM K₂HPO₄) temperiert auf 37 °C in einem 15 L Rührkesselreaktor mit 100 mL der Vorkultur (1:100) temperiert. Bei 37 °C, 500 U/min und hoher Belüftung (~ 3 Luftmengen pro Minute) kultivieren. Um übermäßige Schaumbildung zu vermeiden, fügen Sie steriles Antischaum hinzu.
4. Messen Sie die optische Dichte (OD) bei 600 nm in regelmäßigen Zeitintervallen. Nach ca. 2 h tritt die Kultur in die Log-Phase ein.
5. Modifikation für HS30 Lysat: Wenn sich die Zellen in der mittleren Log-Phase befinden (OD600 ≈ 3,6-4,2), fügen Sie dem Kulturmedium 300 ml Ethanol hinzu und setzen Sie die Kultivierung bei 42 °C, 500 U/min und hoher Belüftung (ca. 3 Luftvolumina pro Minute) für weitere 45 Minuten fort. Fahren Sie dann mit dem Abkühlen und Ernten der Zellkultur fort, wie in Schritt 1.6 beschrieben. Für die Herstellung von Standard-S30-Lysat überspringen Sie diesen Schritt und fahren Sie mit Schritt 1.6 fort.
6. Wenn sich die Zellen in der mittleren Log-Phase befinden (OD600 ≈ 3,6-4,2), kühlen Sie den Fermenter innerhalb von < 30 min unter 20 °C. Der endgültige OD600 sollte etwa 4,5-5,5 betragen. Ernten Sie die Zellen bei 4.500 x g für 20 min bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand. Halten Sie die Zellen während der folgenden Schritte bei 4 °C.
   HINWEIS: Während des Abkühlens kann es zu übermäßiger Schaumbildung kommen. In diesem Fall entweder Antischaummittel hinzufügen oder die Rührgeschwindigkeit reduzieren und/oder den Luftstrom im Bioreaktor verringern.
7. Die Zellen werden vollständig in 300 mL S30-A-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KCl, 6 mM 2-Mercaptoethanol) mit einem Spatel suspendiert, gefolgt von einer Pipettierung der Suspension auf und ab bis zur Homogenität. Zentrifugieren bei 8.000 x g für 10 min bei 4 °C. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
   ACHTUNG: 2-Mercaptoethanol ist giftig. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut oder Atemwegen. Wenn möglich, arbeiten Sie unter einer Haube. Wiegen Sie das leere Zentrifugenbecherglas vor dem letzten Waschschritt. Nach der Zentrifugation das Nasszellenpellet wiegen und entweder mit Schritt 1.8 fortfahren oder das Pellet bis zur weiteren Verwendung lagern.
   HINWEIS: Das Gewicht des Nasszellenpellets beträgt 5-7 g pro 1 L Bioreaktorkultur. An diesem Punkt kann das Protokoll pausiert werden und das Pellet kann in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C für 4-8 Wochen gelagert werden.
8. Suspendieren Sie die Zellen gründlich in 1,1 Volumina (1 g = 1 ml) S30-B-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)₂, 60 mM KOAc, 1 mM DTT, 1 Tablette cOmplete Proteaseinhibitor). Füllen Sie die Suspension in eine vorgekühlte französische Pressdruckzelle und brechen Sie die Zellen bei 1.000 psig. Einmal Zellen durch die französische Presse führen.
9. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 30.000 x g für 30 min bei 4 °C. Den Überstand in ein frisches Röhrchen geben und den Zentrifugationsschritt wiederholen.
   HINWEIS: Auf dem Pellet kann nach der ersten Zentrifugation eine lose und schleimige Schicht vorhanden sein, die nicht mit dem Überstand übertragen werden sollte.
10. Wenden Sie einen hohen Salz- und Hitzeschritt an, um instabile Lysatkomponenten zu entfernen und mRNA aus Ribosomen freizusetzen. Das Lysat wird auf 0,4 M NaCl eingestellt und bei 42 °C 45 Minuten im Wasserbad inkubiert.
    HINWEIS: Dieser Schritt führt zu einer signifikanten Niederschlagsbildung. Drehen oder invertieren Sie das Röhrchen während der Inkubation von Zeit zu Zeit.
11. Die trübe Suspension (normalerweise 50-80 ml) wird in Dialyseröhrchen mit einem Cutoff von 10-14 kDa überführt und gegen 5 L S30-C Puffer dialysiert (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)₂, 60 mM KOAc, 0,5 mM DTT). Tauschen Sie den S30-C Dialysepuffer nach 2-3 h aus und dialysieren Sie für weitere 12-14 h.
12. Tag 4: Die dialysierte Suspension in Zentrifugenröhrchen geben und bei 30.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugieren. Überstand (S30-Lysat) in frische 50-ml-Röhrchen geben und vorsichtig mischen. Die Proteinkonzentration des Lysats sollte ca. 30-40 mg/ml betragen. Aliquots (z.B. 0,5 ml, 1 ml) in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern. Die Aliquots sind für > 1 Jahr stabil.

2. Expression und Aufreinigung der T7-RNA-Polymerase

1. Tag 1: 200 mL LB-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin mit frisch plattierten BL21(DE3) Star x pAR1219-Zellen inokulieren und bei 37 °C und 180 U/min für 12-16 h inkubieren.
2. Tag 2: 1 L große Brühe (12 g/L Trypton, 24 g/L Hefeextrakt, 4 ml/L Glycerin) in einem 2 L Kolben mit 10 ml der Vorkultur inokulieren und bei 37 °C und 180 U/min Rühren inkubieren. Der Start-OD600 sollte etwa 0,1 betragen.
3. Wenn der OD600 0,6-0,9 erreicht, fügen Sie IPTG zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzu, um die T7RNAP-Expression zu induzieren, und setzen Sie die Kultivierung für weitere 5 Stunden fort.
4. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 4.500 x g für 20 min bei 4 °C. Zellen in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
5. Tag 3: 30 mL eiskalter Suspensionspuffer (30 mM Tris-HCl, pH 8,0 mit einer Tablette cOmplete-Proteaseinhibitor) in das gefrorene Zellpellet geben und das Pellet in einem Wasserbad bei Raumtemperatur auftauen. Dann suspendieren Sie das Pellet, indem Sie auf und ab pipettieren, bis die Homogenität erreicht ist.
6. Führen Sie den Zellaufschluss mit einer französischen Presse durch, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, oder verwenden Sie ein Ultraschallgerät gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Anschließend bei 20.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugieren und Überstand in ein frisches Röhrchen überführen.
7. Um genomische DNA auszufällen, fügen Sie Streptomycinsulfat langsam und unter sanftem Rühren zum Überstand hinzu, bis eine Endkonzentration von 3% (w/v) erreicht ist. Bei 4 °C 5-10 min unter leichtem Rühren inkubieren. Zentrifugieren bei 20.000 x g für 30 min bei 4 °C.
8. Filtern Sie den Überstand mit einem 0,45 μm-Filter und laden Sie ihn mit einer Schlauchpumpe mit einer Durchflussrate von 4 ml/min auf eine Q-Sepharose-Säule mit einem Säulenvolumen (CV) von 40 mL, das mit 2 CV-Äquilibrierungspuffer (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5% Glycerin und 10 mM 2-Mercaptoethanol) ausgeglichen ist. Verbinden Sie dann die Säule mit einem UV-Detektor und setzen Sie die Elution mit Gleichgewichtspuffer fort, bis das UV-Signal bei 280 nm eine stabile Basislinie erreicht.
9. Elue T7RNAP mit einem Gradienten von 50 mM bis 500 mM NaCl pro CV bei einer Flussrate von 3 mL/min. Sammeln Sie 1 ml Fraktionen und bereiten Sie Proben für die SDS-PAGE-Analyse vor, indem Sie 10 μL jeder Fraktion mit 2 x SDS-Probenpuffer mischen. Führen Sie SDS-PAGE aus und färben Sie das Gel mit Coomassie Blue R. T7RNAP sollte als prominente Bande bei etwa 90 kDa zusammen mit zahlreichen zusätzlichen Verunreinigungsbanden erscheinen.
10. Poolfraktionen, die T7RNAP enthalten und unter Verwendung von Membranen mit einem 12-14 kDa MWCO für 12-16 h in Dialysepuffer (10 mM_K2HPO4/KH_2PO4, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT, 5% (w/v) Glycerin) dialysieren).
11. Tag 4: T7RNAP-Lösung sammeln und mit Filtereinheiten mit 12-14 MWCO auf eine Endkonzentration von 3-10 mg/ml konzentrieren. T7RNAP kann während der Konzentration ausfallen. Stoppen Sie die Konzentration sofort, sobald Trübung in der Probe auftritt. Fügen Sie Glycerin auf eine Endkonzentration von 50% (w/v) hinzu und mischen Sie vorsichtig. 0,5-1 ml Aliquots schockgefrieren und bei -80 °C lagern. Funktionierende T7RNAP-Aliquots können bei -20 °C gelagert werden.
    HINWEIS: Etwa 20-40 mL 5 mg/ml teilgereinigtes T7RNAP mit 20.000-40.000 Einheiten sollten aus einer 1-L-Fermentation gewonnen werden. Um die optimale Menge jeder T7RNAP-Charge zu testen, sollten CF-Expressionsreaktionen von grün fluoreszierendem Protein (GFP) durchgeführt werden, die 0,02 mg/ml-0,1 mg/ml der vorbereiteten T7RNAP-Probe enthalten.

3. Expression und Reinigung von MSP1E3D1

1. Tag 1: Transformation von E. coli BL21 (DE3) Sternzellen mit dem pET28(a)-MSP1E3D1-Vektor³¹ unter Verwendung von Standard-Hitzeschocktransformations- oder Elektroporationsprotokollen. Streifen oder plattentransformierte Zellen auf LB-Agar mit 30 μg/ml Kanamycin aus und inkubieren bei 37 °C für 12-16 h.
2. Tag 2: Beimpfen Sie 200 ml LB-Medium, ergänzt mit 0,5% (w/v) Glucose und 30 μg/ml Kanamycin mit einer einzigen Kolonie, die von der Agarplatte gepflückt wird, und inkubieren Sie bei 37 °C bei 180 U/min für 12-16 h.
3. Tag 3: 10 L LB-Medium ergänzt mit 0,5% (w/v) Glucose und 30 μg/ml Kanamycin mit 100 mL der Vorkultur in einem Rührkessel-Bioreaktor. Fermentation bei 37 °C, 500 U/min und Belüftung von ca. 3 Bioreaktorvolumina pro Minute. Bei übermäßiger Schaumbildung Antischaum hinzufügen.
   HINWEIS: Anstelle eines Fermenters können verwirrte Schüttelkolben verwendet werden.
4. Bei OD600 von 6,5-7,5 wird IPTG zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt und die Inkubation bei 37 °C für 1 h fortgesetzt. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 4.500 x g für 20 min bei 4 °C. Zellpellets mit 200 mL 0,9% (w/v) NaCl waschen und nochmals bei 8.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und übertragen Sie die Zellen mit einem Spatel in 50-ml-Röhrchen. Das erwartete Gewicht der nassen Pellets beträgt 8-12 g pro L Bioreaktorkultur. Schockgefrierzellpellets in flüssigem Stickstoff einfrieren und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C lagern.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
5. Tag 4: Zur Reinigung die Zellpellets in einem Wasserbad bei RT auftauen. Suspendieren Sie die Zellen in MSP-A-Puffer (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1% (w/v) Triton X-100, 1 Tablette c0mplete protease inhibitor cocktail pro 50 ml Zellsuspension), um eine 30-40% (w/v) Zellsuspension zu erhalten.
6. Zellen durch Ultraschall oder mit einer französischen Presse aufbrechen und bei 30.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugieren. Der Überstand wird in ein frisches Rohr überführt und durch einen 0,45-μm-Filter gefiltert. Das Filtrat wird unter Verwendung einer Peristaltikpumpe auf eine mit Ni²⁺ beladene Nitrilotriessigsäuresäule (CV > 15 ml) aufgetragen, die mit 5 CV MSP-B-Puffer (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1% (w/v) Triton X-100) äquilibriert ist.
   HINWEIS: Um die Filtration zu erleichtern, kann der Überstand für eine weitere Minute beschallt werden, um große DNA-Fragmente abzubauen.
7. Nach dem Beladen der Probe die Säule mit 5 CV MSP-B, 5 CV MSP-C (40 mM Tris-HCl, pH 8,9, 300 mM NaCl, 50 mM Cholsäure), 5 CV MSP-D (40 mM Tris-HCl, pH 8,9, 300 mM NaCl), 5 CV MSP-E (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl) und 5 CV MSP-F (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 50 mM Imidazol).
   HINWEIS: Cholsäure im MSP-C-Puffer ist wichtig, um an MSP gebundene Lipide zu entfernen. Cholsäure ist bei niedrigen pH-Werten nicht vollständig löslich. Der pH-Wert muss daher bei MSP-C und MSP-D auf 8,9 eingestellt werden. Es ist wichtig, die Säule mit MSP-D-Puffer zu waschen, da ein niedrigerer pH-Wert dazu führen kann, dass Restcholsäure ausfällt und die Säule blockiert oder beschädigt.
8. Elue MSP mit MSP-G (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 300 mM Imidazol). Sammeln Sie Fraktionen von 1 ml und überwachen Sie die UV-Absorption bei 280 nm. Sammeln und bündeln Sie die Fraktionen des Elution Peaks.
9. Gepoolte MSP-Fraktionen in 12-14 kDa MWCO Dialysemembranröhrchen überführen und gegen 5 L MSP-H (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 10% (w/v) Glycerin) für 2-3 h bei 4 °C dialysieren. Wechsel zu frischem 5 L MSP-H Puffer und Dialyse für weitere 12-16 h bei 4 °C.
10. Tag 5: MSP-Lösung in Zentrifugenröhrchen geben und bei 18.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugieren, um Niederschlag zu entfernen. Überstand in ein frisches Röhrchen überführen und mit Ultrafiltrationsgeräten mit 12-14 kDa MWCO bei 4 °C auf 200-800 μM konzentrieren. Konzentrationsmessung mit einem UV/VIS-Messgerät. Verwenden Sie den Extinktionskoeffizienten von 27,31 M-1 ^cm-1 und die Molekülmasse von 31,96 kDa zur Berechnung der Konzentration.
    HINWEIS: Die Expression in einem Bioreaktor ergibt normalerweise 15-30 mg MSP1E3D1 pro L-Kultur.
11. Aliquots der konzentrierten MSP-Lösung in flüssigem Stickstoff schockgefrieren und bei -80 °C lagern.

4. Bestückung von MSP1E3D1 Nanoscheiben

1. Tag 1: Bereiten Sie 1-2 ml 50 mM Lipidvorräte (DMPG, DOPG, POPG DMPC, DOPC oder POPC) in 100 mM Natriumholat vor. Bei Nichtgebrauch am selben Tag bei -20 °C lagern.
   HINWEIS: Die Lipidlösung muss klar sein. Wenn die Lösung nicht klar ist, kann die Natriumcholatkonzentration auf 150 mM erhöht werden.
2. Mischen Sie die MSP1E3D1-Lösung mit der Lipidlösung. Fügen Sie Dodecylphosphocholin (DPC) in einer Endkonzentration von 0,1% (w / v) hinzu. Montagereaktionen können auf Endvolumina von 3 ml (Tabelle 2) oder 12 ml entsprechend typischen Volumina von Dialysekassetten (10 kDa MWCO) eingestellt werden. Montagereaktionen für 1 h bei 21 °C unter leichtem Rühren inkubieren.
   HINWEIS: Für jedes Lipid muss ein spezifisches MSP1E3D1:Lipid-Verhältnis verwendet werden, um eine homogene Nanoscheibenpräparation zu gewährleisten (Tabelle 2). Für neue Lipide oder Lipidgemische sollte das optimale Verhältnis mit einem Pilotversuch und einer Größenausschlusschromatographie-Analyse bestimmt werden¹⁴.
3. Die Membran einer Dialysekassette mit Disc Formation (DF) Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl) vorbenetzen. Das Montagegemisch mit einer Spritze in die Dialysekassette überführen. Potentielle Luftblasen können durch Absaugen mit der Spritze entfernt werden.
4. Tag 1-4: Dialysieren gegen 3 x 5 L DF Puffer für 10-20 h bei RT unter Rühren mit einem Rührstab. Anschließend wird das Montagegemisch von der Dialysekassette in Zentrifugalfiltereinheiten mit 10 kDa MWCO mit DF-Puffer überführt. Konzentrat bei 4.000 x g bei 4 °C.
   HINWEIS: Eine trübe Dialysemischung könnte auf ein falsches stöchiometrisches Verhältnis von MSP:Lipid hinweisen. Der Niederschlag muss bei 18.000 x g für 20 min bei 4 °C vor der Konzentration der Probe entfernt werden. Um Ausfällungen während der Probenkonzentration zu vermeiden, verwenden Sie Ultrafiltrationseinheiten mit einem großen Deadstop.
5. Die zusammengesetzten Nanoscheiben werden auf eine Konzentration von mindestens 300 μM konzentriert. Messen Sie die Konzentration mit einem UV/VIS-Lesegerät. Bedenken Sie, dass eine Nanoscheibe aus zwei MSP1E3D1-Molekülen besteht und daher die Konzentration von MSP durch 2 geteilt werden muss, um die richtige Menge an Nanoscheiben zu bestimmen.
   HINWEIS: Der beschriebene Aufbau (Tabelle 2) ergibt 0,6-1 ml einer 300 μM Nanoscheibenlösung.
6. Zentrifugieren Sie das konzentrierte Nanoscheibenpräparat bei 18.000 x g für 20 min bei 4 °C, um Niederschlag zu entfernen. Dann saugen Sie den Überstand an und frieren Sie 50 μL Aliquots in flüssigem Stickstoff schockgefrieren und lagern Sie ihn bei -80 °C.
   HINWEIS: Es ist ratsam, den Erfolg der Nanoscheibenbildung mittels Größenausschlusschromatographie zu bewerten. Die Probe sollte monodispers sein und nur eine geringe Menge an Aggregaten enthalten. Aggregate zeigen an, dass die Lipidmenge im Setup zu hoch ist. Als Referenz kann gereinigtes MSP1E3D1 verwendet werden. Wenn das Nanoscheibenpräparat einen Peak in Höhe des Referenz-MSP1E3D1-Peaks aufweist, war das gewählte Verhältnis von Lipid zu MSP1E3D1 zu niedrig.

5. Präparativer Skala 3 mL CECF Reaktionsaufbau

1. Tag 1: Bereiten Sie alle erforderlichen Stammlösungen wie aufgeführt vor (Tabelle 3). Die Bestände werden bei -20 °C gelagert und bei Raumtemperatur aufgetaut. Achten Sie darauf, alle Bestände nach dem Auftauen und vor dem Pipettieren gründlich zu mischen. Berechnen Sie die erforderlichen Volumina für alle Bestände, und erstellen Sie ein Pipettierschema (Tabelle 4). Hochmolekulare Verbindungen werden nur dem RM zugesetzt. Für die niedermolekularen Verbindungen kann ein kombinierter 3 x Mastermix für RM und FM hergestellt werden.
   HINWEIS: Die Endvolumina von Mischungen können aufgrund des Volumenverlusts während des Mischens geringer sein als berechnet. Dies kann vermieden werden, indem ein überschüssiges Volumen von 2-5% hinzugefügt wird, um den Volumenverlust auszugleichen.
2. Die Membran einer 3-ml-Dialysekassette wird in 100 mM Tris-Acetat, pH 8,0 ausgeglichen. Stellen Sie sicher, dass Sie überschüssigen Puffer entfernen.
3. Verwenden einer Spritze, um die RM in die Dialysekassette zu übertragen. Entfernen Sie überschüssige Luft im RM-Fach durch Absaugen mit der Spritze. Legen Sie die Dialysekassette in die Dialysekammer.
4. Füllen Sie die Dialysekammer mit 60 ml FM. Setzen Sie den Deckel auf die Kammer und ziehen Sie die Schrauben fest, um sie zu fixieren. Die Kammer 12-16 h bei 30 °C bei 200 U/min inkubieren.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Kammer während des Rührens in der aufrechten Position bleibt, da sonst der Austausch niedermolekularer Verbindungen behindert wird.
5. Tag 2: Saugen Sie das RM mit einer Spritze aus der Dialysekammer ab. Das RM in frische Röhrchen geben und bei 16.000 x g bei 4 °C 10 min zentrifugieren, um den Niederschlag zu entfernen. Den Überstand in frische Röhrchen überführen. Das Protein im Überstand kann nun weiter analysiert werden.
   HINWEIS: In einigen Fällen ist nach der Zentrifugation ein Pellet vorhanden. Dies kann wichtige Informationen über die Eignung der analysierten Nanoscheiben oder der Reaktionsverbindungen liefern, um das synthetisierte MP löslich zu halten. Es ist daher ratsam, die Menge des potentiell im Niederschlag vorhandenen Ziels mit SDS-PAGE, Western Blot oder durch visuelle Auswertung der Pelletgröße zu analysieren.

6. Analyseskala 60 μL CECF-Reaktionsaufbau für Mg²⁺ Ionenscreening

1. Tag 1: Mischen Sie alle Komponenten des jeweiligen 3x Mastermixes und verteilen Sie 60 μL auf den RM und 825 μL auf den FM. FM mit H2O auffüllen und FM durchWirbeln mischen. Übertragen Sie FM in 3 Vertiefungen der 24-Well-Mikroplatte (Tabelle 5).
   HINWEIS: Da der kundenspezifische Mini-CECF-Behälter möglicherweise nicht zugänglich ist, werden die Volumina in Tabelle 5 für eine Reaktion berechnet, die in Dialysekartuschen (10-14 kDa MWCO, RM: 100 μL) mit einem FM-Volumen von 1,7 ml in 96 Vertiefungsplatten (2 ml) durchgeführt wird (Abbildung 1).
2. Regenerierte Cellulosedialyseschläuche mit einem 10-14 kDa MWCO in ca. 25 x 20 mm große Stücke schneiden und in_H2Omit 0,05% (w/v) Natriumazid lagern.
   ACHTUNG: Natriumazid ist sehr giftig. Vermeiden Sie jeglichen Kontakt mit Haut oder Schleimhaut. Verwenden Sie keine Metallbehälter, da Natriumazid mit Metallen reagieren kann, um explosive Metallazide zu bilden.
3. Entfernen Sie vor der Mini-CECF-Behältermontage überschüssiges H₂O mit einem Gewebe von den Dialysemembranen. Legen Sie ein Membranstück auf jeden Behälter und fixieren Sie die Membranen mit einem Polytetrafluorethylenring.
4. Den Mini-CECF-Behälter in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit 825 μL FM überführen. Vermeiden Sie Luftblasen unter der Dialysemembran des Mini-CECF-Behälters.
5. Fügen Sie dem RM wie beschrieben hochmolekulare Komponenten hinzu (Tabelle 5) und mischen Sie durch Pipettieren auf und ab. 60 μL in den Reaktionsbehälter geben. Vermeiden Sie Luftblasen während des Transfers der viskosen Lösung.
6. Schneiden Sie 2 8 x 10 cm große Platten einer thermoplastischen Dichtungsfolie aus und wickeln Sie sie um die 24-Well-Platte mit den Reaktionsbehältern im Inneren. Dadurch wird die Verdampfung aus dem Reaktionsgemisch reduziert. Legen Sie nun den Deckel der Zellkulturplatte auf die Platte und fixieren Sie sie mit Klebeband. Die Platte bei 30 °C und 200 U/min Rühren für 12-16 h inkubieren.
7. Tag 2: Die Reaktionsmischung wird durch Durchstechen der Dialysemembran mit der Pipetenspitze am Mini-CECF-Behälter geerntet und die RM abgesaugt. RM in frische Röhrchen geben und 10 min bei 16.000 x g bei 4 °C zentrifugieren, um Ausscheidungen zu entfernen. Den Überstand in frische Röhrchen überführen. Das Protein im Überstand kann nun weiter analysiert werden.
   HINWEIS: In einigen Fällen ist nach der Zentrifugation ein Pellet vorhanden. Dies kann wichtige Informationen über die Eignung der analysierten Nanoscheiben oder anderer Reaktionsverbindungen liefern, um das synthetisierte MP löslich zu halten. Es ist daher ratsam, die Menge des potentiell im Niederschlag vorhandenen Ziels durch SDS-PAGE, Western Blot oder visuelle Bewertung der Pelletgröße zu analysieren.

Ergebnisse

Der Einfluss der Feinabstimmung von Reaktionsverbindungen auf die Endausbeute oder Qualität synthetisierter MPs wird veranschaulicht. Ein häufiger Routineansatz besteht darin, die optimale^Mg2+-Konzentration in CF-Reaktionen durch Expression von grün fluoreszierendem Protein (GFP) als bequemen Monitor der Systemeffizienz einzustellen. Als Beispiel wurde GFP aus einem pET-21a(+)-Vektor bei^Mg2+-Konzentrationen zwischen 14 und 24 mM synthetisiert (Abbildung 2). Die SDS-P...

Diskussion

Der Aufbau und die Strategien zur Optimierung der CF-Expression und der co-translationalen Insertion von funktionellen MPs in Nanoscheiben werden beschrieben. Die erforderliche Ausrüstung umfasst einen Bioreaktor, eine französische Pressvorrichtung oder ähnliches, einen UV/VIS- und Fluoreszenzreader, CF-Reaktionsgefäße, die für einen Zwei-Kompartiment-Konfigurationsaufbau geeignet sind, und einen temperaturgesteuerten Inkubator. Weitere Standardgeräte sind Zentrifugen zur Gewinnung von E. coli-Zellen sowi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG)	Avanti Polar Lipids (USA)	840445P
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids (USA)	850345C
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC)	Avanti Polar Lipids (USA)	850375C
1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG)	Avanti Polar Lipids (USA)	840475C
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids (USA)	850457C
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG)	Avanti Polar Lipids (USA)	840034C
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris)	Carl Roth (Germany)	4855
2-Mercaptoethanol	Carl Roth (Germany)	4227
2-Propanol	Carl Roth (Germany)	9781
[3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride	American Radiolabeled Chemicals (USA)	ART0134
Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP)	Merck (Germany)	1409
Adenosine 5’-triphosphate (ATP)	Sigma Aldrich (Germany)	A9251
Alprenolol hydrochloride	Merck (Germany)	A0360000
Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose®	Sigma-Aldrich (Germany)	Q1126
Autoclave Type GE 446EC-1	Gettinge (Germany)
Bioreactor Type 884 124/1	B.Braun (Germany)
Centrifuge	Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)
Cholic acid	Carl Roth (Germany)	8137
Coomassie Brilliant Blue R250	Carl Roth (Germany)	3862
Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks	Schott Duran (Germany)
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt	Sigma-Aldrich (Germany)	C1506
D-glucose monohydrate	Carl Roth (Germany)	6780
Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate	Carl Roth (Germany)	6878
Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing	Fisher Scientific (Germany)	8700152
Dithiothreit	Carl Roth (Germany)	6908
Ethanol	Carl Roth (Germany)	K928
Folinic acid calcium salt hydrate	Sigma-Aldrich (Germany)	47612
French pressure cell disruptor	SLM; Amico Instruments (USA)
Glycerol	Carl Roth (Germany)	3783
Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP)	Sigma-Aldrich (Germany)	G8877
Hydrochloric Acid	Carl Roth (Germany)	K025
IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL	GE Life Sciences (Germany)	GE17-5248
Imidazole	Carl Roth (Germany)	3899
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)	Carl Roth (Germany)	2316
Kanamycin	Carl Roth (Germany)	T832
L-Alanine	Carl Roth (Germany)	3076.1
L-Arginine	Carl Roth (Germany)	6908
L-Asparagine	Carl Roth (Germany)	HN23
L-Aspartic Acid	Carl Roth (Germany)	T202
L-Cysteine	Carl Roth (Germany)	T203
L-Glutamic Acid	Carl Roth (Germany)	3774
L-Glutamine	Carl Roth (Germany)	3772
L-Glycine	Carl Roth (Germany)	3187
L-Histidine	Carl Roth (Germany)	3852
L-Isoleucine	Carl Roth (Germany)	3922
L-Leucine	Carl Roth (Germany)	1699
L-Lysine	Carl Roth (Germany)	4207
L-Methionine	Carl Roth (Germany)	9359
L-Proline	Carl Roth (Germany)	1713
L-Phenylalanine	Carl Roth (Germany)	1709
L-Serine	Carl Roth (Germany)	4682
L-Threonine	Carl Roth (Germany)	1738
L-Tryptophane	Carl Roth (Germany)	7700
L-Tyrosine	Carl Roth (Germany)	T207
MD100 dialysis units	Scienova (Germany)	40077
N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES)	Carl Roth (Germany)	6763
n-dodecylphosphocholine	Antrace (USA)	F308S
PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell	Biorad (Germany)
PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems	Biorad (Germany)
PAGE gel power supply: Power Pac 3000	Biorad (Germany)
Tryptone/peptone from caseine	Carl Roth (Germany)	6681
Peristaltic pump: ip-12	Ismatec (Germany)
Phosphoenol pyruvate monopotassium salt	Sigma Aldrich (Germany)	860077
Potassium dihydrogen phosphate	Carl Roth (Germany)	P018
Potassium acetate	Carl Roth (Germany)	4986
Potassium chloride	Carl Roth (Germany)	6781
Pyruvate Kinase	Roche (Germany)	10109045001
Scintillation counter: Hidex 300 SL	Hidex (Finland)
SDS pellets	Carl Roth (Germany)	8029
Sodium azide	Sigma-Aldrich (Germany)	K305
Sodium chloride	Carl Roth (Germany)	P029
Spectrophotometer Nanodrop	Peqlab (Germany)
Spectrophotometer/fluorescence reader Spark®	Tecan (Switzerland)
tRNA (E. coli)	Roche (Germany)	10109550001
Ultra sonificator	Labsonic U, B. Braun (Germany)
Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP)	Sigma-Aldrich (Germany)	U6625
Y-30 antifoam	Sigma-Aldrich (Germany)	A6457
Yeast extract	Carl Roth (Germany)	2904