Dreidimensionale Adipozytenkultur als Modell zur Untersuchung des Kachexie-induzierten Umbaus von weißem Fettgewebe

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein dreidimensionales (3D) magnetisches Druckkultursystem, das die Dissektion des Umbaus von weißem Fettgewebe (WAT) ermöglicht, das durch ein konditioniertes Medium aus Krebszellen induziert wird. Die Verwendung eines 3D-Kultursystems von UCP1+-Adipozyten, die ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimieren, ermöglicht die Untersuchung von beigen Adipozyten, die zum Umbau des Fettgewebes beitragen.

Zusammenfassung

Die Kachexie bei Krebs (CC) präsentiert sich als ein Syndrom mit mehreren Manifestationen, das ein ausgeprägtes metabolisches Ungleichgewicht in mehreren Organen verursacht. Kürzlich wurde vorgeschlagen, dass die kachektische Auszehrung durch mehrere Entzündungsmediatoren stimuliert wird, die die integrative Physiologie von Fettgeweben und anderen Geweben wie Gehirn und Muskeln stören können. In diesem Szenario kann der Tumor auf Kosten des Wirts überleben. In neueren klinischen Forschungen wurde die Intensität der Erschöpfung der verschiedenen Fettdepots negativ mit dem Überlebensergebnis des Patienten korreliert. Studien haben auch gezeigt, dass verschiedene Stoffwechselstörungen den Umbau des weißen Fettgewebes (WAT) verändern können, insbesondere in den frühen Stadien der Kachexieentwicklung. Die WAT-Dysfunktion, die aus dem Gewebeumbau resultiert, trägt zur allgemeinen Kachexie bei, wobei die Hauptmodifikationen bei WAT aus morphofunktionellen Veränderungen, erhöhter Adipozyten-Lipolyse, Akkumulation von Immunzellen, Verringerung der Adipogenese, Veränderungen in der Vorläuferzellpopulation und der Zunahme von "Nischen" bestehen, die Beige/Brite-Zellen enthalten.

Um die verschiedenen Facetten des Kachexie-induzierten WAT-Umbaus, insbesondere die Veränderungen der Vorläuferzellen und des beigen Umbaus, zu untersuchen, war die zweidimensionale (2D) Kultur die erste Option für in vitro-Studien. Dieser Ansatz fasst die WAT-Komplexität jedoch nicht angemessen zusammen. Verbesserte Assays für die Rekonstruktion von funktionellem AT ex vivo helfen dabei, die physiologischen Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Zellpopulationen zu verstehen. Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes dreidimensionales (3D) Druck-Gewebekultursystem auf Basis magnetischer Nanopartikel. Das Protokoll ist optimiert für die Untersuchung von WAT-Remodeling, das durch Kachexie-induzierte Faktoren (CIFs) induziert wird. Die Ergebnisse zeigen, dass eine 3D-Kultur ein geeignetes Werkzeug für die Untersuchung der WAT-Modellierung ex vivo ist und für funktionelle Screens nützlich sein kann, um bioaktive Moleküle für einzelne Fettzellpopulationen zu identifizieren und die Entdeckung einer WAT-basierten zellantikachektischen Therapie zu unterstützen.

Einleitung

Lebende Organismen bestehen aus Zellen in 3D-Mikroumgebungen mit Zell-Zell- und Zell-Matrix-Wechselwirkungen und einer ausgeklügelten Transportdynamik für Nährstoffe und Zellen ^1,2. Die meisten grundlegenden Erkenntnisse in der Zellbiologie wurden jedoch mit Hilfe von Monolayer-Zellkulturen (2D) gewonnen. Obwohl die 2D-Kultur einige der mechanistischen Fragen beantworten kann, rekapituliert dieser Ansatz die natürliche Umgebung, in der sich die Zellen befinden, unzureichend und ist möglicherweise nicht mit der Vorhersage einer komplexen Arzneimittelreaktion vereinbar¹. Darüber hinaus nehmen Zellen ihre physische Umgebung durch Mechanotransduktion wahr. Tatsächlich werden mechanische Kräfte in biochemische Signale übersetzt, die letztlich die Expressionsmuster der Gene und das Schicksal der Zelle beeinflussen. In den letzten Jahrzehnten hat sich die 3D-Gewebekultur zu einem neuen In-vitro-Werkzeug entwickelt, das die In-vivo-Mikroumgebung mit größerer Genauigkeit nachahmen kann. Dadurch können einige mechanistische Fallstricke vermieden werden, die durch in vitro 2D-Ansätze erzeugt^{werden 3}.

Die Kachexie bei Krebs (CC) ist definiert als ein Syndrom mit mehreren Manifestationen, das ein ausgeprägtes metabolisches Ungleichgewicht in mehreren Organen verursacht. Während der Kachexieentwicklung erfährt WAT zahlreiche morphologische Veränderungen, die zu einer erhöhten Adipozyten-Lipolyse, einer Akkumulation von Immunzellen, einer Verringerung der Adipogenese, Veränderungen der Vorläuferzellpopulation und einer Zunahme von "Nischen" mit Beige/Brite-Zellen führen (beige Remodeling)⁴. Die Rekapitulation des Mechanismus, durch den Kachexie das WAT-Remodeling mit Hilfe von In-vitro-Modellen beeinflusst, stellt jedoch eine erhebliche technische Herausforderung dar. In der Tat haben einige Studien, die versuchten, die Tumor-Gewebe-Kommunikation zu untersuchen, Monolayer-In-vitro-Zellkulturen (2D) verwendet, um die Komplexität der 3D-Mikroumgebung von WAT zu umgehen.

Obwohl mehrere experimentelle Ansätze eine 3D-Kultur erzeugen, werden drei verschiedene Assemblierungsmethoden zur Herstellung von Adipospheroiden bevorzugt: Magnetschwebetechnik oder Drucken⁵, hängender Tropfen⁶ und Matrigel-Gerüstsysteme⁷. Obwohl diese Systeme für Adipospheroide geeignet sind, haben sie Vor- und Nachteile und sollten entsprechend den Eigenschaften des jeweiligen Versuchsdesigns ausgewählt werden. Aufgrund der oben genannten Einschränkungen wurde das magnetische Druckverfahren zur Erzeugung von 3D-Zellkulturen verwendet⁵. Bei diesem Verfahren wird eine magnetische Nanopartikelanordnung verwendet, die aus Goldnanopartikeln und Eisenoxid besteht, wodurch das Druckverfahren für die meisten Zelltypen geeignet ist. Hier wurden 3D-Zellkulturen verwendet, um die Adipogenese zu induzieren, und CIFs wurden verwendet, um die Umweltbedingungen von CC zu reproduzieren.

Protokoll

1. Inkubation von 2D-Zellen mit magnetischen Nanopartikeln

1. Züchten Sie adhärente 2D-Kulturen auf ~ 70 % Konfluenz mit Standard-Zellkulturverfahren.
2. Bereiten Sie die magnetische Nanopartikelanordnung vor. Aus dem Kühlschrank nehmen und ca. 15 min auf Raumtemperatur (20-25 °C) erwärmen lassen¹.
3. Mischmedium: Geben Sie die magnetischen Nanopartikel direkt in 12 mL Medium in 100 mm Zellkulturplatten. Suspendieren Sie das Medium einige Male und resuspendieren Sie es, um eine homogene Verteilung der Nanopartikel zu erhalten.
   HINWEIS: Das Medium erscheint aufgrund der braunen Farbe des Eisenoxids dunkel. Es wird eine Konzentration von 2,5 μL/^cm2 der Kulturfläche empfohlen.
4. Waschen Sie die 100 mm 2D-Kulturplatte dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
5. 12 ml des Mischmediums aus Schritt 1.3 werden auf die 100-mm-Zellkulturplatten gegeben. Inkubieren Sie die Platten über Nacht in einem Inkubator (37 °C, 5 % CO₂), um die Anheftung der magnetischen Nanopartikel an die Zellen zu ermöglichen

2. Erstellung von 3D-Kulturen mit Sphäroid-Assemblierung in 96-Well-Platten

1. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation über Nacht, um alle Medienreste und nicht gebundenen magnetischen Nanopartikel zu entfernen, indem Sie die Platten vorsichtig mit 3 x 10 mL PBS umrühren.
2. Das PBS wird aus der Petrischale aspiriert und die Zellen durch Inkubation mit 0,25 % Trypsin-Ethylendiamin-Tetraessigsäure (EDTA)-Lösung für 2-5 min bei 37 °C abgelöst.
3. Während Sie darauf warten, dass sich die Zellen lösen, desinfizieren Sie die Magnetantriebe mit 70 % Ethanol¹.
4. Nachdem sich die Zellen abgelöst haben, fügen Sie serumhaltiges Medium mit dem 4-fachen Volumen der Trypsin-EDTA-Lösung hinzu, um die Wirkung von Trypsin zu neutralisieren, und überführen Sie die Suspension dann in ein konisches Röhrchen.
5. Die Suspension wird bei 500 × g 10 Minuten lang zentrifugiert. Saugen Sie den Überstand an und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu berühren.
   HINWEIS: Nach der Zentrifugation sollten die Zellen braun erscheinen, und Zellsuspensionen in Medium sollten dunkler als üblich erscheinen. Die Zellen sollten mit den Nanopartikeln gespickt erscheinen¹.
6. Zählen Sie die Zellen in Suspension und berechnen Sie das Volumen der mittleren Volumina, die für die Erstellung von 3D-Kulturen benötigt werden. Verwenden Sie für Adipospheroide 5.000 bis 10.000 Zellen in 150 μl in 96-Well-Platten.
7. Platzieren Sie mit einem 96-Well-Bioprinting-Kit eine zellabweisende 96-Well-Platte an der Oberseite des Spheroid Drive.
8. Pipettieren Sie 150 μl Zellsuspension in jede Vertiefung der 96-Well-Platte und schließen Sie die Platte, damit sich die Zellen am Boden in Form eines Magneten zusammenballen können.
9. Lassen Sie die Platte auf dem Sphäroidantrieb 1-2 h im Inkubator, um ein kompetentes Sphäroid zu erhalten.
   HINWEIS: Diese Kulturen sollten dicht und braun erscheinen und auf der Platte aufgedruckt sein (Abbildung S1). Abbildung S2 zeigt einen zusammenfassenden Arbeitsablauf der wichtigsten Schritte des 3D-Magnetdrucks der Sphäroid-Assemblierung in 96-Well-Platten.

3. Induktion der weißen Adipogenese

1. Vorbereitung von Wartungs- und Induktionsmedien⁸; Bereiten Sie vor jedem Gebrauch das Induktionsmedium vor.
   1. Bereiten Sie ein Erhaltungsmedium vor, das 5 μg/ml Insulin (10 mg/ml Stamm, der eine Woche lang bei 4 °C gelagert wird) und 0,5 μM Rosiglitazon (10 μM Stamm in Dimethylsulfoxid (DMSO)) enthält.
   2. Bereiten Sie ein Induktionsmedium her, das 125 μM Indomethacin aus einem Stamm von 0,125 M in Ethanol, 2 μg/ml Dexamethason aus einem Stamm von 2 mg/ml in Ethanol, 0,5 mM Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) aus einem Stamm von 0,25 M in DMSO und 0,5 μM Rosiglitazon aus einem Stamm von 10 mM in DMSO enthält.
      HINWEIS: Indomethacin auf 60 °C erhitzen, damit es sich auflöst.
2. Ersetzen Sie nach 24-48 Stunden des Sphäroiddrucks das reguläre vollständige Medium durch das Induktionsmedium (Tag 0).
3. Ersetzen Sie nach 48 h (Tag 2) das Induktionsmedium durch das Erhaltungsmedium.
4. Wechseln Sie das Medium alle 3-5 Tage, bis die Zellen vollständig differenziert sind.
   HINWEIS: Im Allgemeinen differenzieren sich die Zellen nach 7-8 Tagen Stimulation mit dem Induktionsmedium in reife Fettzellen und sind mit Öltröpfchen gefüllt, die an den Rändern der Adipospheroide zu sehen sind.

4. Herstellung von konditioniertem Medium für das Lewis-Lungenkarzinom ( LLC-CM )

1. Lewis-Lungenkarzinomzellen (LL/2) in 100 mm Zellkulturplatten in Wachstumsmedium mit einer Dichte von 6000 Zellen/^cm2 aussäen.
   HINWEIS: Das Wachstumsmedium enthält Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 100 U/ml Penicillin-Streptomycin.
2. Ersetzen Sie nach 2 Tagen das Medium in jeder Platte durch frisches Wachstumsmedium.
   HINWEIS: LL/2-Zellen enthalten eine heterogene Mischung aus adhärenten (höhere Anzahl) und schwebenden Zellen.
3. Nach 2 Tagen (Tag 4) ernten Sie das konditionierte Medium und befreien Sie es durch Zentrifugation (500 × g, 10 min) von Zellen und Ablagerungen.
4. Die Aliquote des konditionierten Mediums werden für die spätere Verwendung in flüssigem Stickstoff eingefroren.
   HINWEIS: Um Sphäroide mit dem konditionierten Medium zu behandeln, verwenden Sie eine Kombination aus 75 % frischem Wachstumsmedium und 25 % LLC-konditioniertem Medium.

Ergebnisse

Adipospheroide aus 3D-Kultur von Zellen der stromalen Gefäßfraktion (SVF)
Sowohl 3D- als auch konfluente 2D-Kulturen wurden mit der gleichen Anzahl von SVF-Zellen aus demselben hautnahen WAT-Präparat der Maus (Abbildung 1A, Abbildung 1B) eingerichtet und dem gleichen experimentellen Protokoll unterzogen, um die Genexpressionsmarker zu vergleichen. Sphäroide, die mit Indukt...

Diskussion

Dieses Protokoll richtet ein 3D-Zellkultursystem ein, um die Adipozytendifferenzierung in Adipospheroiden zu untersuchen, die aus primären SVF-Zellen aus WAT gewonnen werden. Im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Adhärentkulturen ermöglicht dieses 3D-System das AT-Remodeling, das den In-vivo-Bedingungen sehr ähnlich ist. In den letzten Jahren haben Studien gezeigt, dass die Kultivierung von Zellen in 3D im Vergleich zu einem 2D-Kultursystem eine unterschiedliche zelluläre Morphologie un...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-5879	Cell culture
96-Well Bioprinting Kit, black	Greiner (Monroe, NC, USA)	655841	Cell culture
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-606-152	Immunofluorescence staining, secondary, 1:400 in TBS with 0.1% Tween-20
CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM, µCLEAR, BLACK, CELLSTAR, CELL-REPELLENT SURFACE, LID, STERILE, 8 PCS./BAG	Greiner (Monroe, NC, USA)	655976	Cell culture
Dexamethasone	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D-1756	Cell culture
DMEM	Corning (Manassas, VA, USA)	10-017-CV	Cell culture
Fetal Bovine Serum (Tova)	Gemini Bio (West Sacramento, CA)	100-500	Cell culture
Indomethacin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-7378	Cell culture
Insulin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I0516	Cell culture
LL/2 (LLC1) (ATCC CRL-1642)	American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)	CRL-1642	Lewis Lung Carcinoma cell line
NanoShuttle-PL	Greiner (Monroe, NC, USA)	657843	Cell culture
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	ThermoFisher (Waltham, MA, USA)	R37606	Immunofluorescence staining, following the manufacturer's instructions
Pen strep	Corning (Manassas, VA, USA)	30-002-CI	Cell culture
Perilipin-1 (D1D8) XP Rabbit mAb	Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)	9349	Immunofluorescence staining, primary, 1:1000 in TBS with 0.1% Tween-20
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	R-2408	Cell culture
Trypsin-EDTA, 0.05%	Corning (Manassas, VA, USA)	25-052-CI	Cell culture
Reverse-transcription PCR primers
Primer	Forward	Reverse
Adipoq	GTTCCCAATGTACCCATTCGC	TGTTGCAGTAGAACTTGCCAG
Col4a1	TCCAAGGGCGAAGTGGGTTT	ACCCTTGCTCGCCTTTGACT
Cyclophilin a	ATGGCACTGGCGGCAGGTCC	TTGCCATTCCTGGACCCAAA
Fabp4	TGGTGACAAGCTGGTGGTGGAATG	TCCAGGCCTCTTCCTTTGGCTCA
Fn1	GCTTCCCCAACTGGTTACCCT	GGGTTGGTGATGAAGGGGGT
Pgc1a	GAAAACAGGAACAGCAGCAGAG	GGGGTCAGAGGAAGAGATAAAG
Ucp1	TCCTAGGGACCATCACCACCC	AGCCGGCTGAGATCTTGTTTCC
Mouse genotyping
Primer name	Description	Sequence
Cre F	Generic Cre forward	GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC
Cre R	Generic Cre reverse	GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT
oIMR7318	mT/mG forward	CTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT
oIMR7319	mT/mG wild type reverse	CGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA
oIMR7320	mT/mG mutant reverse	TCA ATG GGC GGG GGT CGT T
WH336	UCP1 mutant forward	CAA TCT GGG CTT AAC GGG TCC TC
WH337	UCP1 mutant reverse	GTT GCA TCG ACC GGT TAA TGC AG
WH338	UCP1 wild type forward	GGT CAG CCT AAT TAG CTC TGT
WH339	UCP1 wild type reverse	GAT CTC CAG CTC CTC CTC TGT C