תרבית אדיפוציטים תלת מימדית כמודל לחקר שיפוץ רקמת שומן לבנה המושרה על ידי קאשקסיה

Summary

פרוטוקול זה מתאר מערכת תרבית הדפסה מגנטית תלת מימדית (תלת מימדית) המאפשרת דיסקציה של רקמת שומן לבנה (WAT) המושרה על ידי מדיום מותנה מתאי סרטן. שימוש במערכת תרבית תלת מימדית של אדיפוציטים UCP1+ המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מאפשר לחקור אדיפוציטים בז' התורמים לעיצוב מחדש של רקמת השומן.

Abstract

קאשקסיה של סרטן (CC) מציגה את עצמה כתסמונת בעלת ביטויים מרובים, הגורמת לחוסר איזון מטבולי ניכר בין איברים. לאחרונה הוצע לעורר בזבוז מטמון על ידי מספר מתווכים דלקתיים, שעלולים לשבש את הפיזיולוגיה האינטגרטיבית של רקמות השומן ורקמות אחרות כמו המוח והשרירים. בתרחיש זה, הגידול יכול לשרוד על חשבון המארח. במחקר קליני אחרון, עוצמת הדלדול של מרבצי השומן השונים נמצאה בקורלציה שלילית עם תוצאת ההישרדות של המטופל. מחקרים הראו גם שהפרעות מטבוליות שונות יכולות לשנות את שיפוץ רקמת השומן הלבנה (WAT), במיוחד בשלבים המוקדמים של התפתחות קאשקסיה. תפקוד לקוי של WAT כתוצאה מעיצוב מחדש של רקמות תורם לקאשקסיה הכללית, כאשר השינויים העיקריים ב-WAT מורכבים משינויים מורפו-תפקודיים, ליפוליזה מוגברת של שומן, הצטברות תאים חיסוניים, הפחתת אדיפוגנזה, שינויים באוכלוסיית תאי האב והגדלת "נישות" המכילות תאי בז'/בריט.

כדי לחקור את ההיבטים השונים של שיפוץ WAT המושרה על ידי קאשקסיה, במיוחד השינויים בתאי אב ושיפוץ בז', תרבית דו-ממדית (2D) הייתה האפשרות הראשונה למחקרי מבחנה. עם זאת, גישה זו אינה מסכמת כראוי את מורכבות ה-WAT. מבחנים משופרים לשחזור AT ex vivo תפקודי מסייעים להבנת האינטראקציות הפיזיולוגיות בין אוכלוסיות התאים השונות. פרוטוקול זה מתאר מערכת תרבית רקמה יעילה להדפסה תלת מימדית (תלת מימדית) המבוססת על ננו-חלקיקים מגנטיים. הפרוטוקול מותאם לחקירת שיפוץ WAT המושרה על ידי גורמים המושרים על ידי קאשקסיה (CIFs). התוצאות מראות כי תרבית תלת מימדית היא כלי מתאים לחקר מידול WAT ex vivo ועשויה להיות שימושית עבור מסכים פונקציונליים לזיהוי מולקולות ביו-אקטיביות עבור יישומי אוכלוסיות תאי שומן בודדות ולסייע בגילוי טיפול אנטי-מטמון תאי מבוסס WAT.

Introduction

אורגניזמים חיים מורכבים מתאים במיקרו-סביבות תלת מימדיות עם אינטראקציה בין תא לתא, מטריצת תא ודינמיקת הובלה משוכללת עבור חומרים מזינים ותאים ^1,2. עם זאת, רוב הידע הבסיסי שנצבר בביולוגיה של התא נוצר באמצעות תרבית תאים חד-שכבתית (2D). למרות שתרבית דו-ממדית יכולה לענות על חלק מהשאלות המכאניסטיות, גישה זו אינה מסכמת כראוי את הסביבה הטבעית שבתוכה שוכנים התאים ועשויה להיות לא תואמת לחיזוי תגובה מורכבת לתרופה¹. יתר על כן, תאים חשים את סביבתם הפיזית באמצעות טרנסדוקציה מכנית. ואכן, כוחות מכניים מתורגמים לאותות ביוכימיים המשפיעים בסופו של דבר על דפוסי ביטוי הגנים ועל גורל התא. בעשורים האחרונים, תרבית רקמות תלת מימדית התגלתה ככלי חדש במבחנה שיכול לחקות את המיקרו-סביבה in vivo בנאמנות רבה יותר. זה יכול למנוע כמה מלכודות מכניסטיות שנוצרו על ידי גישות דו-ממדיות במבחנה³.

קאשקסיה של סרטן (CC) מוגדרת כתסמונת בעלת ביטויים מרובים, הגורמת לחוסר איזון מטבולי ניכר בין איברים. במהלך התפתחות הקאשקסיה, WAT עובר שינויים מורפולוגיים רבים וכתוצאה מכך ליפוליזה מוגברת של אדיפוציטים, הצטברות תאים חיסוניים, ירידה באדיפוגנזה, שינויים באוכלוסיית תאי האב ועלייה ב"נישות" המכילות תאי בז'/בריט (שיפוץ בז')⁴. עם זאת, סיכום המנגנון שבאמצעותו קאשקסיה משפיעה על שיפוץ WAT באמצעות מודלים במבחנה מהווה אתגר טכני משמעותי. ואכן, כמה מחקרים שניסו לחקור תקשורת בין גידול לרקמה השתמשו בתרבית תאים חד-שכבתית במבחנה (2D), תוך עקיפת המורכבות של המיקרו-סביבה התלת-ממדית של WAT.

למרות שמספר גישות ניסיוניות מייצרות תרבית תלת מימדית, שלוש שיטות הרכבה שונות עדיפות לייצור אדיפוספרואידים: ריחוף מגנטי או הדפסה⁵, טיפה תלויה⁶ ומערכות פיגום מטריגל⁷. למרות היותן מתאימות לאדיפוספרואידים, למערכות אלו יש יתרונות וחסרונות ויש לבחור אותן בהתאם למאפייני כל עיצוב ניסוי. בהתבסס על המגבלות שהוזכרו לעיל, נעשה שימוש בשיטת ההדפסה המגנטית ליצירת תרביות תאים תלת מימדיות⁵. שיטה זו משתמשת במכלול ננו-חלקיקים מגנטי המורכב מננו-חלקיקי זהב ותחמוצת ברזל, מה שהופך את שיטת ההדפסה למתאימה לרוב סוגי התאים. כאן, תרביות תאים תלת מימדיות שימשו כדי לגרום לאדיפוגנזה, ו-CIFs שימשו לשחזור המצב הסביבתי של CC.

Protocol

1. דגירה של תאים דו-ממדיים עם ננו-חלקיקים מגנטיים

1. גדל תרביות דו-ממדיות דבקות למפגש ~ 70% באמצעות נהלי תרבית תאים סטנדרטיים.
2. הכן את מכלול הננו-חלקיקים המגנטיים. מוציאים אותו מהמקרר ונותנים לו להתחמם לטמפרטורת החדר (20-25 מעלות צלזיוס) למשך כ-15 דקות¹.
3. מדיום מעורב: הוסף את הננו-חלקיקים המגנטיים ישירות ל-12 מ"ל של מדיום בלוחות תרבית תאים של 100 מ"מ. השעו והשעו את המדיום כמה פעמים כדי לקבל התפלגות הומוגנית של הננו-חלקיקים.
   הערה: המדיום ייראה כהה בגלל הצבע החום של תחמוצת הברזל. מומלץ ריכוז של 2.5 מיקרוליטר/ס"מ² משטח הגידול.
4. שטפו את צלחת התרבות הדו-ממדית בגודל 100 מ"מ שלוש פעמים עם מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS).
5. הוסף 12 מ"ל מהמדיום המעורב משלב 1.3 לצלחות תרבית התאים של 100 מ"מ. דגרו את הלוחות למשך הלילה באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂) כדי לאפשר חיבור של ננו-חלקיקים מגנטיים לתאים

2. יצירת תרבויות תלת מימד עם הרכבה כדורית בצלחות של 96 בארות

1. לאחר דגירה של לילה, שטפו את התאים כדי להסיר כל תווך שיורי וננו-חלקיקים מגנטיים לא מחוברים על ידי ערבוב עדין של הצלחות עם 3 x 10 מ"ל PBS.
2. שאפו את ה-PBS מצלחת הפטרי ונתקו את התאים על ידי דגירה עם תמיסת חומצה טטראצטית (EDTA) של 0.25% טריפסין-אתילנדיאמין למשך 2-5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
3. בזמן ההמתנה לניתוק התאים, יש לחטא את הכוננים המגנטיים עם 70% אתנול¹.
4. לאחר ניתוק התאים, הוסף מדיום המכיל סרום בנפח פי 4 מתמיסת הטריפסין-EDTA כדי לנטרל את השפעת הטריפסין, ולאחר מכן העביר את התרחיף לצינור חרוטי.
5. צנטריפוגה המתלה, בטמפרטורה של 500 × גרם למשך 10 דקות. שאפו את הסופרנטנט, הקפד לא לגעת בכדור.
   הערה: לאחר צנטריפוגה, התאים צריכים להיראות חומים, ותרחיף תאים בבינוני צריך להיראות כהה מהרגיל. תאים צריכים להופיע מפולפלים עם הננו-חלקיקים¹.
6. ספור את התאים בתרחיף וחשב את נפח הנפחים הבינוניים הדרושים ליצירת תרביות תלת מימד. עבור אדיפוספרואידים, השתמש ב-5,000 עד 10,000 תאים ב-150 מיקרוליטר בצלחות של 96 בארות.
7. בעזרת ערכת הדפסה ביולוגית של 96 בארות, הנח צלחת דוחה תאים של 96 בארות בחלק העליון של כונן הספרואיד.
8. פיפטה 150 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל באר של צלחת 96 הבארות וסוגר את הצלחת כדי לאפשר לתאים להצטבר בתחתית בצורת מגנט.
9. השאירו את הצלחת על כונן הכדור בחממה למשך 1-2 שעות כדי להניב ספרואיד מוכשר.
   הערה: תרביות אלה צריכות להיראות צפופות וחומות ויש להדפיס אותן בלוח (איור S1). איור S2 מציג זרימת עבודה מסכמת של השלבים העיקריים של הדפסה מגנטית תלת מימדית של מכלול ספרואידים בלוחות של 96 בארות.

3. אינדוקציה אדיפוגנזה לבנה

1. הכנת אמצעי תחזוקה ואינדוקציה⁸; הכן מדיום אינדוקציה לפני כל שימוש.
   1. הכן מצע תחזוקה המכיל 5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין (מלאי 10 מ"ג/מ"ל מאוחסן ב-4 מעלות צלזיוס למשך שבוע אחד) ו-0.5 מיקרומטר רוזיגליטזון (מלאי 10 מ"מ בדימתיל סולפוקסיד (DMSO)).
   2. הכן מדיום אינדוקציה המכיל 125 מיקרומטר אינדומתצין ממלאי 0.125 M באתנול, 2 מיקרוגרם/מ"ל דקסמתזון ממלאי 2 מ"ג/מ"ל באתנול, 0.5 מ"מ איזובוטיל-1-מתילקסנטין (IBMX) ממלאי 0.25 M ב-DMSO, ו-0.5 מיקרומטר רוזיגליטזון ממלאי 10 מ"מ ב-DMSO.
      הערה: מחממים אינדומתצין ל-60 מעלות צלזיוס להמסה.
2. לאחר 24-48 שעות של הדפסת ספרואידים, החלף את המדיום השלם הרגיל במדיום האינדוקציה (יום 0).
3. לאחר 48 שעות (יום 2), החלף את מדיום האינדוקציה במדיום התחזוקה.
4. החלף את המדיום כל 3-5 ימים עד שהתאים מתמיינים במלואם.
   הערה: בדרך כלל, לאחר 7-8 ימים של גירוי עם מדיום האינדוקציה, התאים מתמיינים לתאי שומן בוגרים ומתמלאים בטיפות שמן שניתן לראות בשולי השומן.

4. ייצור מדיום מותנה של קרצינומה של ריאות לואיס (LLC-CM)

1. תאי קרצינומה של ריאות לואיס (LL/2) בלוחות תרבית תאים של 100 מ"מ במדיום גידול בצפיפות של 6000 תאים/ס"מ².
   הערה: מצע הגידול מכיל את מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM) עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-100 U/mL של פניצילין-סטרפטומיצין.
2. לאחר יומיים, החלף את המדיום בכל צלחת במדיום גידול טרי.
   הערה: תאי LL/2 מכילים תערובת הטרוגנית של תאים נצמדים (מספר גבוה יותר) ותאים צפים.
3. לאחר יומיים (יום 4), קצרו את המדיום המותנה, ונקו אותו מתאים ופסולת על ידי צנטריפוגה (500 × גרם, 10 דקות).
4. הקפיא את כמות המדיום המותנה בחנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר.
   הערה: כדי לטפל בספרואידים עם המדיום המותנה, השתמש בשילוב של 75% מדיום גידול טרי ו-25% מדיום מותנה LLC.

תוצאות

אדיפוספרואידים מתרבית תלת מימדית של תאי שבר כלי דם סטרומלי (SVF)
גם תרביות תלת מימד וגם תרביות דו-ממדיות משולבות הוקמו עם אותם מספרים של תאי SVF מאותו תכשיר WAT מפשעתי של עכבר (איור 1A, איור 1B) ועברו אותו פרוטוקול ניס?...

Discussion

פרוטוקול זה מקים מערכת תרבית תאים תלת מימדית לחקר התמיינות אדיפוציטים באדיפוספרואידים שמקורם בתאי SVF ראשוניים מ-WAT. בהשוואה לתרבות דבקות דו-ממדית קונבנציונלית, מערכת תלת מימד זו מאפשרת שיפוץ AT, הדומה מאוד לתנאי in vivo. בשנים האחרונות, מחקרים הראו כי תרבית תאים בתלת מימד מני...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-5879	Cell culture
96-Well Bioprinting Kit, black	Greiner (Monroe, NC, USA)	655841	Cell culture
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-606-152	Immunofluorescence staining, secondary, 1:400 in TBS with 0.1% Tween-20
CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM, µCLEAR, BLACK, CELLSTAR, CELL-REPELLENT SURFACE, LID, STERILE, 8 PCS./BAG	Greiner (Monroe, NC, USA)	655976	Cell culture
Dexamethasone	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D-1756	Cell culture
DMEM	Corning (Manassas, VA, USA)	10-017-CV	Cell culture
Fetal Bovine Serum (Tova)	Gemini Bio (West Sacramento, CA)	100-500	Cell culture
Indomethacin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-7378	Cell culture
Insulin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I0516	Cell culture
LL/2 (LLC1) (ATCC CRL-1642)	American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)	CRL-1642	Lewis Lung Carcinoma cell line
NanoShuttle-PL	Greiner (Monroe, NC, USA)	657843	Cell culture
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	ThermoFisher (Waltham, MA, USA)	R37606	Immunofluorescence staining, following the manufacturer's instructions
Pen strep	Corning (Manassas, VA, USA)	30-002-CI	Cell culture
Perilipin-1 (D1D8) XP Rabbit mAb	Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)	9349	Immunofluorescence staining, primary, 1:1000 in TBS with 0.1% Tween-20
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	R-2408	Cell culture
Trypsin-EDTA, 0.05%	Corning (Manassas, VA, USA)	25-052-CI	Cell culture
Reverse-transcription PCR primers
Primer	Forward	Reverse
Adipoq	GTTCCCAATGTACCCATTCGC	TGTTGCAGTAGAACTTGCCAG
Col4a1	TCCAAGGGCGAAGTGGGTTT	ACCCTTGCTCGCCTTTGACT
Cyclophilin a	ATGGCACTGGCGGCAGGTCC	TTGCCATTCCTGGACCCAAA
Fabp4	TGGTGACAAGCTGGTGGTGGAATG	TCCAGGCCTCTTCCTTTGGCTCA
Fn1	GCTTCCCCAACTGGTTACCCT	GGGTTGGTGATGAAGGGGGT
Pgc1a	GAAAACAGGAACAGCAGCAGAG	GGGGTCAGAGGAAGAGATAAAG
Ucp1	TCCTAGGGACCATCACCACCC	AGCCGGCTGAGATCTTGTTTCC
Mouse genotyping
Primer name	Description	Sequence
Cre F	Generic Cre forward	GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC
Cre R	Generic Cre reverse	GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT
oIMR7318	mT/mG forward	CTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT
oIMR7319	mT/mG wild type reverse	CGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA
oIMR7320	mT/mG mutant reverse	TCA ATG GGC GGG GGT CGT T
WH336	UCP1 mutant forward	CAA TCT GGG CTT AAC GGG TCC TC
WH337	UCP1 mutant reverse	GTT GCA TCG ACC GGT TAA TGC AG
WH338	UCP1 wild type forward	GGT CAG CCT AAT TAG CTC TGT
WH339	UCP1 wild type reverse	GAT CTC CAG CTC CTC CTC TGT C