三维脂肪细胞培养作为研究恶病质诱导的白色脂肪组织重塑的模型

摘要

该方案描述了一种三维 （3D） 磁印培养系统，该系统允许解剖由癌细胞的条件培养基诱导的白色脂肪组织 （WAT） 重塑。使用表达绿色荧光蛋白 （GFP） 的 UCP1 + 脂肪细胞的 3D 培养系统可以研究有助于脂肪组织重塑的米色脂肪细胞。

摘要

癌症恶病质 （CC） 表现为一种具有多种表现的综合征，导致明显的多器官代谢失衡。最近，有人提出恶病质消耗是由几种炎症介质刺激的，这可能会破坏脂肪组织和其他组织（如大脑和肌肉）的综合生理学。在这种情况下，肿瘤可以以宿主为代价存活。在最近的临床研究中，不同脂肪沉积物的消耗强度与患者的生存结果呈负相关。研究还表明，各种代谢紊乱可以改变白色脂肪组织 （WAT） 重塑，尤其是在恶病质发展的早期阶段。组织重塑导致的 WAT 功能障碍是整体恶病质的一个因素，WAT 的主要改变包括形态功能变化、脂肪细胞脂肪分解增加、免疫细胞积累、脂肪生成减少、祖细胞群变化以及包含米色/BRITE 细胞的“生态位”增加。

为了研究恶病质诱导的 WAT 重塑的各个方面，特别是祖细胞和米色重塑的变化，二维 （2D） 培养一直是体外研究的首选。但是，这种方法并不能充分总结 WAT 复杂性。用于体外 功能性 AT 重建的改进测定有助于理解不同细胞群之间的生理相互作用。该协议描述了一种基于磁性纳米颗粒的高效三维 （3D） 打印组织培养系统。该方案针对研究恶病质诱导因子 （CIF） 诱导的 WAT 重塑进行了优化。结果表明，3D 培养是研究离体 WAT 建模的合适工具，可用于功能筛选，以识别用于单个脂肪细胞群应用的生物活性分子，并有助于发现基于 WAT 的细胞抗恶病质疗法。

引言

生物体由 3D 微环境中的细胞组成，细胞间和细胞间基质相互作用，营养物质和细胞的复杂运输动力学 ^1,2。然而，在细胞生物学中获得的大部分基础知识都是使用单层细胞培养 （2D） 产生的。尽管 2D 培养可以回答一些机制问题，但这种方法不能充分概括细胞所在的自然环境，并且可能与预测复杂的药物反应不相容¹。此外，细胞通过机械转导感知其物理环境。事实上，机械力被转化为生化信号，最终影响基因表达模式和细胞的命运。在过去的几十年里，3D 组织培养已成为一种新的体外工具，可以更保真地模拟体内微环境。这可以避免体外 2D 方法产生的一些机械陷阱³.

癌症恶病质 （CC） 被定义为具有多种表现的综合征，导致明显的多器官代谢失衡。在恶病质发育过程中，WAT 经历许多形态变化，导致脂肪细胞脂肪分解增加、免疫细胞积累、脂肪生成减少、祖细胞群变化以及包含米色/brite 细胞的“生态位”增加（米色重塑）⁴。然而，使用体外模型概括恶病质影响 WAT 重塑的机制是一项重大的技术挑战。事实上，一些试图研究肿瘤/组织通讯的研究使用了单层体外细胞培养 （2D），规避了 WAT 3D 微环境的复杂性。

尽管有几种实验方法产生 3D 培养物，但生产脂肪球首选三种不同的组装方法：磁悬浮或打印 5 （magnetic levitation or printing^）、悬滴⁶ （high drop） 和基质胶支架系统⁷（Matrigel-scaffold systems）。尽管适用于脂肪体，但这些系统有优点和缺点，应根据每个实验设计的特性进行选择。基于上述限制，使用磁性打印方法生成 3D 细胞培养物⁵。该方法使用由金纳米颗粒和氧化铁组成的磁性纳米颗粒组件，使打印方法适用于大多数细胞类型。在这里，使用 3D 细胞培养物诱导脂肪生成，并使用 CIF 来重现 CC 的环境条件。

研究方案

1. 2D 细胞与磁性纳米颗粒的孵育

1. 使用标准细胞培养程序将贴壁 2D 培养物培养至 ~ 70% 汇合度。
2. 准备磁性纳米颗粒组件。将其从冰箱中取出，加热至室温 （20-25 °C） 约 15 分钟¹。
3. 混合培养基：将磁性纳米颗粒直接添加到 100 mm 细胞培养板中的 12 mL 培养基中。悬浮和重悬培养基几次，以获得纳米颗粒的均匀分布。
   注意： 由于氧化铁呈棕色，培养基会显得较暗。建议培养面积的浓度为 2.5 μL/cm² 。
4. 用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤 100 mm 2D 培养板 3 次。
5. 将步骤 1.3 中的 12 mL 混合培养基添加到 100 mm 细胞培养板中。将板在培养箱（37°C，5% CO_{2 ）}中孵育过夜，以使磁性纳米颗粒附着在细胞上

2. 在 96 孔板中使用球状体组装创建 3D 培养物

1. 孵育过夜后，用 3 x 10 mL PBS 轻轻搅动板，洗涤细胞以去除任何残留的培养基和未附着的磁性纳米颗粒。
2. 从培养皿中吸出 PBS，并通过在 37 °C 下与 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸 （EDTA） 溶液孵育 2-5 分钟来分离细胞。
3. 在等待细胞分离的同时，用 70% 乙醇¹ 对磁力驱动器进行消毒。
4. 细胞分离后，加入体积为 4 倍胰蛋白酶-EDTA 溶液的含血清培养基以中和胰蛋白酶的作用，然后将悬浮液转移到锥形管中。
5. 将悬浮液以 500 × g 离心 10 分钟。吸出上清液，注意不要接触沉淀。
   注：离心后，细胞应呈棕色，培养基中的细胞悬液应比平时更深。细胞应该看起来充满了纳米颗粒¹。
6. 对悬浮液中的细胞进行计数，并计算创建 3D 培养物所需的培养基体积。对于脂肪球，在 96 孔板中使用 5,000 至 10,000 个细胞，溶于 150 μL 中。
7. 使用 96 孔生物打印试剂盒，将细胞驱斥 96 孔板放置在 Spheroid Drive 的顶部。
8. 将 150 μL 细胞悬液移液到 96 孔板的每个孔中，然后关闭板，让细胞以磁铁的形状聚集在底部。
9. 将板放在培养箱中的球体驱动器上 1-2 小时，以产生合格的球体。
   注意：这些培养物应呈致密和棕色，并应打印在板中（图 S1）。 图 S2 显示了 96 孔板中球状体组装体的 3D 磁性打印主要步骤的摘要工作流程。

3. 白色脂肪生成诱导

1. 准备维护和诱导介质⁸;每次使用前准备诱导培养基。
   1. 准备含有 5 μg/mL 胰岛素（10 mg/mL 原液在 4°C 下储存一周）和 0.5 μM 罗格列酮（10 mM 二甲基亚砜 （DMSO） 原液）的维持培养基。
   2. 制备含有 125 μM 吲哚美辛（来自 0.125 M 乙醇原液）、2 μg/mL 地塞米松（来自 2 mg/mL 乙醇原液）、0.5 mM 异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）来自 0.25 M DMSO 原液的诱导培养基，以及来自 10 mM 原液的 0.5 μM 罗格列酮DMSO 溶液。
      注意：将吲哚美辛加热至 60 °C 以溶解。
2. 打印球体 24-48 小时后，用诱导培养基替换常规完全培养基（第 0 天）。
3. 48 小时后（第 2 天），用维持培养基更换诱导培养基。
4. 每 3-5 天更换一次培养基，直到细胞完全分化。
   注意：通常，用诱导培养基刺激 7-8 天后，细胞分化为成熟的脂肪细胞，并充满油滴，可以在脂肪球的边缘看到。

4. Lewis 肺癌条件培养基 （LLC-CM） 的生产

1. 将 Lewis 肺癌 （LL/2） 细胞以 6000 个细胞/cm² 的密度接种在生长培养基中的 100 mm 细胞培养板中。
   注：生长培养基含有 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 （DMEM），含 10% 胎牛血清 （FBS） 和 100 U/mL 青霉素-链霉素。
2. 2 天后，用新鲜的生长培养基替换每个板中的培养基。
   注：LL/2 细胞包含贴壁细胞（数量较多）和漂浮细胞的异质混合物。
3. 2 天后（第 4 天），收获条件培养基，并通过离心（500 × g，10 分钟）清除细胞和碎片。
4. 将等分试样的调节培养基在液氮中冷冻以备后用。
   注：要使用条件培养基处理球状体，请使用 75% 新鲜生长培养基和 25% LLC 条件培养基的组合。

结果

来自基质血管部分 （SVF） 细胞 3D 培养的脂肪球
用来自同一小鼠腹股沟 WAT 制剂的相同数量的 SVF 细胞建立 3D 和汇合的 2D 培养物 （图 1A、图 1B），并进行相同的实验方案以比较基因表达标记。用诱导培养基刺激的球体随着时间的推移而膨胀。图 2B 显示 2D 多房细胞...

讨论

该方案建立了一个 3D 细胞培养系统，用于研究源自 WAT 的原代 SVF 细胞的脂肪球中的脂肪细胞分化。与传统的 2D 贴壁培养相比，该 3D 系统促进了 AT 重塑，这与体内条件非常相似。在过去几年中，研究表明，与 2D 培养系统相比，3D 培养细胞会产生不同的细胞形态和信号传导³。3D 成纤维细胞形态与 2D¹⁴ 不同。在乳腺上皮细胞中，3D 培养?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-5879	Cell culture
96-Well Bioprinting Kit, black	Greiner (Monroe, NC, USA)	655841	Cell culture
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-606-152	Immunofluorescence staining, secondary, 1:400 in TBS with 0.1% Tween-20
CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM, µCLEAR, BLACK, CELLSTAR, CELL-REPELLENT SURFACE, LID, STERILE, 8 PCS./BAG	Greiner (Monroe, NC, USA)	655976	Cell culture
Dexamethasone	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D-1756	Cell culture
DMEM	Corning (Manassas, VA, USA)	10-017-CV	Cell culture
Fetal Bovine Serum (Tova)	Gemini Bio (West Sacramento, CA)	100-500	Cell culture
Indomethacin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-7378	Cell culture
Insulin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I0516	Cell culture
LL/2 (LLC1) (ATCC CRL-1642)	American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)	CRL-1642	Lewis Lung Carcinoma cell line
NanoShuttle-PL	Greiner (Monroe, NC, USA)	657843	Cell culture
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	ThermoFisher (Waltham, MA, USA)	R37606	Immunofluorescence staining, following the manufacturer's instructions
Pen strep	Corning (Manassas, VA, USA)	30-002-CI	Cell culture
Perilipin-1 (D1D8) XP Rabbit mAb	Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)	9349	Immunofluorescence staining, primary, 1:1000 in TBS with 0.1% Tween-20
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	R-2408	Cell culture
Trypsin-EDTA, 0.05%	Corning (Manassas, VA, USA)	25-052-CI	Cell culture
Reverse-transcription PCR primers
Primer	Forward	Reverse
Adipoq	GTTCCCAATGTACCCATTCGC	TGTTGCAGTAGAACTTGCCAG
Col4a1	TCCAAGGGCGAAGTGGGTTT	ACCCTTGCTCGCCTTTGACT
Cyclophilin a	ATGGCACTGGCGGCAGGTCC	TTGCCATTCCTGGACCCAAA
Fabp4	TGGTGACAAGCTGGTGGTGGAATG	TCCAGGCCTCTTCCTTTGGCTCA
Fn1	GCTTCCCCAACTGGTTACCCT	GGGTTGGTGATGAAGGGGGT
Pgc1a	GAAAACAGGAACAGCAGCAGAG	GGGGTCAGAGGAAGAGATAAAG
Ucp1	TCCTAGGGACCATCACCACCC	AGCCGGCTGAGATCTTGTTTCC
Mouse genotyping
Primer name	Description	Sequence
Cre F	Generic Cre forward	GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC
Cre R	Generic Cre reverse	GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT
oIMR7318	mT/mG forward	CTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT
oIMR7319	mT/mG wild type reverse	CGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA
oIMR7320	mT/mG mutant reverse	TCA ATG GGC GGG GGT CGT T
WH336	UCP1 mutant forward	CAA TCT GGG CTT AAC GGG TCC TC
WH337	UCP1 mutant reverse	GTT GCA TCG ACC GGT TAA TGC AG
WH338	UCP1 wild type forward	GGT CAG CCT AAT TAG CTC TGT
WH339	UCP1 wild type reverse	GAT CTC CAG CTC CTC CTC TGT C