Трехмерная культура адипоцитов в качестве модели для изучения ремоделирования белой жировой ткани, вызванного кахексией

Резюме

Этот протокол описывает трехмерную (3D) систему магнитной печати, которая позволяет рассекать ремоделирование белой жировой ткани (WAT), вызванное кондиционированной средой из раковых клеток. Использование 3D-системы культивирования адипоцитов UCP1+, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP), позволяет изучить бежевые адипоциты, способствующие ремоделированию жировой ткани.

Аннотация

Раковая кахексия (КК) проявляется в виде синдрома с множественными проявлениями, вызывающего выраженный полиорганный метаболический дисбаланс. В последнее время было высказано предположение, что кахектическое истощение стимулируется несколькими медиаторами воспаления, что может нарушить интегративную физиологию жировых тканей и других тканей, таких как мозг и мышцы. В этом сценарии опухоль может выжить за счет хозяина. В недавних клинических исследованиях интенсивность истощения различных жировых отложений отрицательно коррелировала с исходом выживаемости пациента. Исследования также показали, что различные метаболические нарушения могут изменить ремоделирование белой жировой ткани (WAT), особенно на ранних стадиях развития кахексии. Дисфункция ВАТ, возникающая в результате ремоделирования тканей, является фактором общей кахексии, при этом основные модификации ВАТ состоят из морфофункциональных изменений, увеличения липолиза адипоцитов, накопления иммунных клеток, снижения адипогенеза, изменений в популяции клеток-предшественников и увеличения «ниш», содержащих бежевые/бритовые клетки.

Для изучения различных аспектов ремоделирования ВАТ, вызванного кахексией, в частности, изменений клеток-предшественников и бежевого ремоделирования, двумерная (2D) культура была первым вариантом для исследований in vitro. Однако этот подход не позволяет адекватно обобщить сложность WAT. Усовершенствованные анализы для реконструкции функционального AT ex vivo помогают понять физиологические взаимодействия между различными клеточными популяциями. Этот протокол описывает эффективную трехмерную (3D) печатную систему культивирования тканей на основе магнитных наночастиц. Протокол оптимизирован для исследования ремоделирования WAT, вызванного факторами, индуцированными кахексией (CIF). Результаты показывают, что 3D-культура является подходящим инструментом для изучения моделирования WAT ex vivo и может быть полезна для функционального скрининга для идентификации биоактивных молекул для применения отдельных популяций жировых клеток и помочь в открытии антикахектической терапии клеток на основе WAT.

Введение

Живые организмы состоят из клеток в трехмерном микроокружении с межклеточным и клеточным матриксным взаимодействием и сложной динамикой транспортировки питательных веществ и клеток ^1,2. Тем не менее, большая часть фундаментальных знаний, полученных в области клеточной биологии, была получена с помощью монослойной клеточной культуры (2D). Несмотря на то, что двумерная культура может ответить на некоторые механистические вопросы, этот подход неадекватно отражает естественную среду, в которой находятся клетки, и может быть несовместим с прогнозированием сложной реакции на лекарство^. Более того, клетки ощущают свое физическое окружение посредством механотрансдукции. Действительно, механические силы преобразуются в биохимические сигналы, которые в конечном итоге влияют на паттерны экспрессии генов и судьбу клетки. В последние несколько десятилетий 3D-культура тканей стала новым инструментом in vitro, который может имитировать микроокружение in vivo с большей точностью. Это позволяет избежать некоторых механистических ловушек, порожденных подходами in vitro 2D³.

Раковая кахексия (КК) определяется как синдром с множественными проявлениями, вызывающий выраженный полиорганный метаболический дисбаланс. Во время развития кахексии WAT претерпевает многочисленные морфологические изменения, приводящие к увеличению липолиза адипоцитов, накоплению иммунных клеток, снижению адипогенеза, изменению популяции клеток-предшественников и увеличению «ниш», содержащих бежевые/бритовые клетки (бежевое ремоделирование)⁴. Тем не менее, повторение механизма, с помощью которого кахексия влияет на ремоделирование WAT с использованием моделей in vitro, представляет собой значительную техническую проблему. Действительно, в нескольких исследованиях, в которых предпринимались попытки изучить коммуникацию между опухолью и тканью, использовался монослой клеточной культуры in vitro (2D), обходя сложность трехмерного микроокружения WAT.

Несмотря на то, что существует несколько экспериментальных подходов к созданию 3D-культуры, для получения одипосфероидов предпочтительны три различных метода сборки: магнитная левитация или печать⁵, подвесная капля⁶ и системы матригель-скаффолда⁷. Несмотря на то, что эти системы подходят для адипосфероидов, они имеют преимущества и недостатки и должны выбираться в соответствии с характеристиками каждого экспериментального проекта. Исходя из упомянутых выше ограничений, для создания 3D-клеточных культур был использован метод магнитной печати⁵. В этом методе используется сборка магнитных наночастиц, состоящая из наночастиц золота и оксида железа, что делает метод печати подходящим для большинства типов клеток. Здесь 3D-культуры клеток использовались для индуцирования адипогенеза, а CIF — для воспроизведения условий окружающей среды CC.

протокол

1. Инкубация 2D клеток с магнитными наночастицами

1. Выращивайте адгезивные 2D-культуры до ~ 70% конфлюенции, используя стандартные процедуры культивирования клеток.
2. Подготовьте сборку магнитных наночастиц. Достаньте его из холодильника и дайте ему нагреться до комнатной температуры (20-25 °C) в течение примерно 15 минут¹.
3. Смешанная среда: Добавьте магнитные наночастицы непосредственно в 12 мл среды в 100 мм клеточных культуральных планшетах. Суспендируйте и повторно суспендируйте среду несколько раз, чтобы получить однородное распределение наночастиц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Среда будет казаться темной из-за коричневого цвета оксида железа. Рекомендуется концентрация 2,5 мкл/^см2 площади культивирования.
4. Промойте 100 мм 2D культуральную пластину три раза фосфатно-соевым буфером (PBS).
5. Добавьте 12 мл смешанной среды с шага 1.3 в 100 мм клеточные культуральные планшеты. Инкубируйте планшеты в течение ночи в инкубаторе (37 °C, 5%_CO2), чтобы магнитные наночастицы могли прикрепиться к клеткам

2. Создание 3D культур со сборкой сфероидов в 96-луночных планшетах

1. После ночной инкубации промойте клетки, чтобы удалить остатки среды и неприкрепленные магнитные наночастицы, осторожно перемешав планшеты с 3 x 10 мл PBS.
2. Отсадите PBS из чашки Петри и отделите клетки путем инкубации с 0,25% раствором трипсин-этилендиамина тетрауксусной кислоты (ЭДТА) в течение 2-5 минут при 37 °C.
3. Пока вы ждете, пока элементы отсоединятся, продезинфицируйте магнитные накопители 70%^{этанолом1}.
4. После того, как клетки отделятся, добавьте сыворотку, содержащую среду, в 4 раза превышающую объем раствора трипсина-ЭДТА, чтобы нейтрализовать действие трипсина, а затем перенесите суспензию в коническую пробирку.
5. Центрифугируйте суспензию при 500 × г в течение 10 мин. Отсасывайте надосадочную жидкость, стараясь не задевать гранулы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования клетки должны казаться коричневыми, а клеточные суспензии в среде должны казаться темнее, чем обычно. Клетки должны казаться приправленными наночастицами¹.
6. Посчитайте клетки в суспензии и рассчитайте объем среды, необходимый для создания 3D-культур. Для лечения жировых сфероидов используйте от 5000 до 10000 клеток в 150 мкл в 96-луночных планшетах.
7. Используя набор для биопечати на 96 лунок, поместите 96-луночную пластину, отталкивающую клетки, в верхнюю часть сфероидального привода.
8. Нанесите пипеткой 150 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета и закройте пластину, чтобы позволить ячейкам агрегироваться на дне в форме магнита.
9. Оставьте пластину на приводе сфероида в инкубаторе на 1-2 ч для получения грамотного сфероида.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти культуры должны казаться плотными и коричневыми и должны быть напечатаны на пластине (Рисунок S1). На рисунке S2 представлен краткий рабочий процесс основных этапов 3D-магнитной печати сфероидной сборки в 96-луночных пластинах.

3. Индукция адипогенеза по Уайту

1. Подготовка обслуживающих и индукционных сред⁸; Подготавливайте индукционную среду перед каждым использованием.
   1. Готовят поддерживающую среду, содержащую 5 мкг/мл инсулина (запас 10 мг/мл при температуре 4 °С в течение одной недели) и 0,5 мкМ росиглитазона (запас 10 мМ в диметилсульфоксиде (ДМСО)).
   2. Готовят индукционную среду, содержащую 125 мкМ индометацин из 0,125 М в этаноле, 2 мкг/мл дексаметазона из 2 мг/мл в этаноле, 0,5 мМ изобутил-1-метилксантина (IBMX) из 0,25 М в ДМСО и 0,5 мкМ росиглитазона из 10 мМ в ДМСО.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нагрейте индометацин до 60 °C для растворения.
2. Через 24-48 часов после печати сфероидов замените обычный готовый носитель на индукционный носитель (день 0).
3. Через 48 ч (день 2) замените индукционную среду на поддерживающую.
4. Меняйте среду каждые 3-5 дней до полной дифференцировки клеток.
   Примечание: Как правило, после 7-8 дней стимуляции индукционной средой клетки дифференцируются в зрелые жировые клетки и заполняются масляными каплями, которые можно увидеть по краям жировых слоев.

4. Производство кондиционированной среды для лечения карциномы легкого Льюиса (LLC-CM)

1. Семена клеток карциномы легкого Льюиса (LL/2) в 100 мм клеточных культуральных планшетах в питательной среде с плотностью 6000 клеток/^см2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Питательная среда содержит модифицированную среду Дульбекко Eagle's Medium (DMEM) с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 100 ЕД/мл пенициллин-стрептомицина.
2. Через 2 дня замените среду в каждой тарелке свежей средой для роста.
   Примечание: Клетки LL/2 содержат гетерогенную смесь адгезивных (большее число) и плавающих клеток.
3. Через 2 дня (день 4) соберите кондиционированную среду и очистите ее от клеток и мусора центрифугированием (500 × г, 10 мин).
4. Заморозьте аликвоты кондиционированной среды в жидком азоте для последующего использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для лечения сфероидов кондиционированной средой используйте комбинацию 75% свежей питательной среды и 25% кондиционированной LLC-среды.

Результаты

Ожиросфероиды из 3D-культуры клеток стромально-васкулярной фракции (SVF)
Как 3D, так и конфлюентные 2D культуры были созданы с одинаковым количеством клеток SVF из одного и того же пахового препарата WAT мыши (рис. 1A, рис....

Обсуждение

Этот протокол создает 3D-систему клеточных культур для изучения дифференцировки адипоцитов у адипосфероидов, полученных из первичных клеток SVF из WAT. По сравнению с обычной 2D-акгезивной культурой, эта 3D-система облегчает ремоделирование AT, которое очень похоже на усло?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-5879	Cell culture
96-Well Bioprinting Kit, black	Greiner (Monroe, NC, USA)	655841	Cell culture
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-606-152	Immunofluorescence staining, secondary, 1:400 in TBS with 0.1% Tween-20
CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM, µCLEAR, BLACK, CELLSTAR, CELL-REPELLENT SURFACE, LID, STERILE, 8 PCS./BAG	Greiner (Monroe, NC, USA)	655976	Cell culture
Dexamethasone	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D-1756	Cell culture
DMEM	Corning (Manassas, VA, USA)	10-017-CV	Cell culture
Fetal Bovine Serum (Tova)	Gemini Bio (West Sacramento, CA)	100-500	Cell culture
Indomethacin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-7378	Cell culture
Insulin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I0516	Cell culture
LL/2 (LLC1) (ATCC CRL-1642)	American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)	CRL-1642	Lewis Lung Carcinoma cell line
NanoShuttle-PL	Greiner (Monroe, NC, USA)	657843	Cell culture
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	ThermoFisher (Waltham, MA, USA)	R37606	Immunofluorescence staining, following the manufacturer's instructions
Pen strep	Corning (Manassas, VA, USA)	30-002-CI	Cell culture
Perilipin-1 (D1D8) XP Rabbit mAb	Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)	9349	Immunofluorescence staining, primary, 1:1000 in TBS with 0.1% Tween-20
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	R-2408	Cell culture
Trypsin-EDTA, 0.05%	Corning (Manassas, VA, USA)	25-052-CI	Cell culture
Reverse-transcription PCR primers
Primer	Forward	Reverse
Adipoq	GTTCCCAATGTACCCATTCGC	TGTTGCAGTAGAACTTGCCAG
Col4a1	TCCAAGGGCGAAGTGGGTTT	ACCCTTGCTCGCCTTTGACT
Cyclophilin a	ATGGCACTGGCGGCAGGTCC	TTGCCATTCCTGGACCCAAA
Fabp4	TGGTGACAAGCTGGTGGTGGAATG	TCCAGGCCTCTTCCTTTGGCTCA
Fn1	GCTTCCCCAACTGGTTACCCT	GGGTTGGTGATGAAGGGGGT
Pgc1a	GAAAACAGGAACAGCAGCAGAG	GGGGTCAGAGGAAGAGATAAAG
Ucp1	TCCTAGGGACCATCACCACCC	AGCCGGCTGAGATCTTGTTTCC
Mouse genotyping
Primer name	Description	Sequence
Cre F	Generic Cre forward	GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC
Cre R	Generic Cre reverse	GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT
oIMR7318	mT/mG forward	CTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT
oIMR7319	mT/mG wild type reverse	CGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA
oIMR7320	mT/mG mutant reverse	TCA ATG GGC GGG GGT CGT T
WH336	UCP1 mutant forward	CAA TCT GGG CTT AAC GGG TCC TC
WH337	UCP1 mutant reverse	GTT GCA TCG ACC GGT TAA TGC AG
WH338	UCP1 wild type forward	GGT CAG CCT AAT TAG CTC TGT
WH339	UCP1 wild type reverse	GAT CTC CAG CTC CTC CTC TGT C