Kaşeksi ile İndüklenen Beyaz Yağ Dokusu Yeniden Şekillenmesini İncelemek İçin Bir Model Olarak Üç Boyutlu Adiposit Kültürü

Özet

Bu protokol, kanser hücrelerinden şartlandırılmış bir ortam tarafından indüklenen beyaz yağ dokusu (WAT) yeniden şekillenmesinin diseksiyonuna izin veren üç boyutlu (3D) bir manyetik baskı kültürü sistemini tanımlar. Yeşil bir floresan proteini (GFP) eksprese eden UCP1 + adipositlerinin 3D kültür sisteminin kullanılması, yağ dokusunun yeniden şekillenmesine katkıda bulunan bej adipositlerin incelenmesine izin verir.

Özet

Kanser kaşeksisi (CC), belirgin bir çoklu organ metabolik dengesizliğine neden olan çoklu belirtileri olan bir sendrom olarak kendini gösterir. Son zamanlarda, kaşektik israfın, yağ dokularının ve beyin ve kas gibi diğer dokuların bütünleştirici fizyolojisini bozabilecek çeşitli enflamatuar mediatörler tarafından uyarıldığı öne sürülmüştür. Bu senaryoda, tümör konakçının pahasına hayatta kalabilir. Son klinik araştırmalarda, farklı yağ birikintilerinin tükenme yoğunluğu, hastanın sağkalım sonucu ile negatif olarak ilişkilendirilmiştir. Çalışmalar ayrıca, çeşitli metabolik bozuklukların, özellikle kaşeksi gelişiminin erken aşamalarında, beyaz yağ dokusunun (WAT) yeniden şekillenmesini değiştirebileceğini göstermiştir. Doku yeniden şekillenmesinden kaynaklanan WAT disfonksiyonu, morfo-fonksiyonel değişiklikler, artmış adiposit lipolizi, bağışıklık hücrelerinin birikimi, adipogenezin azalması, progenitör hücre popülasyonundaki değişiklikler ve bej / brite hücreleri içeren "nişlerin" artışından oluşan WAT'taki ana modifikasyonlar ile genel kaşeksiye katkıda bulunur.

Kaşeksi kaynaklı WAT yeniden şekillenmesinin çeşitli yönlerini, özellikle progenitör hücrelerdeki değişiklikleri ve bej yeniden şekillenmeyi incelemek için, iki boyutlu (2D) kültür, in vitro çalışmalar için ilk seçenek olmuştur. Ancak, bu yaklaşım WAT karmaşıklığını yeterince özetlememektedir. Fonksiyonel AT ex vivo'nun rekonstrüksiyonu için geliştirilmiş tahliller, farklı hücre popülasyonları arasındaki fizyolojik etkileşimlerin anlaşılmasına yardımcı olur. Bu protokol, manyetik nanopartiküllere dayalı verimli bir üç boyutlu (3D) baskı doku kültürü sistemini tanımlar. Protokol, kaşeksi kaynaklı faktörler (CIF'ler) tarafından indüklenen WAT yeniden modellemesini araştırmak için optimize edilmiştir. Sonuçlar, bir 3D kültürün, ex vivo WAT modellemesini incelemek için uygun bir araç olduğunu ve bireysel adipoz hücre popülasyonları uygulamaları için biyoaktif molekülleri tanımlamak ve WAT bazlı hücre antikaşik tedavisinin keşfine yardımcı olmak için fonksiyonel ekranlar için yararlı olabileceğini göstermektedir.

Giriş

Canlı organizmalar, hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimi ve besinler ve hücreler için ayrıntılı taşıma dinamikleri ile 3 boyutlu mikro ortamlardaki hücrelerden oluşur ^1,2. Bununla birlikte, hücre biyolojisinde kazanılan temel bilgilerin çoğu, tek katmanlı hücre kültürü (2D) kullanılarak üretilmiştir. Her ne kadar 2D kültür bazı mekanik sorulara cevap verebilse de, bu yaklaşım hücrelerin içinde bulunduğu doğal ortamı yetersiz bir şekilde özetlemekte ve karmaşık bir ilaç tepkisini tahmin etmekle uyumsuz olabilmektedir¹. Dahası, hücreler mekanotransdüksiyon yoluyla fiziksel çevrelerini algılarlar. Gerçekten de, mekanik kuvvetler, nihayetinde gen ekspresyon modellerini ve hücrenin kaderini etkileyen biyokimyasal sinyallere çevrilir. Son birkaç on yılda, 3D doku kültürü, in vivo mikro çevreyi daha büyük bir doğrulukla taklit edebilen yeni bir in vitro araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu, in vitro 2D yaklaşımlar³ tarafından üretilen bazı mekanik tuzakları önleyebilir.

Kanser kaşeksisi (CC), belirgin bir çoklu organ metabolik dengesizliğine neden olan, çoklu belirtileri olan bir sendrom olarak tanımlanır. Kaşeksi gelişimi sırasında, WAT, adiposit lipolizinin artmasına, bağışıklık hücrelerinin birikmesine, adipogenezde azalmaya, progenitör hücre popülasyonu değişikliklerine ve bej / brite hücreleri içeren "nişlerde" bir artışa (bej yeniden şekillenme) neden olan çok sayıda morfolojik değişikliğe ^uğrar4. Bununla birlikte, kaşeksi'nin in vitro modeller kullanılarak WAT yeniden şekillenmesini etkilediği mekanizmanın özetlenmesi önemli bir teknik zorluk teşkil etmektedir. Gerçekten de, tümör / doku iletişimini araştırmaya çalışan birkaç çalışma, WAT'ın 3B mikro ortamının karmaşıklığını atlatarak, in vitro hücre kültüründe (2D) tek katmanlı kullanmıştır.

Birkaç deneysel yaklaşım 3D kültür oluştursa da, adiposferoidleri üretmek için üç farklı montaj yöntemi tercih edilir: manyetik levitasyon veya baskı⁵, asılı damla⁶ ve Matrigel-iskele sistemleri⁷. Adiposferoidler için uygun olmalarına rağmen, bu sistemlerin avantajları ve dezavantajları vardır ve her deney tasarımının özelliklerine göre seçilmelidir. Yukarıda belirtilen sınırlamalara dayanarak, 3D hücre kültürleri oluşturmak için manyetik baskı yöntemi kullanıldı⁵. Bu yöntem, altın nanopartiküller ve demir oksitten oluşan bir manyetik nanopartikül düzeneği kullanır ve bu da baskı yöntemini çoğu hücre tipi için uygun hale getirir. Burada, adipogenezi indüklemek için 3D hücre kültürleri kullanıldı ve CC'nin çevresel durumunu yeniden üretmek için CIF'ler kullanıldı.

Protokol

1. 2D hücrelerin manyetik nanopartiküllerle inkübasyonu

1. Standart hücre kültürü prosedürlerini kullanarak yapışkan 2D kültürleri ~% 70 birleşmeye kadar büyütün.
2. Manyetik nanoparçacık düzeneğini hazırlayın. Buzdolabından çıkarın ve oda sıcaklığına (20-25 °C) yaklaşık 15 dakika^{ısınmaya bırakın 1}.
3. Karışık ortam: Manyetik nanopartikülleri doğrudan 100 mm'lik hücre kültürü plakalarında 12 mL ortama ekleyin. Nanopartiküllerin homojen bir dağılımını elde etmek için ortamı birkaç kez askıya alın ve yeniden süspanse edin.
   NOT: Demir oksidin kahverengi rengi nedeniyle ortam koyu görünecektir. Kültür alanının 2,5 μL/^cm2'lik bir konsantrasyonu önerilir.
4. 100 mm 2D kültür plakasını fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile üç kez yıkayın.
5. Adım 1.3'ten 100 mm'lik hücre kültürü plakalarına 12 mL karışık ortam ekleyin. Manyetik nanopartiküllerin hücrelere bağlanmasına izin vermek için plakaları gece boyunca bir inkübatörde (37 ° C,% 5 CO₂) inkübe edin

2. 96 oyuklu plakalarda küresel montaj ile 3D kültürler oluşturma

1. Gece boyunca inkübasyondan sonra, plakaları 3 x 10 mL PBS ile hafifçe çalkalayarak artık ortamı ve bağlanmamış manyetik nanopartikülleri çıkarmak için hücreleri yıkayın.
2. PBS'yi Petri kabından aspire edin ve hücreleri% 0.25 tripsin-etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) çözeltisi ile 37 ° C'de 2-5 dakika inkübe ederek ayırın.
3. Hücrelerin ayrılmasını beklerken, manyetik sürücüleri %70 etanol¹ ile dezenfekte edin.
4. Hücreler ayrıldıktan sonra, tripsinin etkisini nötralize etmek için tripsin-EDTA çözeltisinin hacminin 4 katı kadar serum içeren ortam ekleyin ve ardından süspansiyonu konik bir tüpe aktarın.
5. Süspansiyonu 500 × g'da 10 dakika santrifüjleyin. Peletlere dokunmamaya dikkat ederek süpernatanı aspire edin.
   NOT: Santrifüjlemeden sonra hücreler kahverengi görünmeli ve ortamdaki hücre süspansiyonları normalden daha koyu görünmelidir. Hücreler nanopartiküller¹ ile biberli görünmelidir.
6. Süspansiyondaki hücreleri sayın ve 3D kültürler oluşturmak için gereken orta hacimlerin hacmini hesaplayın. Adiposferoidler için, 96 oyuklu plakalarda 150 μL'de 5.000 ila 10.000 hücre kullanın.
7. 96 oyuklu bir biyo-baskı kiti kullanarak, Spheroid Drive'ın üst kısmına hücre itici 96 oyuklu bir plaka yerleştirin.
8. 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 150 μL hücre süspansiyonu pipetleyin ve hücrelerin altta bir mıknatıs şeklinde toplanmasını sağlamak için plakayı kapatın.
9. Yetkin bir sferoid elde etmek için plakayı inkübatördeki küresel sürücü üzerinde 1-2 saat bırakın.
   NOT: Bu kültürler yoğun ve kahverengi görünmeli ve plakaya basılmalıdır (Şekil S1). Şekil S2 , 96 oyuklu plakalarda küresel montajın 3D manyetik baskısının ana adımlarının bir özet iş akışını sunar.

3. Beyaz adipogenez indüksiyonu

1. Bakım ve indüksiyon ortamını hazırlayın⁸; Her kullanımdan önce indüksiyon ortamını hazırlayın.
   1. 5 μg/mL insülin (bir hafta boyunca 4 ° C'de saklanan 10 mg / mL stok) ve 0.5 μM rosiglitazon (dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 10 mM stok) içeren bakım ortamı hazırlayın.
   2. Etanolde 0.125 M stoktan 125 μM indometazin, etanolde 2 mg / mL stoktan 2 μg / mL deksametazon, DMSO'da 0.25 M stoktan 0.5 mM izobutil-1-metilksantin (IBMX) ve DMSO'da 10 mM'lik bir stoktan 0.5 μM rosiglitazon içeren indüksiyon ortamı hazırlayın.
      NOT: Çözünmesi için indometasini 60 ° C'ye ısıtın.
2. 24-48 saat sferoid baskısından sonra, normal tam ortamı indüksiyon ortamıyla değiştirin (gün 0).
3. 48 saat sonra (2. gün), indüksiyon ortamını bakım ortamıyla değiştirin.
4. Hücreler tamamen farklılaşana kadar ortamı her 3-5 günde bir değiştirin.
   NOT: Genel olarak, indüksiyon ortamı ile 7-8 günlük stimülasyondan sonra, hücreler olgun yağ hücrelerine farklılaşır ve adiposferoidlerin kenarlarında görülebilen yağ damlacıkları ile doldurulur.

4. Lewis akciğer karsinomu şartlandırılmış besiyeri (LLC-CM) üretimi

1. 6000 hücre/^cm2 yoğunluğunda büyüme ortamında 100 mm hücre kültürü plakalarında Lewis akciğer karsinomu (LL/2) hücrelerini tohumlayın.
   NOT: Büyüme ortamı, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve 100 U/mL penisilin-streptomisin içeren Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamını (DMEM) içerir.
2. 2 gün sonra, her plakadaki ortamı taze büyüme ortamı ile değiştirin.
   NOT: LL / 2 hücreleri, yapışkan (daha yüksek sayıda) ve yüzen hücrelerin heterojen bir karışımını içerir.
3. 2 gün sonra (4. gün), şartlandırılmış ortamı hasat edin ve santrifüjleme (500 × g, 10 dakika) ile hücrelerden ve kalıntılardan arındırın.
4. Şartlandırılmış ortamın alikotlarını daha sonra kullanmak üzere sıvı nitrojen içinde dondurun.
   NOT: Sferoidleri şartlandırılmış ortamla tedavi etmek için,% 75 taze büyüme ortamı% 25 LLC şartlandırılmış ortamın bir kombinasyonunu kullanın.

Sonuçlar

Stromal vasküler fraksiyon (SVF) hücrelerinin 3D kültüründen adiposferoidler
Hem 3D hem de birleşik 2D kültürler, aynı fare inguinal WAT preparatından (Şekil 1A, Şekil 1B) aynı sayıda SVF hücresi ile kuruldu ve gen ekspresyon markörünü karşılaştırmak için aynı deneysel protokole tabi tutuldu. İndüksiyon ortamı ile uyarılan sferoidler zamanla genişl...

Tartışmalar

Bu protokol, WAT'tan birincil SVF hücrelerinden türetilen adiposferoidlerde adiposit farklılaşmasını incelemek için bir 3D hücre kültürü sistemi kurar. Konvansiyonel 2D yapışık kültürle karşılaştırıldığında, bu 3D sistem, in vivo koşullara çok benzeyen AT yeniden modellemesini kolaylaştırır. Son birkaç yılda, çalışmalar, hücrelerin 3 boyutlu olarak kültürlenmesinin, 2 boyutlu bir kültür sistemine kıyasla farklı hücresel morfoloji ve sinyalleşme ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-5879	Cell culture
96-Well Bioprinting Kit, black	Greiner (Monroe, NC, USA)	655841	Cell culture
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-606-152	Immunofluorescence staining, secondary, 1:400 in TBS with 0.1% Tween-20
CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM, µCLEAR, BLACK, CELLSTAR, CELL-REPELLENT SURFACE, LID, STERILE, 8 PCS./BAG	Greiner (Monroe, NC, USA)	655976	Cell culture
Dexamethasone	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D-1756	Cell culture
DMEM	Corning (Manassas, VA, USA)	10-017-CV	Cell culture
Fetal Bovine Serum (Tova)	Gemini Bio (West Sacramento, CA)	100-500	Cell culture
Indomethacin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-7378	Cell culture
Insulin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I0516	Cell culture
LL/2 (LLC1) (ATCC CRL-1642)	American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)	CRL-1642	Lewis Lung Carcinoma cell line
NanoShuttle-PL	Greiner (Monroe, NC, USA)	657843	Cell culture
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	ThermoFisher (Waltham, MA, USA)	R37606	Immunofluorescence staining, following the manufacturer's instructions
Pen strep	Corning (Manassas, VA, USA)	30-002-CI	Cell culture
Perilipin-1 (D1D8) XP Rabbit mAb	Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)	9349	Immunofluorescence staining, primary, 1:1000 in TBS with 0.1% Tween-20
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	R-2408	Cell culture
Trypsin-EDTA, 0.05%	Corning (Manassas, VA, USA)	25-052-CI	Cell culture
Reverse-transcription PCR primers
Primer	Forward	Reverse
Adipoq	GTTCCCAATGTACCCATTCGC	TGTTGCAGTAGAACTTGCCAG
Col4a1	TCCAAGGGCGAAGTGGGTTT	ACCCTTGCTCGCCTTTGACT
Cyclophilin a	ATGGCACTGGCGGCAGGTCC	TTGCCATTCCTGGACCCAAA
Fabp4	TGGTGACAAGCTGGTGGTGGAATG	TCCAGGCCTCTTCCTTTGGCTCA
Fn1	GCTTCCCCAACTGGTTACCCT	GGGTTGGTGATGAAGGGGGT
Pgc1a	GAAAACAGGAACAGCAGCAGAG	GGGGTCAGAGGAAGAGATAAAG
Ucp1	TCCTAGGGACCATCACCACCC	AGCCGGCTGAGATCTTGTTTCC
Mouse genotyping
Primer name	Description	Sequence
Cre F	Generic Cre forward	GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC
Cre R	Generic Cre reverse	GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT
oIMR7318	mT/mG forward	CTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT
oIMR7319	mT/mG wild type reverse	CGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA
oIMR7320	mT/mG mutant reverse	TCA ATG GGC GGG GGT CGT T
WH336	UCP1 mutant forward	CAA TCT GGG CTT AAC GGG TCC TC
WH337	UCP1 mutant reverse	GTT GCA TCG ACC GGT TAA TGC AG
WH338	UCP1 wild type forward	GGT CAG CCT AAT TAG CTC TGT
WH339	UCP1 wild type reverse	GAT CTC CAG CTC CTC CTC TGT C