ثقافة الخلايا الشحمية ثلاثية الأبعاد كنموذج لدراسة إعادة تشكيل الأنسجة الدهنية البيضاء الناجمة عن الدنف

Summary

يصف هذا البروتوكول نظام ثقافة الطباعة المغناطيسية ثلاثي الأبعاد (3D) الذي يسمح بتشريح الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) الناجمة عن وسط مكيف من الخلايا السرطانية. يسمح استخدام نظام ثقافة ثلاثي الأبعاد للخلايا الشحمية UCP1 + التي تعبر عن بروتين فلوري أخضر (GFP) بدراسة الخلايا الشحمية البيج التي تساهم في إعادة تشكيل الأنسجة الدهنية.

Abstract

يقدم دنف السرطان (CC) نفسه على أنه متلازمة ذات مظاهر متعددة ، مما يتسبب في اختلال التوازن الأيضي الملحوظ متعدد الأعضاء. في الآونة الأخيرة ، تم اقتراح تحفيز الهزال الشبكي بواسطة العديد من الوسطاء الالتهابيين ، مما قد يعطل علم وظائف الأعضاء التكاملي للأنسجة الدهنية والأنسجة الأخرى مثل الدماغ والعضلات. في هذا السيناريو ، يمكن للورم البقاء على قيد الحياة على حساب المضيف. في الأبحاث السريرية الحديثة ، ارتبطت شدة استنفاد رواسب الدهون المختلفة سلبا بنتيجة بقاء المريض. أظهرت الدراسات أيضا أن اضطرابات التمثيل الغذائي المختلفة يمكن أن تغير إعادة تشكيل الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) ، خاصة في المراحل المبكرة من تطور الدنف. يعد الخلل الوظيفي في WAT الناتج عن إعادة تشكيل الأنسجة مساهما في دنف الكلي ، حيث تتكون التعديلات الرئيسية في WAT من التغيرات الوظيفية المورفولوجية ، وزيادة تحلل الدهون في الخلايا الشحمية ، وتراكم الخلايا المناعية ، وتقليل تكوين الشحم ، والتغيرات في عدد الخلايا السلفية ، وزيادة "المنافذ" التي تحتوي على خلايا البيج / برايت.

لدراسة الجوانب المختلفة لإعادة تشكيل WAT الناجم عن دنف ، لا سيما التغييرات في الخلايا السلفية وإعادة تشكيل البيج ، كانت الثقافة ثنائية الأبعاد (2D) هي الخيار الأول للدراسات في المختبر. ومع ذلك، فإن هذا النهج لا يلخص بشكل كاف تعقيد واتضاع واتسا. تساعد المقايسات المحسنة لإعادة بناء AT ex vivo الوظيفية على فهم التفاعلات الفسيولوجية بين مجموعات الخلايا المتميزة. يصف هذا البروتوكول نظاما فعالا ثلاثي الأبعاد لزراعة أنسجة الطباعة (3D) يعتمد على الجسيمات النانوية المغناطيسية. تم تحسين البروتوكول للتحقيق في إعادة تشكيل WAT الناجمة عن العوامل الناجمة عن الدنف (CIFs). تظهر النتائج أن الثقافة ثلاثية الأبعاد هي أداة مناسبة لدراسة نمذجة WAT خارج الجسم الحي وقد تكون مفيدة للشاشات الوظيفية لتحديد الجزيئات النشطة بيولوجيا لتطبيقات مجموعات الخلايا الدهنية الفردية والمساعدة في اكتشاف العلاج المضاد للدفق الخلوي القائم على WAT.

Introduction

تتكون الكائنات الحية من خلايا في بيئات مكروية ثلاثية الأبعاد مع تفاعل خلية خلية ومصفوفة خلية وديناميكيات نقل متقنة للمغذيات والخلايا^1،2. ومع ذلك ، فقد تم إنشاء معظم المعرفة الأساسية المكتسبة في بيولوجيا الخلية باستخدام زراعة الخلايا أحادية الطبقة (2D). على الرغم من أن الثقافة ثنائية الأبعاد يمكن أن تجيب على بعض الأسئلة الميكانيكية ، إلا أن هذا النهج يلخص بشكل غير كاف البيئة الطبيعية التي توجد فيها الخلايا وقد يكون غير متوافق مع التنبؤ باستجابة دوائية معقدة¹. علاوة على ذلك ، تشعر الخلايا بمحيطها المادي من خلال النقل الميكانيكي. في الواقع ، تترجم القوى الميكانيكية إلى إشارات كيميائية حيوية تؤثر في النهاية على أنماط التعبير الجيني ومصير الخلية. في العقود القليلة الماضية ، ظهرت زراعة الأنسجة ثلاثية الأبعاد كأداة جديدة في المختبر يمكنها محاكاة البيئة المكروية في الجسم الحي بدقة أكبر. يمكن أن يؤدي ذلك إلى تجنب بعض المزالق الميكانيكية الناتجة عن مناهج 2D في المختبر³.

يعرف دنف السرطان (CC) بأنه متلازمة ذات مظاهر متعددة ، مما يتسبب في اختلال التوازن الأيضي الملحوظ متعدد الأعضاء. أثناء تطور دنف ، يخضع WAT للعديد من التغييرات المورفولوجية مما يؤدي إلى زيادة تحلل الدهون في الخلايا الشحمية ، وتراكم الخلايا المناعية ، وانخفاض تكوين الشحم ، وتغيرات في عدد الخلايا السلفية ، وزيادة "المنافذ" التي تحتوي على خلايا بيج / برايت (إعادة تشكيل البيج)⁴. ومع ذلك ، فإن تلخيص الآلية التي يؤثر بها الدنف على إعادة تشكيل WAT باستخدام النماذج المختبرية يمثل تحديا تقنيا كبيرا. في الواقع ، استخدمت بعض الدراسات التي حاولت التحقيق في اتصال الورم / الأنسجة طبقة أحادية في ثقافة الخلايا المختبرية (2D) ، للتحايل على تعقيد البيئة المكروية ثلاثية الأبعاد ل WAT.

على الرغم من أن العديد من الأساليب التجريبية تولد ثقافة ثلاثية الأبعاد ، إلا أنه يفضل استخدام ثلاث طرق تجميع مختلفة لإنتاج الأديبوسفيرويدات: الرفع المغناطيسي أو الطباعة⁵ ، والقطرة المعلقة⁶ ، وأنظمة السقالة^{Matrigel 7}. على الرغم من كونها مناسبة للشحميات ، إلا أن هذه الأنظمة لها مزايا وعيوب ويجب اختيارها وفقا لخصائص كل تصميم تجريبي. بناء على القيود المذكورة أعلاه ، تم استخدام طريقة الطباعة المغناطيسية لتوليد ثقافات الخلايا ثلاثية الأبعاد⁵. تستخدم هذه الطريقة مجموعة من الجسيمات النانوية المغناطيسية التي تتكون من جزيئات الذهب النانوية وأكسيد الحديد ، مما يجعل طريقة الطباعة مناسبة لمعظم أنواع الخلايا. هنا ، تم استخدام مزارع الخلايا ثلاثية الأبعاد للحث على تكوين الشحم ، وتم استخدام CIFs لإعادة إنتاج الحالة البيئية ل CC.

Protocol

1. حضانة الخلايا ثنائية الأبعاد مع الجسيمات النانوية المغناطيسية

1. تنمو الثقافات ثنائية الأبعاد الملتصقة إلى ~ 70٪ التقاء باستخدام إجراءات زراعة الخلايا القياسية.
2. تحضير مجموعة الجسيمات النانوية المغناطيسية. أخرجيها من الثلاجة واتركيها دافئة إلى درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) لمدة 15 دقيقة¹.
3. الوسط المختلط: أضف الجسيمات النانوية المغناطيسية مباشرة إلى 12 مل من الوسط في ألواح زراعة الخلايا مقاس 100 مم. قم بتعليق الوسط وإعادة تعليقه عدة مرات للحصول على توزيع متجانس للجسيمات النانوية.
   ملاحظة: سيظهر الوسط داكنا بسبب اللون البني لأكسيد الحديد. يوصى بتركيز 2.5 ميكرولتر / سم² من منطقة الاستزراع.
4. اغسل صفيحة الثقافة ثنائية الأبعاد مقاس 100 مم ثلاث مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
5. أضف 12 مل من الوسط المختلط من الخطوة 1.3 إلى ألواح زراعة الخلايا 100 مم. احتضان الألواح طوال الليل في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) للسماح بربط الجسيمات النانوية المغناطيسية بالخلايا

2. إنشاء ثقافات ثلاثية الأبعاد مع تجميع كروي في لوحات 96 بئر

1. بعد الحضانة طوال الليل ، اغسل الخلايا لإزالة أي وسيط متبقي وجسيمات نانوية مغناطيسية غير متصلة عن طريق تحريك الألواح برفق باستخدام 3 × 10 مل من PBS.
2. قم بشفط PBS من طبق بتري وافصل الخلايا عن طريق الحضانة بمحلول حمض رباعي الأسيتيك تريبسين - إيثيلين ديامين (EDTA) بنسبة 0.25٪ لمدة 2-5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
3. أثناء انتظار انفصال الخلايا ، قم بتطهير المحركات المغناطيسية بنسبة 70٪ من الإيثانول¹.
4. بعد انفصال الخلايا ، أضف وسيطا يحتوي على مصل بحجم 4 أضعاف حجم محلول التربسين EDTA لتحييد تأثير التربسين ، ثم انقل المعلق إلى أنبوب مخروطي الشكل.
5. جهاز الطرد المركزي للتعليق ، عند 500 × جم لمدة 10 دقائق. استنشق المادة الطافية ، مع الحرص على عدم لمس الحبيبات.
   ملاحظة: بعد الطرد المركزي ، يجب أن تظهر الخلايا بنية اللون ، ويجب أن تظهر معلقات الخلايا في الوسط أغمق من المعتاد. يجب أن تظهر الخلايا مليئة بالجسيمات النانوية¹.
6. عد الخلايا المعلقة واحسب حجم الأحجام المتوسطة اللازمة لإنشاء ثقافات ثلاثية الأبعاد. بالنسبة للأديبوسفيرويدات، استخدم 5,000 إلى 10,000 خلية في 150 ميكرولتر في ألواح 96 بئرا.
7. باستخدام مجموعة الطباعة الحيوية المكونة من 96 بئرا ، ضع لوحة طاردة للخلايا من 96 بئرا في الجزء العلوي من محرك الأقراص الكروي.
8. ماصة 150 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من الصفيحة المكونة من 96 بئرا وأغلق اللوحة للسماح للخلايا بالتجمع في الأسفل على شكل مغناطيس.
9. اترك اللوحة على محرك كروي في الحاضنة لمدة 1-2 ساعة للحصول على كروي كفء.
   ملاحظة: يجب أن تظهر هذه الثقافات كثيفة وبنية ويجب طباعتها في اللوحة (الشكل S1). يقدم الشكل S2 سير عمل ملخص للخطوات الرئيسية للطباعة المغناطيسية ثلاثية الأبعاد للتجميع الكروي في ألواح 96 بئرا.

3. تحريض الشحم الأبيض

1. إعداد وسائط الصيانة والحث⁸ ؛ تحضير وسط الحث قبل كل استخدام.
   1. تحضير وسط الصيانة الذي يحتوي على 5 ميكروغرام / مل من الأنسولين (مخزون 10 مجم / مل مخزن عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع واحد) و 0.5 ميكرومتر روزيغليتازون (10 ملي مولار مخزون في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)).
   2. تحضير وسط تحريضي يحتوي على 125 ميكرومتر من الإندوميتاسين من مخزون 0.125 م في الإيثانول ، و 2 ميكروغرام / مل من ديكساميثازون من مخزون 2 مجم / مل في الإيثانول ، و 0.5 ملي مولار من إيزوبوتيل -1 ميثيل زانثين (IBMX) من مخزون 0.25 مليون في DMSO ، و 0.5 ميكرومتر روزيغليتازون من مخزون 10 ملي مولار في DMSO.
      ملاحظة: سخني الإندوميتاسين إلى 60 درجة مئوية حتى يذوب.
2. بعد 24-48 ساعة من طباعة الكرويات ، استبدل الوسط الكامل العادي بوسط الحث (اليوم 0).
3. بعد 48 ساعة (اليوم 2) ، استبدل وسط الحث بوسط الصيانة.
4. قم بتغيير الوسط كل 3-5 أيام حتى تتمايز الخلايا تماما.
   ملاحظة: بشكل عام ، بعد 7-8 أيام من التحفيز باستخدام وسط الحث ، تتمايز الخلايا إلى خلايا دهنية ناضجة وتمتلئ بقطرات الزيت التي يمكن رؤيتها عند حواف الأديبوسفيرويدات.

4. إنتاج وسط مكيف لسرطان الرئة لويس (LLC-CM)

1. خلايا سرطان الرئة لويس بذرة (LL / 2) في صفائح زراعة الخلايا 100 مم في وسط النمو بكثافة 6000 خلية / سم².
   ملاحظة: يحتوي وسط النمو على وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع 10٪ مصل بقري للجنين (FBS) و 100 وحدة / مل من البنسلين والستربتومايسين.
2. بعد يومين ، استبدل الوسط الموجود في كل طبق بوسط نمو جديد.
   ملاحظة: تحتوي خلايا LL / 2 على مزيج غير متجانس من الخلايا الملتصقة (العدد الأعلى) والخلايا العائمة.
3. بعد يومين (اليوم 4) ، قم بحصاد الوسط المكيف ، وقم بتنظيفه من الخلايا والحطام عن طريق الطرد المركزي (500 × جم ، 10 دقائق).
4. قم بتجميد كميات الوسط المكيف في النيتروجين السائل لاستخدامها لاحقا.
   ملاحظة: لعلاج الكرات بالوسط المكيف ، استخدم مزيجا من 75٪ وسط نمو طازج و 25٪ وسط مكيف LLC.

النتائج

الأديبوسفيرويد من ثقافة ثلاثية الأبعاد لخلايا الكسر الوعائي اللحمي (SVF)
تم إعداد كل من الثقافات ثلاثية الأبعاد و 2D المتجمعة بنفس الأعداد من خلايا SVF من نفس مستحضر WAT الإربي للفأر (الشكل 1 أ ، الشكل 1 ب) وإخضاعها ل?...

Discussion

يضع هذا البروتوكول نظاما ثلاثي الأبعاد لزراعة الخلايا الشحمية لدراسة تمايز الخلايا الشحمية في الأديبوسفيرويد المشتقة من خلايا SVF الأولية من WAT. بالمقارنة مع ثقافة التمسك 2D التقليدية ، يسهل هذا النظام ثلاثي الأبعاد إعادة عرض AT ، والذي يشبه إلى حد كبير ظروف الجسم الحي. في ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-5879	Cell culture
96-Well Bioprinting Kit, black	Greiner (Monroe, NC, USA)	655841	Cell culture
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-606-152	Immunofluorescence staining, secondary, 1:400 in TBS with 0.1% Tween-20
CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM, µCLEAR, BLACK, CELLSTAR, CELL-REPELLENT SURFACE, LID, STERILE, 8 PCS./BAG	Greiner (Monroe, NC, USA)	655976	Cell culture
Dexamethasone	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D-1756	Cell culture
DMEM	Corning (Manassas, VA, USA)	10-017-CV	Cell culture
Fetal Bovine Serum (Tova)	Gemini Bio (West Sacramento, CA)	100-500	Cell culture
Indomethacin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-7378	Cell culture
Insulin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I0516	Cell culture
LL/2 (LLC1) (ATCC CRL-1642)	American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)	CRL-1642	Lewis Lung Carcinoma cell line
NanoShuttle-PL	Greiner (Monroe, NC, USA)	657843	Cell culture
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	ThermoFisher (Waltham, MA, USA)	R37606	Immunofluorescence staining, following the manufacturer's instructions
Pen strep	Corning (Manassas, VA, USA)	30-002-CI	Cell culture
Perilipin-1 (D1D8) XP Rabbit mAb	Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)	9349	Immunofluorescence staining, primary, 1:1000 in TBS with 0.1% Tween-20
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	R-2408	Cell culture
Trypsin-EDTA, 0.05%	Corning (Manassas, VA, USA)	25-052-CI	Cell culture
Reverse-transcription PCR primers
Primer	Forward	Reverse
Adipoq	GTTCCCAATGTACCCATTCGC	TGTTGCAGTAGAACTTGCCAG
Col4a1	TCCAAGGGCGAAGTGGGTTT	ACCCTTGCTCGCCTTTGACT
Cyclophilin a	ATGGCACTGGCGGCAGGTCC	TTGCCATTCCTGGACCCAAA
Fabp4	TGGTGACAAGCTGGTGGTGGAATG	TCCAGGCCTCTTCCTTTGGCTCA
Fn1	GCTTCCCCAACTGGTTACCCT	GGGTTGGTGATGAAGGGGGT
Pgc1a	GAAAACAGGAACAGCAGCAGAG	GGGGTCAGAGGAAGAGATAAAG
Ucp1	TCCTAGGGACCATCACCACCC	AGCCGGCTGAGATCTTGTTTCC
Mouse genotyping
Primer name	Description	Sequence
Cre F	Generic Cre forward	GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC
Cre R	Generic Cre reverse	GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT
oIMR7318	mT/mG forward	CTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT
oIMR7319	mT/mG wild type reverse	CGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA
oIMR7320	mT/mG mutant reverse	TCA ATG GGC GGG GGT CGT T
WH336	UCP1 mutant forward	CAA TCT GGG CTT AAC GGG TCC TC
WH337	UCP1 mutant reverse	GTT GCA TCG ACC GGT TAA TGC AG
WH338	UCP1 wild type forward	GGT CAG CCT AAT TAG CTC TGT
WH339	UCP1 wild type reverse	GAT CTC CAG CTC CTC CTC TGT C